黃綠卷毛菇菌絲體長勢與顯微結構的相關性

王 寶，謝占玲 ，戴大日，毛玉晶，王曉芳，鄭秀娟

(青海大學生態環境工程學院，青海 西寧 810016)

黃綠卷毛菇(Floccularialuteovirens)隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)、傘菌科(Agaricaceae)、卷毛菇屬(Floccularia)，是一種在青藏高原獨特的地理環境和氣候條件下孕育而生的優良藥用和食用真菌[1]，又被稱為黃蘑菇、黃環菇[2]。

食用菌菌絲的顯微結構通常包括菌絲寬度和是否存在鎖狀聯合及有無橫隔等，菌絲在不同培養條件下，其長勢、色澤等菌落形態特征存在一定差別，同時顯微結構也會發生細微變化[3]。陳少珍等[4]以野生黃傘純培養菌絲為試驗材料研究發現，結實菌株的菌絲是具有鎖狀聯合的雙核菌絲，而非結實菌株的菌絲較細，生長較慢，成熟時不產生色素，菌絲顏色為白色或淺黃色；張琦等[5]研究發現，干巴菌菌絲分枝較多，有膈膜，無鎖狀聯合，未觀察到無性孢子；熊杰等[6]對茯苓菌株進行顯微結構觀察發現，茯苓菌絲為少分枝、有隔膜、無鎖狀聯合的多核菌絲。趙桂云等[7]通過對14種食用菌菌絲形態的觀察發現，滑菇等12種食用菌的菌絲有鎖狀聯合，蛹蟲草等2種食用菌有分生孢子。

目前，對于真菌菌絲顯微結構進行觀察的相關文獻較多，但對顯微結構與真菌菌絲體長勢的研究則較少。為研究黃綠卷毛菇是否可以通過形成雙核菌絲進行有性生殖以及黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯合數量之間的關系，本文以8個黃綠卷毛菇菌株為研究對象，通過對其菌絲體進行顯微結構觀察，研究了黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯合數量之間的相關性，以期為黃綠卷毛菇優良菌株的篩選及黃綠卷毛菇人工栽培的實現提供理論基礎和科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

(1)供試菌株。供試菌株為黃綠卷毛菇菌株HNHXF7、TJ、F18-2、F18-3、DTS10、DTS13、SJC6、WRQ18。

(2)培養基。固體培養基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，1.5 g Mg2SO4·7H2O，3 g KH2PO4，10 mg維生素B1，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.0。液體培養基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，1.5 g Mg2SO4·7H2O， 3 g KH2PO4，10 mg維生素B1，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.0。

(3)試劑與藥品。無水乙醇、異丙醇、次氯酸鈉、氯仿、異戊醇、巰基乙醇、CTAB、氯化汞、瓊脂糖、剛果紅、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1、2×Taq PCR MasterMix 均購自天根生化科技(北京)有限公司，D2000 DNA Ladder及引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

(4)試驗儀器。HIRAYAMA立式自動壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺、BS-2F數顯振蕩培養箱、BCD-539WT海爾冰柜、PCD-246T澳柯瑪冰柜、PCR自動序列化分析儀、微量移液器、電子分析天平、DYY-III型電泳儀、紫外成像儀、NikonYS100光學顯微鏡、玻璃器皿等。

1.2 試驗方法

(1)菌絲體顯微結構觀察。取蒸餾水1滴，滴加在干凈的載玻片中央，用接種環以無菌操作挑取培養17、27、37 d的菌絲體少許，在液滴中輕輕涂抹均勻，并加蓋干凈蓋玻片，在玻片一端滴加2滴剛果紅，將吸水紙放在另一端使菌絲體充分染色后置于光學顯微鏡下觀察，每個菌株在1個視野中測量9～12次菌絲體寬度，統計鎖狀聯合數量，均設3次重復。

(2)菌絲體生物量測定。平均日生長速率測定：分別將8個黃綠卷毛菇菌株的菌絲體(0.5 cm×0.5 cm)接種至固體培養基，設3次重復，置于25 ℃ 培養箱中恒溫培養30 d，利用游標卡尺測量菌落直徑，以(菌落直徑÷30×100%)作為平均日生長速率測定依據。平均干重測定：將8個黃綠卷毛菇菌株的菌絲體(0.5 cm×0.5 cm)分別接入裝液量為100 mL(250 mL三角瓶)的液體培養基中，室溫下靜置培養，然后稱量菌絲體的干重。

(3)多基因系統發育分析。黃綠卷毛菇菌絲體及子實體DNA的提?。河脺缇蔫囎犹羧∵m量菌絲體到研缽中，子實體烘干后取干重0.05 g于研缽中，加入液氮研磨，再加入65 ℃預熱的2×CTAB(1 mL CTAB∶4 μL β-巰基乙醇)1.5 mL，將研磨液放入離心管中，65 ℃水浴1 h，每隔10 min搖勻1次，水浴結束后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min；吸取上清液750 μL，加入等體積的氯仿—異戊醇(24∶1)(預冷)，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液600 μL，繼續加入等體積預冷的氯仿—異戊醇，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液400 μL，加入上清液體積1/10的預冷KAC，再加入總體積2/3的預冷異丙醇，4 ℃靜置過夜，然后4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入300 μL的70%乙醇混勻，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，重復2次；于4 ℃晾干后加入1×TE緩沖液50 μL溶解DNA，-20 ℃保存。

進行ITS、LSU序列擴增，PCR擴增引物如表1所示。

表1 PCR擴增引物Tab.1 PCR amplification primers

擴增反應結束后，取5 μL PCR產物在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳，同時加入5 μL的D2000 DNA Ladder，120 V電泳30 min，用凝膠成像系統進行成像，合格產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，對測序返回結果使用BioEdit軟件進行判斷修正，在NCBI數據庫中進行比對，identity>97%可視為處于同一屬。對所有測序結果用MEGA 7軟件構建聚類分析樹狀圖，分析其親緣關系。

2 結果與分析

2.1 黃綠卷毛菇菌絲體顯微結構觀察

圖1為培養17 d 時8株黃綠卷毛菇菌株在光學顯微鏡下的顯微結構。由圖1可知，黃綠卷毛菇菌絲體粗細均勻，分支較少，為有隔菌絲，菌絲體寬度均勻，存在鎖狀聯合，可作為黃綠卷毛菇菌絲體寬度測量的時間節點。

圖1 不同黃綠卷毛菇菌株的顯微結構Fig.1 Microstructure of Floccularia luteovirens stains

圖2為黃綠卷毛菇菌絲體寬度與培養時間的關聯性。

圖2 黃綠卷毛菇菌絲體寬度與培養時間的關聯性Fig.2 Correlation between mycelial width and culture time of Floccularia luteovirens

培養時間為17、27、37 d時，黃綠卷毛菇菌絲體寬度變化范圍為(6.31±1.58)～(17.03±3.61) μm，大部分(62.5%)菌絲體寬度與培養時間呈正相關，菌株F18-2、DTS13及SJC6與培養時間無相關性。

菌絲體生長到17 d，菌株DTS10及DTS13的菌絲體寬度最大，分別為(12.08±1.77)μm、(11.19±1.52)μm。菌絲體生長到27 d，菌株F18-3及DTS10的菌絲體寬度最大，分別為(14.44±1.99)μm、(13.88±4.14)μm；菌株WRQ18菌絲體寬度最小，為(6.31±1.58)μm。菌絲體生長到37 d，菌株DTS10的菌絲體寬度最大，為(17.03±3.61)μm；菌株F18-2及SJC6菌絲體寬度最小，分別為(10.05±1.33)μm、(9.78±2.24)μm。

表2為黃綠卷毛菇菌株在光學顯微鏡下菌絲體的寬度范圍。

表2 黃綠卷毛菇菌絲體的寬度范圍Tab.2 Width ranges of mycelia of Floccularia luteovirens

由表2可知，菌株HNHXF7菌絲體寬度范圍為(9.68±0.90)～(12.50±1.97) μm，菌株TJ菌絲體寬度范圍為(10.16±1.42)～(15.08±2.94) μm，菌株F18-2菌絲體寬度范圍為(10.03±1.62)～(10.05±1.33) μm，菌株F18-3菌絲體寬度范圍為(10.72±1.86)～(15.16±2.89) μm，菌株DTS10菌絲體寬度范圍為(12.08±1.77)～(17.03±3.61) μm，菌株DTS13菌絲體寬度范圍為(11.19±1.52)～(12.26±2.41) μm，菌株SJC6菌絲體寬度范圍為(9.78±2.24)～(10.42±1.98) μm，菌株WRQ18菌絲寬度范圍為(6.31±1.58)～(14.42±4.51) μm，黃綠卷毛菇菌絲體平均寬度范圍為(9.99±1.61)～(13.37±2.71) μm。

2.2 黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯合數量的相關性

表3為培養17～37 d的黃綠卷毛菇菌株的平均干重、平均日生長速率與鎖狀聯合數量。

由表3統計分析發現，8個黃綠卷毛菇菌株長勢可分為優(HNHXF7、TJ、WRQ18)、良(F18-2、F18-3)、中(DTS10、DTS13、SJC6)3個層次，3個層次間差異顯著(P<0.05)。3個層次的黃綠卷毛菇菌絲體平均日生長速率分別為優(0.50±0.12) mm/d、良(0.27±0.004) mm/d、中(0.19±0.03) mm/d，平均干重分別為優(841.8±48.01) mg、良(706±50.24) mg、中(498.7±78.42) mg。

表3 黃綠卷毛菇菌絲體生物量及鎖狀聯合數量Tab.3 Mycelial biomass and the number of clamp connection of Floccularia luteovirens

菌株HNHXF7、TJ和WRQ18沒有觀察到鎖狀聯合，菌株F18-2、F18-3鎖狀聯合數量均為2個，菌株DTS10、DTS13及SJC6鎖狀聯合數量均為3個。

進一步分析研究黃綠卷毛菇菌株長勢(平均日生長速率、平均干重)與鎖狀聯合數量的相關性,如圖3所示。

圖3 黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯合數量的相關性Fig.3 Correlation between mycelial growth and the number of clamp connections of Floccularia luteovirens

由圖3可知，黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯合數量呈負相關。鎖狀聯合數量越少，菌絲體生長速度越快。菌株HNHXF7、TJ與WRQ18在光學顯微鏡下未觀察到鎖狀聯合，其平均干重最大，為(841.8±48.01) mg，平均日生長速率為(0.50±0.12) mm/d；菌株F18-2與F18-3鎖狀聯合數量均為2個，平均干重為(706±50.24) mg，平均日生長速率為(0.27±0.004) mm/d；菌株DTS10、DTS13及SJC6鎖狀聯合數量均為3個，平均干重為(498.7±78.42) mg，平均日生長速率為(0.19±0.03) mm/d。

2.3 黃綠卷毛菇多基因系統發育分析

將8個黃綠卷毛菇菌株的ITS及LSU序列分別提交NCBI數據庫獲得登錄號(表4)，基于ITS和LSU系統發育樹見圖4。由圖4可知，菌株的長勢與進化不存在相關性，除外圍菌株，8個菌株很好地與參照菌株序列聚集在一支。參照菌株序列與目的序列相似度為99%，標尺指示為0.05步變化。

表4 黃綠卷毛菇序列提交登錄號Tab.4 Serial submission login numbers of Floccularia luteovirens

圖4 基于ITS和LSU的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS and LSU genes

3 討論與結論

菌株的微觀形態是研究其菌絲體特性的基本方式之一，也是進行菌種保藏、菌種優化的必要條件[8]。本研究發現黃綠卷毛菇菌絲體粗細均勻，顯微鏡下可觀察到明顯的鎖狀聯合，菌絲體培養到17 d時，鎖狀聯合數量平均為1.625個，而鎖狀聯合是雙核菌絲的鑒定標準，是雙核菌絲細胞分裂的一種特殊形式，也是擔子菌的明顯特征之一[9]；菌絲體培養時間為17～37 d時，菌絲體寬度變化范圍為(6.31±1.58)～(17.03±3.61)μm，并伴有隔膜，這是擔子菌的典型顯微特征[10]。

本研究首次發現黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯合數量呈負相關，鎖狀聯合數量越少，菌絲體生長速度越快。未觀察到鎖狀聯合的菌株HNHXF7、TJ及WRQ18平均日生長速率最快，平均干重最大。因此，鎖狀聯合數量是判斷黃綠卷毛菇菌株長勢的一個重要指標，也是篩選長勢優良菌株的重要參數。該結果與劉佳寧等[11]對黑木耳的研究結果有一定的相似性。

本研究僅從菌絲體外觀顯微結構觀察鎖狀聯合的數量，沒有深入研究細胞內部結果，今后可進一步研究黃綠卷毛菇染色體核型等顯微特征。