香菇多糖聯合奧沙利鉑對EC109細胞增殖作用的研究

王微微 劉 宇 張彩云 王 丹 孫環環 霍小蕾

食管癌(Esophageal cancer，EC)是位居我國癌癥發病率第4位的一種惡性腫瘤，具有惡性程度高、易轉移、預后差等特點[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法，許多患者初次診斷即為晚期，并常伴有淋巴結或遠處轉移[2]。在臨床治療中，首選治療手段是手術切除和輔助化療；對于不可手術切除的患者，全身化療是一種關鍵的治療方法[3]。鉑類化療藥物單獨或與其他藥物聯合使用，已被批準用于臨床治療[4]。奧沙利鉑是治療食管癌常用的鉑類化療藥物，并可引發免疫原性細胞死亡[5-6]，但化療會引起嚴重的副作用和腫瘤耐藥，最終可能導致化療失敗[7]。因此，尋找新型的可用于聯合化療的藥物，是提高食管癌化療療效的關鍵。

隨著醫療技術水平的發展，從植物中提取的天然產物聯合臨床藥物已經越來越多的用于治療多種癌癥并發揮了重要作用，如喜樹堿[8]、香菇多糖、長春花堿[9]等。香菇多糖(Lentinan，LNT)作為一類從香菇中分離的重要天然產物，是香菇中最主要和有效的生物活性成分，有研究稱，香菇多糖具有抗腫瘤[10]、抗病毒[11]、抗氧化、降血糖血脂和免疫調節等多種生物活性且毒性較低[12]，并已在臨床治療中作為免疫增強劑初步使用。香菇多糖與奧沙利鉑(Oxaliplatin，OXA)的聯合應用未見報道，本研究通過香菇多糖聯合奧沙利鉑作用于食管癌EC109細胞，探索其能否發揮協同增效作用，為增加香菇多糖的臨床應用提供新的理論依據及實驗基礎，也為開發植物多糖抗腫瘤藥物提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株：人食管癌細胞EC109(中國醫學科學院協和細胞庫)。藥品與試劑：香菇多糖(Adooq Bioscience)，奧沙利鉑(山東羅欣藥業集團股份有限公司)，RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)，10%胎牛血清(浙江天航生物科技股份有限公司)，100×青鏈霉素混合液(上海生工生物工程有限公司)，MTT粉末(北京索萊寶科技有限公司)，細胞周期檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，細胞凋亡檢測試劑盒(康為世紀)。儀器：流式細胞儀(美國BD)，全波長酶標儀(瑞士TECAN)，二氧化碳培養箱(美國Thermo)，研究級倒置式熒光顯微鏡(日本Nikon)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人食管癌EC109細胞培養于含100 U·mL-1青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基中，置于5%CO2、37 ℃的恒溫培養箱。

1.2.2MTT實驗 取對數生長期的EC109細胞，以每孔5 000個接種于96孔板，待細胞貼壁，每孔中加入對應濃度的藥物共培養24 h和48 h，后在每孔中加入10 μL的0.5 mg·mL-1MTT溶液于37 ℃孵育4 h，棄上清加150 μL的DMSO，最后用酶標儀在570 nm波長下測吸光度值(OD)。

1.2.3聯合給藥作用分析方法 采用Chou-Talalay聯合用藥指數法，用compusyn軟件分析兩藥聯用的最佳作用濃度。若CI<1，兩藥具協同作用，值越小協同作用越強；若CI=1，具累加效應；若CI>1，具拮抗作用，值越大拮抗作用越強。

1.2.4顯微鏡觀察細胞形態和數量 取對數生長期的細胞鋪板加藥，NC組、OXA組(20 μg·mL-1)、LNT組(1 200 μg·mL-1)、LNT+OXA組(1 200 μg·mL-1+20 μg·mL-1)，培養24 h，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5細胞周期檢測 選用細胞周期試劑盒檢測細胞周期。取細胞鋪板，處理同1.2.4，培養24 h后收集細胞，按照試劑盒操作步驟進行實驗，用流式細胞儀檢測分析。

1.2.6細胞凋亡檢測 利用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測細胞凋亡。取細胞鋪板，處理同1.2.4，按照試劑盒操作步驟進行實驗，用流式細胞儀檢測分析,使用Flowjo軟件分析數據，計算凋亡率。

1.3 統計學方法

取3次重復實驗結果，實驗數據均使用SPSS軟件進行統計分析，計量資料采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LNT和OXA對EC109細胞增殖的影響

不同濃度的LNT和OXA對EC109細胞的增殖均具抑制效應，呈劑量依賴性，差異有統計學意義，見圖1。

注：*P <0.05, ** P<0.01圖1 香菇多糖和奧沙利鉑對EC109細胞增殖的影響(n=3)Fig.1 Effect of lentinan and oxaliplatin on proliferation EC109 cells(n=3)

2.2 LNT與OXA聯合用藥濃度的確定

采用Chou-Talalay聯合用藥指數法，分別用濃度為0、400、800、1 200 μg·mL-1的LNT和濃度為0、5、10、20、40 μg·mL-1的OXA聯合處理EC109細胞，經Compusyn分析(見圖2、表1)，LNT+OXA組多數呈現CI<1的協同抑增殖作用；部分呈現CI>1的拮抗作用。因此選擇CI值最小的時間濃度組合：24 h的LNT(1 200 μg·mL-1)和OXA(20 μg·mL-1)聯用進行后續實驗。

(CI<1，協同作用；CI=1，累加效應；CI>1，拮抗作用)圖2 Compusyn分析LNT聯合OXA對EC109細胞的影響(L代表LNT，O代表OXA)Fig.2 Compusyn analyzed the effect of LNT combined with OXA on EC109 cells

表1 Compusyn分析LNT聯合OXA的CI值

2.3 LNT聯合OXA對EC109細胞形態學的影響

NC組、OXA組、LNT組、LNT+OXA組處理EC109細胞24 h后，NC組細胞數量多且形態完整，細胞大小均一且密集鋪展生長；OXA組細胞數量顯著減少，體積變大，且部分呈圓珠狀；LNT組細胞數量顯著減少，部分細胞貼壁能力降低；LNT+OXA組細胞數量顯著更少，體積相對較大。見圖3。

圖3 LNT聯合OXA對EC109細胞形態的影響Fig.3 Effect of LNT combined with OXA on morphology of EC109 cells

2.4 LNT聯合OXA對EC109細胞增殖的影響

NC組、OXA組、LNT組、LNT+OXA組處理EC109細胞24 h后，與OXA組和LNT組相比，LNT+OXA組抑增殖作用明顯增強。見圖4。

圖4 LNT聯合OXA對EC109細胞增殖的影響(n=3)Fig.4 Effects of LNT combined with OXA on EC109 cell proliferation(n=3)

2.5 LNT聯合OXA對EC109細胞周期的影響

NC組、OXA組、LNT組、LNT+OXA組處理EC109細胞24 h后，與NC組比較，OXA組S期細胞顯著增多；LNT組G1期細胞顯著增多；LNT+OXA組G2期細胞增多。見表2、圖5。

表2 LNT聯合OXA對EC109細胞周期的影響Tab.2 Effects of LNT combined with OXA on EC109 cell

圖5 LNT聯合OXA對EC109細胞周期的影響Fig.5 Effects of LNT combined with OXA on EC109 cell cycle

2.6 LNT聯合OXA對EC109細胞凋亡的影響

NC組、OXA組、LNT組、LNT+OXA組處理EC109細胞24 h后，與NC組、OXA組、LNT組相比，LNT+OXA聯用組細胞凋亡率升高，主要表現在晚期凋亡，即Q3，差異有統計學意義。見表3、圖6。

表3 LNT聯合OXA對EC109細胞凋亡的影響

圖6 LNT聯合OXA對EC109細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of LNT combined with OXA on apoptosis of EC109 cells

3 討論

香菇多糖是從食用香菇中分離出的高分子多糖，隨著中醫中藥越來越受到關注，中藥制劑常被用來輔助治療多種疾病。有報道稱，香菇多糖對人神經膠質瘤細胞SHG-44[13]、人肝癌細胞HepG2[14]、人乳腺癌細胞MCF-7[15]等均有不同程度的抑增殖作用，并可作為輔助劑與化療藥物聯合使用[16]，發揮抗腫瘤作用。奧沙利鉑是常用的鉑類化療藥物，并與其他藥物聯合使用，但化療耐藥極大的制約了食管癌患者整體生存率。在本研究中，探討了LNT聯合OXA對人食管癌細胞EC109的協同作用。

本研究結果顯示，LNT和OXA對EC109細胞的抑增殖作用呈現劑量依賴性；與LNT或OXA組相比，LNT+OXA組抑制細胞增殖作用更顯著；Compusyn分析發現，LNT與OXA聯用在多數濃度組合具有協同抑增殖作用。同時通過顯微鏡觀察，兩藥聯用使EC109細胞數量明顯減少，體積變大。流式細胞術檢測發現，LNT阻滯EC109細胞于G1期，OXA阻滯EC109細胞于S期，LNT+OXA組阻滯在G2期，表明兩藥聯合可能通過調控細胞周期來抑制細胞增殖。流式細胞術檢測細胞凋亡表明，LNT+OXA組引起EC109細胞凋亡的能力更強。

綜上所述，LNT與OXA聯合用藥具有協同抑增殖促凋亡作用，與細胞周期G2期阻滯有關。同時，近年研究報道，香菇多糖可引起人結直腸癌上皮細胞SW837[17]、人肺腺癌細胞A549[18]的免疫原性細胞死亡相關分子的表達升高。也有研究表明，奧沙利鉑可增強人和小鼠肝癌細胞的免疫原性細胞死亡相關生物標記物的表達[19]，也可促進CD8+T細胞的增加和未成熟樹突狀細胞(DC)趨于成熟[5]。因此，香菇多糖和奧沙利鉑聯用對免疫原性細胞死亡的影響值得更深入的探索，生物活性多糖和奧沙利鉑的聯合應用在食管癌的臨床應用研究中占有重要作用，在未來識別具有誘導免疫原性細胞死亡的抗腫瘤藥物也具有重要的研究價值。