基于非靶向代謝組學分析醬香型大曲中抑菌黑曲的功能成分

羅帥，張巧玲，楊帆，盧建軍，蒲秀鑫，張娟，王莉*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學,未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)4(貴州茅臺股份有限公司，貴州 遵義，564501)

白酒按照風味特征可分為醬香型白酒、濃香型白酒和清香型白酒。醬香型白酒酒體醇厚、回味悠長、空杯持久留香，深受消費者的喜愛[1]。醬香型白酒釀造歷史悠久，生產工藝獨特，包括高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵和高溫餾酒。其中，高溫制曲是一個十分重要的環節，大曲為釀造過程中的糖化、發酵、香氣產生提供酶和風味物質前體，高溫度高濕度的大曲發酵條件造就了大曲獨特的微生物群落結構和豐富的酶體系[2]。但是，由于發酵倉的不同部位溫濕度差異導致了大曲菌群及代謝成分的差異。因此，一批大曲發酵完成拆倉后，大曲一般按感官評估分為三類，命名為白曲、黃曲和黑曲(blackDaqu，BQ)[3]。

降酸問題一直是醬香型白酒釀造的核心問題之一。醬香型大曲發酵較高的溫度使細菌利用小麥中的蛋白質和糖，產生大量的有機酸和氨基酸，使大曲的酸度升高，酸度過高不僅導致大曲糖化力降低，發酵力減弱。而且還會使雜菌生長繁殖，對生產設備產生腐蝕性，加快窖泥老化，最終導致出酒率降低，增加生產成本[4-6]。我們前期偶然發現，有些黑曲能夠抑制乳酸菌的生長，并對100多份樣品進行了抑菌性試驗，從中獲得了2份能夠抑制乳酸菌的黑曲，稱為抑菌黑曲(antibacterial blackDaqu，BBQ)。其特征較之普通黑曲顏色更黑，風味更加濃郁。

近年來，代謝組學方法已廣泛應用于大曲代謝物的研究[7-8]。因此，我們基于代謝組學方法研究了黑曲和抑菌黑曲的代謝物，分析了抑菌黑曲中顯著上調的差異代謝物，明確了抑菌黑曲和黑曲的代謝功能差異，研究了目標代謝物香蘭素、萘啶酸、2-甲基呋喃和黑色素的體外抑制乳酸菌的能力，并對它們的代謝途徑進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

醬香型高溫大曲來自貴州茅臺酒股份有限公司，在大曲拆倉時從曲倉不同部位隨機取樣，經液氮處理后放于無菌自封袋中，保存于-40 ℃備用。其中114份樣品為不同輪次黑曲樣品，任取10份黑曲樣品，碾碎后充分混合，BQ 1-1、BQ 1-2、BQ 1-3為混合黑曲樣品的3個平行樣，BBQ 1-1、BBQ 1-2、BBQ 1-3為抑菌黑曲1的3個平行樣，BBQ 2-1、BBQ 2-2、BBQ 2-3為抑菌黑曲2的3個平行樣，2株乳酸菌面包乳桿菌和耐酸片球菌由醬香型大曲中篩選獲得。

MRS培養基，青島海博生物技術有限公司；針頭式過濾器，生工生物工程(上海)股份有限公司；分析純香蘭素、萘啶酸、2-甲基呋喃，阿拉??；黑色素，默克；色譜級甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水，上海佰曄生物科技中心。

1.2 儀器與設備

HDPF-256電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；ZQZY-88BH振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；ZX-LGJ-2冷凍干燥機，上海知信實驗儀器技術有限公司；RE-201D旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；UVmini-1285紫外可見分光光度計，島津儀器有限公司；HVS-1000(-U)高級型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；Vanquish超高效液相色譜儀、Q Exactive HFX高分辨質譜儀，賽默飛世爾科技公司；JXFSTPRP-24研磨儀，上海凈信科技有限公司；PS-60AL超聲儀，深圳市雷德邦電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 抑菌黑曲的篩選及其抑菌性研究

取9批共114份黑曲樣品進行抑菌性試驗，從中篩選具有抑制乳酸菌的樣品，大曲樣品粉碎后，稱取10 g大曲加入30 mL蒸餾水4 ℃浸泡過夜，低溫離心獲得大曲樣品的浸提液，真空冷凍干燥將浸提液濃縮10倍，過濾除菌獲得無菌的大曲樣品浸提液。將活化的乳酸菌菌液以1%接種量接種到等量添加大曲浸提液的MRS培養基中，對照用等量的無菌水替換，37 ℃培養12 h后，稀釋不同梯度，平板培養，24 h后對平板菌落進行計數。

1.3.2 大曲代謝物提取

取100 mg樣品至EP管中。加入1 mL甲醇(含1 μg/mL內標)后渦旋30 s，樣品在35 Hz下均質4 min，然后在冰上超聲5 min。均質化和超聲處理重復3次。然后將樣品在-40 ℃下孵育1 h，并在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min。將獲得的上清液貯存用于LC/MS分析[9]。

1.3.3 LC-MS/MS分析

使用UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)與Q Exactive質譜儀聯用的超高效液相色譜系統進行LC-MS/MS分析。液相色譜A相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水，B相為乙腈。采用如下洗脫梯度：0～1.0 min，1% B；1.0～8.0 min，1%～99% B；8.0～10.0 min，99% B；10.0～10.1 min，99%～1% B；10.1～12 min，1% B。柱溫30 ℃。自動進樣器溫度為4 ℃，進樣量為2 μL。QE HFX質譜儀能夠在控制軟件(Xcalibur，Thermo)控制下進行一級、二級質譜數據采集。以下為ESI離子源條件：鞘氣流速為45 Arb，輔助氣流速為15 Arb，離子傳輸管溫度400 ℃，全掃描分辨率為70 000，MS/MS分辨率為17 500，碰撞能量為NCE模式下20/40/60 eV，電離電壓分別為4.0 kV(正)或-3.6 kV(負)。

1.3.4 數據處理

使用ProteoWizard將原始數據轉換為mzXML格式。使用R并基于XCMS的內部程序用于峰檢測、提取、對齊和積分[10]。XCMS包可以通過Bioconductor安裝。具體信息請參考https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html。然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級質譜數據庫匹配進行物質注釋。以下所有的代謝物數據分析選擇MS質譜得分>0.6的代謝物進行。

1.3.5 主成分分析(principal component analysis，PCA)

使用SIMCA軟件，對數據進行對數轉換加Par格式化處理，然后進行自動建模分析[11]。

1.3.6 正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)

SIMCA軟件(V15.0.2)用于對數轉換和UV格式化處理，以可靠地篩選組間的差異代謝物。通過OPLS-DA建模和第一主成分分析來評估模型的質量。使用7-flod交叉驗證進行測試。然后，通過R2Y(模型對分類變量Y的可解釋性)和Q2(模型的可預測性)來估計模型的準確性。最后采用置換檢驗隨機多次改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機Q2值，進一步檢驗模型有效性[12]。

1.3.7 差異代謝物篩選和火山圖

t檢驗和方差分析等是單變量統計分析的方法，它們更關注代謝物的獨立變化，為了防止使用單一數據分析方法造成的假陽性或模型過擬合，我們使用多元統計分析，P值<0.05和OPLS-DA模型中第一主成分(PC 1)的投影中的變量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)>1作為差異代謝物的篩選標準并繪制火山圖[13]。

1.3.8 抑菌物質對乳酸菌抑制效果驗證

將上述數據分析得到香蘭素、萘啶酸、黑色素和2-甲基呋喃4種抑菌物質設置不同濃度梯度過濾除菌，將活化的乳酸菌以1%接種量接入加入抑菌物質的培養基中，220 r/min搖床培養24 h，以不加抑菌物質的培養基作為對照，隔2 h測600 nm處的OD值。由于黑色素加入培養基后顏色深，測量誤差較大，采用平板計數法測定抑菌效果，將黑色素溶解于1 mol/L氨水，旋轉蒸發至黑色素溶液pH為7.0～7.5，過濾除菌后加入，以無菌水代替黑色素溶液作為對照，培養12 h后將加入黑色素的乳酸菌培養液稀釋不同梯度，吸取15 μL點接在平板上，37 ℃培養24 h后計數。

1.3.9 抑菌黑曲和黑曲KEGG通路差異豐度分析

從大量的注釋通路中找到有價值的代謝通路是代謝組學數據挖掘的一大難題。差異豐度得分是一種基于通路的代謝變化分析方法，可以直觀清晰的展示相關代謝通路的在抑菌黑曲和黑曲上下調情況以及所屬代謝類型[14]。

2 結果與分析

2.1 抑菌黑曲的篩選及其抑菌性研究

如圖1-A所示，對9批共114份黑曲樣品做了抑菌性試驗，發現絕大多數黑曲都不存在抑制乳酸菌的作用，僅3%黑曲樣品存在顯著抑制作用，取2份抑菌黑曲樣品和1份黑曲樣品進行計數。如圖1-B、圖1-C所示，與對照組及黑曲浸提液相比，抑菌黑曲浸提液加入培養基后，對乳酸菌有顯著的抑制效果，對照組及加入黑曲浸提液后，菌落存活數為加入抑菌黑曲浸提液的1 000倍左右，抑菌黑曲1的抑制效果更強些，我們推測抑菌黑曲的抑菌作用可能與某些抑菌素有關，因此接下來對其代謝物進行了研究。

A-抑菌黑曲樣品占比；B-樣品及對照平板菌落生長情況；C-樣品及對照平板菌落計數圖1 不同大曲浸提液對乳酸菌生長的影響Fig.1 Effects of different Daqu extracts on the growth of lactic acid bacteria

2.2 抑菌黑曲和黑曲代謝物PCA

在不同樣品中共檢測到1 290種代謝物。所有樣本的PCA得分散點圖如圖2所示，其中橫坐標(PC1)和縱坐標(PC2)分別代表第一主成分和第二主成分的得分。不同顏色的散點代表不同的樣本，散點分布越近，樣本的代謝物種類和豐度越類似，如果樣本距離越遠，表示差異越大。如圖2所示，所有樣本都在95%置信區間內(Hotelling的T方橢圓)。該結果表明不同類型大曲的代謝物存在顯著差異，但組內平行樣品間無明顯偏差。

圖2 所有樣本的PCA 模型的分數散點圖Fig.2 Score scatter plot for PCA model total

2.3 抑菌黑曲和黑曲OPLS-DA

在OPLS-DA中，在篩選出與分類變量無關的正交變量后，通過分析非正交變量和正交變量獲得樣品之間代謝物的差異和相關性。如圖3-A和圖3-B所示，PC 1的預測主成分得分以橫坐標t[1]P顯示，正交主成分得分以縱坐標t[1]O顯示，不同形狀和顏色的散點表示不同的樣本。OPLS-DA評分結果顯示抑菌黑曲的代謝物與黑曲有顯著差異。

圖3-C和圖3-D中，橫坐標代表置換檢驗的置換保留(與原模型的Y變量序列一致的比例，置換保留等于1的點就是R2Y和Q2的值)，縱坐標分別代表R2Y和Q2的回歸線。圖中R2Y值足夠接近1，說明模型充分反映了樣品代謝物的真實情況。另外，Q2值與R2Y值相近，說明樣本量足夠，不會造成較大誤差。因此，模型可以解釋樣本之間的差異。隨機模型置換檢驗的Q2值低于原模型，Q2回歸線與縱軸截距均<0。而且，Y變量的比例隨著排列保留率的降低而增加，隨機模型的Q2值與排列保留率的變化一致。這表明原始模型能夠準確地反映樣本的差異。

A-抑菌黑曲1與黑曲的OPLS-DA模型的分數散點圖；B-抑菌黑曲2與黑曲的OPLS-DA模型的分數散點圖；C-抑菌黑曲1與黑曲的OPLS-DA模型的置換檢驗；D-抑菌黑曲2與黑曲的OPLS-DA模型的置換檢驗圖3 OPLS-DA的分析結果Fig.3 Score scatter plot of OPLS-DA model

2.4 差異代謝物篩選和火山圖

如圖4所示，火山圖中不同顏色的點是不同的代謝物。橫坐標是兩組之間每種代謝物的相對豐度倍數(以2為底的對數)，縱坐標是指t檢驗的P值(以10為底的對數)。每種代謝物的VIP值以散點面積表示。散點越大，表示代謝物的VIP值越大。在本研究中，不同樣品共檢測到1 290種代謝物，抑菌黑曲1與黑曲相比有348種上調的差異代謝物，抑菌黑曲2與黑曲相比有445種上調的差異代謝物(P<0.05，VIP>1)。其中，抑菌黑曲1和抑菌黑曲2共同上調的差異代謝物259種，包括79種有機雜環化合物、65種有機酸及其衍生物、35種有機氧化合物、26種苯類、22種脂質和類脂分子、12種苯丙烷和聚酮化合物、5種生物堿及其衍生物、15種其他化合物。

通過以上篩選條件得到了259種在抑菌黑曲中顯著上調的差異代謝物，由于數量過多，無法一一進行研究，因此，我們添加篩選條件，篩選259種物質中在抑菌黑曲和黑曲的相對豐度差異倍數在2倍以上的代謝物，獲得81種P值<0.05，VIP值>1及差異倍數(fold change，FC)>2的物質，然后對81種物質按照相對豐度的高低進行排序。最后對相對豐度排名前20的物質進行深入研究(表1)，根據相關研究報道，豐度排名前20的物質中，香蘭素、萘啶酸和2-甲基呋喃對某些微生物存在抑制作用，趙建芬等[15]的研究表明，香蘭素對大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌有較強的抑制作用。萘啶酸是喹諾酮類抗菌藥，對引起腹瀉病的彎曲桿菌屬有一定的抑菌作用[16]。2-甲基呋喃是美拉德反應的典型中間產物，許多美拉德反應都存在抑菌活性[17]。此外，我們發現豐度排名前20的物質中，包括酪氨酸和多巴，二者是黑色素合成的前體，同時，黑色素也是抑菌黑曲中顯著上調的差異代謝物。研究表明，黑色素是酶促褐變的產物，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有很強的抑菌活性[18]。香蘭素和黑色素是苯類化合物，2-甲基呋喃和萘啶酸是有機雜環類化合物。因此，接下來我們對這4種物質體外抑制乳酸菌的活性進行研究。

2.5 抑菌物質對乳酸菌的抑制效果驗證

將4種抑菌物質根據上述報道的抑菌特性，根據其最低抑菌活性及抑菌性能，設置不同濃度梯度培養乳酸菌，以大曲中篩選得到的面包乳桿菌和耐酸片球菌為指示菌，如圖5所示，香蘭素和2-甲基呋喃對乳酸菌有較強的抑菌作用，隨著它們的濃度升高，其抑菌效果增強。萘啶酸對乳酸菌的抑制作用稍弱，當質量濃度達到0.1 g/L時，出現抑制作用。

A-抑菌黑曲1與黑曲中差異代謝物的火山圖；B-抑菌黑曲2與黑曲中差異代謝物的火山圖；C-抑菌黑曲中上調的差異代謝物分類及數量；D-抑菌物質相對豐度熱圖圖4 抑菌黑曲與黑曲的差異代謝物篩選Fig.4 Screening of differential metabolites of BBQ vs BQ注：圖A，B中散點的不同顏色表示代謝物在抑菌黑曲中是否上調;抑菌黑曲中上調的代謝物是紅色的；抑菌黑曲中下調的代謝物是藍色的；灰色表示抑菌黑曲與黑曲沒有顯著差異

A-香蘭素對面包乳桿菌生長的影響；B-香蘭素對耐酸片球菌生長的影響；C-萘啶酸對面包乳桿菌生長的影響；D-萘啶酸對耐酸片球菌生長的影響；E-2-甲基呋喃對面包乳桿菌生長的影響；F-2-甲基呋喃對耐酸片球菌生長的影響圖5 抑菌物質對乳酸菌生長的影響Fig.5 The effect of bacteriostatic substances on the growth of lactic acid bacteria

如圖6所示，黑色素隨著濃度的升高，平板上生長的菌落數明顯減少，抑制作用明顯增強。大曲發酵是混菌發酵的過程，有成千上萬種微生物發揮作用，產生數千種代謝物，香蘭素、萘啶酸、2-甲基呋喃等代謝物在黑曲中積累，使其具有抑制乳酸菌的作用，形成抑菌黑曲。

表1 抑菌黑曲中顯著上調的20種代謝物在不同樣本中相對豐度Table 1 Relative abundances in different samples of 20 metabolites significantly up-regulated in BBQ

2.6 抑菌黑曲和黑曲KEGG通路差異豐度分析

如圖7所示，氨基酸代謝中，只有酪氨酸代謝在抑菌黑曲中上調，說明抑菌黑曲的代謝方向主要為風味物質轉換，該代謝途徑的起始物質為酪氨酸，酪氨酸在一種多酚氧化酶-酪氨酸酶的催化下，經過氧化聚合作用，形成黑色素[19]，黑色素在抑菌黑曲中上調，產生抑制乳酸菌的作用，這也解釋了抑菌黑曲外觀比黑曲更黑的原因。

A-平板圖；B-菌落個數圖6 黑色素對乳酸菌生長的影響平板計數Fig.6 Effect of melanin on the growth of lactic acid bacteria

圖7 抑菌黑曲和黑曲KEGG通路差異豐度圖Fig.7 The KEGG pathway differential abundance map of BBQ vs BQ注：圖中通路的不同顏色表示通路所屬不同的代謝分類，線段表示該通路的上下調情況，線段數值為正則表示該通路整體上調，反之，表示通路整體下調;線段端點的大小表示該通路中被注釋的物質數量

此外，大多數氨基酸代謝都在抑菌黑曲中下調，在黑曲中上調，說明抑菌黑曲中的氨基酸更傾向于與小麥中還原糖發生美拉德反應，形成很多有機雜環類代謝物，使得抑菌黑曲中存在極多的顯著上調的有機雜環類差異代謝物，包括存在抑制乳酸菌活性的2-甲基呋喃和萘啶酸。而黑曲中氨基酸更傾向于代謝成小分子。

2.7 抑菌黑曲抑菌成分代謝網絡分析

大曲發酵是固態發酵過程，大量微生物產生豐富的酶系，包括多種淀粉酶和蛋白酶，淀粉酶和蛋白酶水解原料小麥產生氨基酸和還原糖[20]，醬香型大曲高溫高濕的發酵環境及豐富的氨基酸和還原糖為美拉德反應提供了條件[21]，氨基酸和還原糖經過聚合、縮合等反應，產生吡啶、吡咯、呋喃、吡嗪等有機雜環類物質，包括2-甲基呋喃和萘啶酸，2-甲基呋喃是由典型美拉德反應產物糠醛轉化而來，各種有機雜環類物質經過復雜的轉化最終生成棕色甚至是棕黑色的大分子物質類黑素。

如圖8所示，制曲原料小麥中的氨基酸還能被微生物利用進入氨基酸代謝，苯丙氨酸代謝途徑中，苯丙氨酸、肉桂酸和對香豆酸等在抑菌黑曲中顯著下調，用于合成香蘭素。下調的苯丙氨酸還用于形成酪氨酸進入酪氨酸代謝，該代謝通路上的酪氨酸、L-多巴、多巴色素和黑色素均在抑菌黑曲中上調，使黑色素在抑菌黑曲中積累，產生抑制乳酸菌作用。

圖8 抑菌物質代謝網絡Fig.8 Metabolism network of antibacterial substances注：紅色表示在抑菌黑曲中顯著上調的代謝物，藍色表示在抑菌黑曲中顯著下調的代謝物

3 結論

利用非靶向代謝組學對抑菌黑曲和黑曲的代謝物進行解析，明確了抑菌黑曲中抑制乳酸菌的代謝物，并對抑菌物質的代謝過程進行了解析，為醬香型白酒的降酸問題提供理論依據從而達到提高白酒品質的目的。研究表明，抑菌黑曲和黑曲的代謝表型存在顯著差異，抑菌黑曲中存在259種顯著上調的差異代謝物，經過分析和體外抑菌性試驗明確了香蘭素，萘啶酸，2-甲基呋喃和黑色素4種具有抑制乳酸菌作用的代謝物。抑菌黑曲中各種氨基酸代謝顯著下調，表明抑菌黑曲中氨基酸用于美拉德反應，產生大量雜環類物質包括2-甲基呋喃和萘啶酸，抑菌黑曲中酪氨酸代謝上調，產生具有抑菌效果的黑色素，香蘭素是苯丙氨酸代謝的產物。以上的分析對于醬香型白酒降酸問題的解決提供理論基礎，對白酒釀造提供優質大曲和白酒質量的提升有一定貢獻。后期工作可以通過蛋白組學和宏基因組學對抑菌黑曲中抑菌成分的來源微生物和代謝途徑做進一步解析。