基于蛋白質組學的透明質酸寡聚糖抗炎活性研究及驗證

鄭博文，王斌雅，肖婉玲，孫亞娟，趙炳天，楊成

(合成與生物膠體教育部重點實驗室，江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫，214122)

蛋白質組是指“一個基因組所編碼表達的全部蛋白質”，這一概念最早是由澳大利亞的WASINGER等[1]提出并加以闡釋的。通過蛋白質組學的研究，可以整體地對細胞內蛋白質的組分情況、表達情況進行分析，從而對于蛋白之間的作用與聯系，以及蛋白質對于生命活動的影響進行探索，進而揭示不同蛋白的具體潛在功能及其應用價值[2]。隨著技術的發展，液相質譜聯用逐漸成為蛋白組學中主要的檢測手段，然而，研究人員選取的研究策略仍存在著差異。其中，數據非依賴性采集(data independent acquisition, DIA)技術具有檢測量大，數據易得，可重復性好等優勢[3]，近年來應用范圍較廣。在食品領域，蛋白質組學被廣泛應用于乳制品、水產和肉制品的生產過程以及產品的研究中，此外，發酵用菌株及發酵過程中的蛋白質變化過程也可以采用蛋白組學進行研究[4-6]。

透明質酸(hyaluronic acid, HA)是一種廣泛存在于動物組織的細胞間質中的糖胺聚糖[7]，具有促進傷口修復、組織再生、免疫調控、抗炎等多種生物活性[8]。根據分子質量(molecular weight,Mw)的差異，可將透明質酸劃分為高分子透明質酸(Mw≥100 kDa)，低分子透明質酸(10 kDa

本文通過蛋白組學檢測oligo-HA處理后的脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)刺激的RAW264.7細胞，從蛋白水平對其在炎癥免疫反應中的作用進行研究，并通過斑馬魚的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfonate, SDS)刺激模型，驗證其對炎癥的舒緩功效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

透明質酸寡聚糖發酵液，由江蘇瑞霆生物科技有限公司提供，經冷凍干燥后低溫保存。RAW264.7小鼠巨噬細胞系，北納創聯生物技術有限公司。轉基因中性粒細胞綠色熒光品系斑馬魚，杭州環特生物科技有限公司。

LPS，Sigma-Aldrich公司；SDS，上海阿拉丁生化科技有限公司；iST試劑盒，PreOmics公司；色譜級乙腈，上海泰坦公司；其余試劑均為AR級且購自國藥試劑。

1.2 儀器與設備

EASY nano LC 1200液相色譜系統、Orbitrap FusionTMLumosTMTribridTM質譜儀，美國Thermofisher公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養及蛋白提取處理

將凍存的RAW264.7細胞復蘇后，采用DMEM完全培養基(含10%胎牛血清及1%雙抗，體積分數)，在細胞培養箱中于37 ℃，5% CO2，飽和濕度下培養。當細胞生長至培養皿面積的80%以上時，進行傳代。將處于對數生長期的細胞接種于60 mm小培養皿中(1×106個/mL)，培養24 h后，棄去舊培養基，分為HAD組(oligo-HA及LPS處理)及HAB組(僅LPS處理)。HAD組加入用DMEM稀釋至500 μg/mL的HA溶液(HAB組改為空白DMEM培養基)，繼續培養18 h后，棄去舊培養基，加入用DMEM稀釋至1 μg/mL的LPS及500 μg/mL的HA溶液，繼續培養6 h。將處理完成的細胞收集至離心管中，在1 000×g，4 ℃下離心5 min，棄去上清液，向細胞中加入裂解液，渦旋振蕩，于超聲波細胞破碎儀中超聲處理2 min后，在冰上裂解30 min，期間每10 min振蕩混勻1次。在12 000×g, 4 ℃條件下離心20 min，取上清液進行BCA定量。采用iST樣本前處理試劑盒對所得蛋白樣品進行前處理，經高溫變性，酶解，肽段除鹽，洗脫過程后，將所得肽段抽真空于-80 ℃保存備用。

1.3.2 nano-HPLC-MS/MS分析

將樣品加入30 μL的0.1%(體積分數)甲酸水溶液制成懸浮液。取9 μL樣品溶液與1 μL 10×iRT肽段混合后，采用nano-LC分離，經在線電噴霧串聯質譜分析。實驗選用Acclaim PepMap C18柱，柱溫55 ℃，進樣流速為300 nL/min，進樣量為2 μL。流動相A為0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含有0.1%甲酸的80%乙腈水溶液。洗脫條件為4% B相起始，平衡5 min，在120 min升至50%后，在1 min內升至95%，保持9 min。

質譜儀在數據非依賴采集模式下運行[13]。設置質譜參數為：(1) MS：掃描范圍(m/z) 350～1 200；分辨率：120 000；Normalized AGC target 250%；最大注入時間：100 ms；(2) HCD MS/MS：分辨率：50 000；Normalized AGC target 200%；最大注入時間：86 ms；碰撞能量：33。

1.3.3 蛋白注釋與生物信息學分析

采用Spectronaut 15.0默認參數對DIA數據進行分析。序列數據庫為 uniprot homo sapiens(version201907, 20428 entries)數據庫，設置胰蛋白酶酶解。Spectronaut 進行自動校正，采用局部歸一化策略進行數據歸一化處理。<1.0% FDR的前3個肽段的峰面積的平均值用來進行蛋白組的定量。差異篩選標準：One way ANOVA Test分析后取P<0.05，|fold change|>1.5 的差異蛋白。對篩選得到的差異蛋白基于GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進行注釋及通路分析。

1.3.4 斑馬魚刺激試驗

1.3.4.1 最大試驗濃度的確定

隨機選取受精后2 d的斑馬魚，按每孔30尾置于六孔板中。以質量分數0.12%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%將oligo-HA樣品添加到六孔板中，定容至3 mL，同時設置正常對照組。將斑馬魚置于28 ℃條件下避光孵育18 h。孵育結束后，在顯微鏡下觀察并統計各組斑馬魚存活情況及活力，確定樣品的最大試驗濃度。

1.3.4.2 SDS刺激舒緩功效測試

根據最大濃度試驗結果確定樣品處理濃度，并梯度設置3個濃度。采用1%(體積分數)甘油葡糖苷作為陽性對照(positive control, PC)。隨機選取受精后2 d的斑馬魚，按每孔30尾置于六孔板中，將SDS溶液加入孔中并定容至3 mL，使得SDS終質量濃度為60 μg/mL。

將斑馬魚置于28 ℃條件下避光孵育18 h。孵育結束后，每組隨機選擇10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照保存，對皮膚中性粒細胞進行計數。刺激抑制率按公式(1)進行計算，并根據抑制率評估舒緩功效。

(1)

式中：E1，刺激抑制率，%；Nc，模型組中性粒細胞數量，個；Ns，樣品組中性粒細胞數量，個；Nb，空白對照組中性粒細胞數量，個。

2 結果與分析

2.1 透明質酸對LPS刺激的RAW264.7細胞作用的蛋白組學分析

2.1.1 主成分分析

研究中采取主成分分析方法，對數據進行降維分析，將多維數據轉化為蛋白主成分表達量，從而評估樣品的相似及差異情況。如圖1所示，所檢測的兩組樣品中，各組內蛋白距離較近，主成分相似，說明測定結果重復性較好。且HAD組與HAB組間存在明顯距離，區分較大，說明oligo-HA樣品處理對LPS刺激的細胞內蛋白表達產生調控作用。

圖1 RAW264.7細胞蛋白的主成分分析Fig.1 PCA of proteins in RAW264.7 cells

2.1.2 差異表達蛋白的篩選及鑒定

經過分離檢測，共鑒定到肽段48 592個，蛋白6 119個。經過ANOVA分析后篩選出的顯著性差異蛋白共124個，其中，HAD組相對于HAB組上調的為76個，下調的為48個，如圖2所示。

2.1.3 差異表達蛋白GO富集分析

根據挑選出的差異蛋白，采用GO分析，計算出現富集的差異基因，從而確定不同樣品的差異基因與基因功能改變之間可能的關系。如圖3所示，富集后差異表達蛋白主要分為生物學過程、功能分子與細胞組成三類，每類中，取P值最小的10個富集結果進行作圖。oligo-HA的作用主要包括參與細胞周期及羧酸和氨基酸的代謝過程(生物學過程)，調控組蛋白絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸激酶及轉移酶等活性，調控類視黃醇和類異戊二烯的結合(功能分子)，影響細胞內成分與細胞器(細胞組成)等。

圖2 差異表達蛋白火山圖Fig.2 Volcano plot of differentially expressed proteins注：中部灰色點表示無顯著性差異表達的蛋白，上調蛋白采用紅色點表示，下調蛋白采用藍色點表示

圖3 差異表達蛋白GO富集分析主要結果Fig.3 Main results of GO analysis of differentially expressed proteins

2.1.4 差異表達蛋白KEGG富集分析

與GO分析類似，在KEGG分析中，通過對富集情況進行計算，根據P值篩選出存在明顯差異的蛋白，從而分析oligo-HA的主要作用。計算后統計富集篩選中P值最小的15個蛋白條目進行繪圖，結果如圖4所示。oligo-HA主要參與到糖胺聚糖生物合成，破骨細胞分化，泛酸和輔酶A生物合成，氨?；?tRNA生物合成，甲狀腺激素、T細胞受體和ErbB信號通路，以及多種癌癥相關通路的調控中。

圖4 差異表達蛋白KEGG富集分析主要結果Fig.4 Main results of KEGG analysis of differentially expressed proteins

2.2 oligo-HA舒緩SDS對斑馬魚的刺激功效測試

2.2.1 oligo-HA的最大耐受濃度測試

最大耐受度實驗測試結果如表1所示，盡管在質量分數為2%的組中，斑馬魚死亡率為0，但其活力存在明顯降低，狀態較差，故判定2%的oligo-HA對斑馬魚的正常生存有影響，確定最大耐受質量分數為1%，用于后續實驗。

表1 透明質酸寡聚糖最大耐受濃度實驗Table 1 The maximum tolerance dose of oligo-HA for zebra fish

2.2.2 oligo-HA的舒緩功效測試

根據確定的斑馬魚對oligo-HA樣品的最大耐受濃度，并梯度設置3個濃度，對斑馬魚進行處理，同時采用SDS對斑馬魚進行刺激，從而評估樣品的舒緩功效。結果如圖5所示，0.5%(P<0.05)及1%(P<0.01)質量分數的oligo-HA處理的斑馬魚中性粒細胞數量顯著性降低，刺激抑制率達25%以上，證明樣品具有明顯的舒緩功效。

SDS-僅加入刺激的模型組;PC-加入1%甘油葡糖苷的陽性對照組a-斑馬魚中性粒細胞熒光典型照片；b-中性粒細胞計數；c-刺激抑制率圖5 Oligo-HA樣品對斑馬魚SDS刺激舒緩功效Fig.5 Effects of oligo-HA sample on SDS-stimulated zebra fish注：#表示P<0.05與空白組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01與SDS組相比

3 討論與結論

透明質酸作為生命體中的一種重要成分，一直以來在美國等地被用作膳食補充劑使用[14]。根據日本的一項雙盲試驗研究，經過一段周期的HA口服食用，受試人員的皺紋減輕，同時皮膚的光澤和柔軟度得到了提升[15]。隨著我國衛健委批準透明質酸鈉為“新食品原料”，對于其在食品中的功效及應用研發值得投入更多關注。

本實驗中，首先通過蛋白質組學分析，對oligo-HA在LPS刺激的RAW264.7細胞中的作用效果進行了探究。根據蛋白質組學的結果，經過樣品處理的細胞與未處理組相比，主要存在124個差異蛋白，其中表達顯著上調的蛋白76個，顯著下調的蛋白48個。它們主要參與的生理活動包括細胞周期及羧酸和氨基酸的代謝過程等，主要影響的通路包括細胞分化，生物信號分子合成以及部分癌癥相關通路等。表2中列舉了存在顯著性差異表達，且參與到炎癥反應及免疫應答調控中的主要蛋白。

oligo-HA處理組中，T細胞受體信號通路相關蛋白AKT1, PAK4表達顯著性下調：AKT/PI3K信號通路在炎癥及免疫細胞的調控起到重要作用，根據FU等[16]的研究，通過抑制AKT/PI3K信號通路，RAW264.7細胞中的炎癥因子水平顯著下降，起到了抗炎效果。這與HAN等[10]的報道中oligo-HA的下調炎癥因子的抗炎功效一致。PAK4蛋白在癌癥中常常大量表達，并進一步誘導癌細胞的增殖與轉移擴散。一項研究表明，通過抑制PAK4的表達，可以阻止癌細胞在癌癥小鼠模型中的增殖，以及促進癌細胞的凋亡[17]。對于PAK4的抑制效果，也為透明質酸在食品與醫藥中的應用提供了可能的方向。FCGR2及NAL10主要參與到免疫細胞的信號傳導中，實驗結果中這些蛋白的表達顯著性上調。FCGR家族是免疫細胞上分布最廣的受體，其可以主導免疫復合物的內吞作用[18]。FCGR2被發現分布于B細胞，巨噬細胞，中性粒細胞等表面，當FCGR被激活后，它們會磷酸化并促進細胞對病原體及被感染的細胞做出反應[19]。NAL蛋白參與到Th細胞的免疫應答作用中并調控炎癥反應。MIYAI等[20]的研究中，在特應性皮炎的患者皮膚中，NAL10的表達可以抵御細胞凋亡刺激，并抑制其并發的炎癥小體激活，從而起到抑制炎癥的作用。oligo-HA的抗炎作用，也與這些相應蛋白的表達上調密不可分。通過對蛋白質組學的結果進行深入分析，可以對oligo-HA的抗炎作用效果以及作用產生的機理得出更深入的了解與認識，拓寬其應用前景。

表2 參與炎癥及免疫調節的主要差異蛋白Table 2 Major differentially expressed proteins involved in inflammation and immune regulation

斑馬魚作為常用的模式動物之一，因其繁殖能力強、周期短，便于觀察且免疫細胞與人類相似等優點，已被廣泛應用于免疫、生理等研究中[21]。本研究中，采用SDS對斑馬魚進行刺激，建立炎癥模型，通過對中性粒細胞進行計數，體現炎癥反應情況。結果表明0.5%與1%質量分數的oligo-HA處理的斑馬魚實驗組中，中性粒細胞數量顯著性降低，證明樣品能夠顯著性的抑制炎癥反應，調控免疫細胞的作用，這與蛋白質組學結果中體現的oligo-HA的抗炎效果是相一致的。

綜上所述，本研究采用oligo-HA對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞進行預處理，通過對細胞樣本的蛋白質組學分析，分析確認了其參與調控的抗炎與免疫調控等多項生理活動及相關的信號通路，并采用SDS誘導的斑馬魚刺激模型，驗證了oligo-HA的抗炎效果，為其作為“新食品原料”的應用提供了更多潛在價值。