上尿路尿路上皮癌組織中脂肪因子表達與臨床病理特征及預后的相關性

戴 翔，王 飛，杜依青，宋宇軒，徐 濤

(北京大學人民醫院泌尿外科， 北京 10044)

根據2019年最新發布的歐美癌癥流行病學調查，尿路上皮癌的發病率在世界惡性腫瘤中排名前十，其中膀胱尿路上皮癌占絕大多數[1]。在歐美人群中，上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma, UTUC)僅占尿路上皮癌總數的5%～10%，但這一比例在亞洲人群中明顯升高，約為9.3%～29.9%，平均為17.9%[2]。

UTUC包括腎盂癌和輸尿管癌，前者的發病率約為后者的兩倍，同時在約17%的病例中存在并發膀胱癌[3]。亞洲人群與其他地區人群相比，UTUC具有侵襲性強、輸尿管腫瘤比例高、預后差的特點，因此在亞洲人群中UTUC可能有與其他地區人群所不同的發病機制[2]。針對UTUC預后危險因素的研究一直是領域內的熱點，總體來說，腫瘤分期、分級、淋巴結轉移、淋巴血管受侵及組織學變異等病理特征是UTUC預后的主要決定因素，年齡、性別、種族、肥胖等臨床因素，手術方式、遠端輸尿管處理方法等手術因素是否與預后存在相關性仍存在一定爭議。近年來，也有越來越多的研究者針對各種血液和組織中分子標志物的表達和檢測進行了探究，但目前仍然缺少公認的可用于評估患者預后風險和統籌治療方案相關的術前預測因素。因此，一項可基于術前檢查確定的預測因素對于指導臨床治療具有非常重要的意義。

近年來，脂肪因子與惡性腫瘤間的關聯逐漸得到證實。在外周循環中，低血清脂聯素(adiponectin，AdipoQ)水平和高瘦素(leptin，LEP)水平與部分類型惡性腫瘤的病灶數量、大小、侵襲性和分期存在相關性[4-7]，這種聯系在消化系統腫瘤、血液系統腫瘤及激素相關性腫瘤中尤為顯著。近期的研究表明，AdipoQ、LEP及其受體在尿路上皮腫瘤組織中的表達水平明顯高于正常尿路上皮細胞，且AdipoQ低表達是非肌層浸潤性膀胱癌復發的獨立危險因子，LEP高表達是肌層浸潤性膀胱癌進展的獨立危險因子[8]。同時，慢性炎癥狀態作為肥胖的標志性特征之一，可以為腫瘤細胞的侵襲和遷移提供良好的微環境。白細胞介素(interleukin，IL)-6和IL-10是炎癥誘導促癌作用的驅動者和核心參與者，并介導共同的下游信號通路。有研究表明，肥胖可增強IL-6介導的促癌信號通路[9]，預示著肥胖、炎癥和腫瘤間的密切關聯。一項納入了11 583例患者的薈萃分析表明，血清及腫瘤細胞內IL-6、IL-10高表達水平與多種惡性腫瘤的生存預后顯著相關[10-11]，并且在91%的患者中表現出高腫瘤分期和高轉移的風險[12]。

目前，針對脂肪因子與UTUC的相關性研究極少，也缺乏足夠的關于尿路上皮癌細胞中脂肪因子促癌作用的分子水平證據，僅有一項基于亞洲人群的研究表明UTUC組織中LEP受體呈高表達，并且與較差的生存預后相關[13]。本研究擬通過免疫組織化學染色測定上述各脂肪因子在UTUC組織中的表達水平，以探究其與UTUC患者臨床病理特征及預后的相關性，同時在基因表達數據庫(Gene Expression Omnibus database，GEO)中進一步驗證，以期為UTUC的診療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究中使用的組織石蠟切片取自2014年1月至2021年4月在北京大學人民醫院就診并接受手術治療的63例UTUC患者，來源于北京大學人民醫院病理科。采用免疫組織化學染色方法測定AdipoQ、LEP、IL-6、IL-10及受體AdipoR1、AdipoR2、IL-6R、IL-10RA的定量表達。本研究已獲得北京大學人民醫院醫學倫理委員會批準。同時，選擇美國紀念斯隆-凱特琳癌癥中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)基于GPL20301平臺發布的GSE134292隊列進行分析，最終納入其57例UTUC患者。

納入標準：①UTUC患者；②18歲以上的成人患者；③接受根治性腎輸尿管切除術或輸尿管節段切除術；④住院資料齊全，包括臨床體征、影像學檢查(CT或MRI)、實驗室檢查、手術相關資料及病理報告等；⑤隨訪資料完整；⑥石蠟組織切片完整。排除標準：①18歲以下未成年患者；②術后診斷為非腫瘤或其他類型腫瘤的患者；③未接受根治性手術治療，僅接受內鏡下治療或化療的患者；④住院資料缺失；⑤隨訪資料不完整；⑥石蠟組織切片中腫瘤組織不完整或免疫組織化學染色不均勻。

兩隊列中納入本研究的患者共同特征包括年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級，另外，根據既往研究、我院患者資料以及GSE134292所提供的數據，將腫瘤直徑、腫瘤多灶性納入免疫組織化學隊列分析，將腫瘤位置納入GSE134292隊列分析。

1.2 手術過程

所有腎盂腫瘤患者及部分輸尿管腫瘤患者接受根治性腎輸尿管切除術，分為腹腔鏡手術和開放手術兩類，一般采取經腹膜后入路，手術范圍包括腎、全段輸尿管及輸尿管開口周圍的部分膀胱。部分輸尿管非浸潤性腫瘤患者接受輸尿管節段切除術，均為開放手術，手術術式包括輸尿管節段切除再吻合或輸尿管末段切除膀胱再植。當臨床考慮UTUC呈侵襲性、術前影像學發現可疑淋巴結轉移或術中發現淋巴結腫大時，在根治性腎輸尿管切除術的基礎上行淋巴結清掃術(lymph node dissection，LND)，常規不進行淋巴結清掃。所有患者術前常規進行血尿常規、血生化、凝血功能、胸部X線片和心電圖等檢查，排除手術禁忌證后方可進行手術。

1.3 觀察指標

根治手術后第3個月進行第一次隨訪，術后兩年內每半年隨訪一次，兩年后每年隨訪一次，隨訪方式包括住院、門診和電話隨訪。根治手術后前兩年每半年進行一次膀胱鏡復查，兩年后每年進行一次膀胱鏡復查，同時進行血液和尿液化驗及CT或MRI檢查。對于懷疑有腫瘤遠處轉移的患者，可進行骨掃描及正電子發射計算機斷層顯像(positron emission tomography-computed tomography，PET-CT)等全身檢查。主要觀察終點包括總生存期(overall survival，OS)、無進展生存期(disease-free survival，DFS)及膀胱無復發生存期(intravesical recurrence-free survival，IVRFS)，OS定義為手術之日起到任何原因導致死亡的時間間隔，DFS定義為手術之日起到出現腫瘤復發或遠處轉移的時間間隔，IVRFS定義為手術之日起到第一次發現膀胱內腫瘤復發的時間間隔。

GSE134292數據集的評估標準：本研究中“轉錄組測序技術”所得基因表達數據標準化以TPM(transcripts per kilobase per million mapped reads)表示，在比較非肌層浸潤性腫瘤組和肌層浸潤性腫瘤組間基因表達的差異和生存分析中，以log2(TPM+1)作為基因表達量進行比較。

免疫組織化學結果的評估標準：采用H-Score對結果進行評估，其原理為利用ImageJ圖像處理軟件(version 2.0.0，Rawak Software，Germany)分割單個腫瘤細胞圖像，采用4分制評估單個腫瘤細胞的染色強度，分別為：0分(細胞不著色)、1分(細胞著淺黃色)、2分(細胞著棕黃色)、3分(細胞著棕黑色)，并計算各類陽性細胞數量所占百分比。使用公式計算H-Score=(染色強度1分細胞數量百分比×1)+(染色強度2分細胞數量百分比×2)+(染色強度3分細胞數量百分比×3)，以H-Score作為基因表達量比較免疫組織化學隊列中非肌層浸潤性腫瘤組和肌層浸潤性腫瘤組間基因表達的差異，取值范圍為0～300(圖1)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 患者基本資料

共納入免疫組織化學隊列63例UTUC患者，GSE134292隊列57例UTUC患者，患者的基線特征數據見表1。免疫組織化學隊列中，患者的平均年齡為(68.25±9.26)歲，男性38例(60.3%)，女性25例(39.7%)；非肌層浸潤性UTUC(即腫瘤分期為pTa-Tis-T1期)患者35例(55.6%)，肌層浸潤性UTUC(即腫瘤分期為T2～T4期)患者28例(44.4%)；低級別和高級別UTUC分別為15例(23.8%)和48例(76.2%)。

1， AdipoQ; 2, AdipoR1; 3, AdipoR2; 4, LEP; 5, IL-6; 6, IL-6R; 7, IL-10; 8, IL-10RA; A, low-expression; B, high-expression. AdipoQ, adiponectin; LEP, leptin; IL, interleukin; R, receptor.圖1 免疫組織化學隊列中脂肪因子及其受體染色結果(×400)Figure 1 Immunohistochemical staining result of adipokines and receptors in immunohistochemical cohort (×400)

表1 兩隊列中UTUC患者的基線臨床病理特征Table 1 Clinicopathological characteristics of UTUC patients in two cohorts

GSE134292隊列中，患者的平均年齡為(68.58±10.45)歲，男性37例(64.9%)，女性20例(35.1%)；非肌層浸潤性UTUC患者26例(45.6%)，肌層浸潤性UTUC患者31例(54.4%)；低級別和高級別UTUC分別為12例(21.1%)和45例(78.9%)。

兩組患者基線特征對比差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 不同腫瘤分期亞組中基因表達差異

根據我院患者臨床信息及GSE134292隊列中患者的相關臨床信息，將患者分為T<2組(即非肌層浸潤性腫瘤組)和T≥2組(即肌層浸潤性腫瘤組)，兩組間各脂肪因子及受體的表達水平差異見圖2～3。結果表明，免疫組織化學隊列中，AdipoQ(P=0.003 6)、AdipoR1(P=0.006 5)、LEP(P=0.007 7)、IL-10(P=0.006 9)、IL-10RA(P=0.008 9)在T≥2組(n=28)中的表達水平高于T<2組(n=35)；GSE134292隊列中，AdipoR1(P=0.000 4)、AdipoR2(P=0.000 4)、IL-6(P=0.005 0)、IL-10(P=0.001 7)、IL-10RA(P=0.008 1)在T≥2組(n=31)中的表達水平高于T<2組(n=26)。

TPM, transcripts per kilobase per million mapped reads; AdipoQ, adiponectin; LEP, leptin; IL, interleukin; R, receptor.圖2 免疫組織化學隊列中不同分期腫瘤中目的基因表達的差異Figure 2 Gene expression in different tumor stages in immunohistochemical cohort

Abbreviations as in Figure 2.圖3 GSE134292隊列中不同分期腫瘤中目的基因表達的差異Figure 3 Gene expression in different tumor stages in GSE134292 cohort

2.3 生存分析

免疫組織化學隊列中各基因表達水平以H-Score表示，GSE134292隊列中各基因表達定量以log2(TPM+1)計算，均為連續變量。利用X-tile軟件計算各目的基因對應不同預后指標的cut-off值，根據cut-off值將患者分為低表達和高表達組，進行后續生存分析。

單因素及多因素Cox回歸分析結果見表2～3。免疫組織化學隊列中63例患者的中位隨訪時間21.4個月(1.6～65.6個月)，GSE134292隊列中57例患者的中位隨訪時間30.3個月(0.1～143.7個月)。

表2 免疫組織化學隊列中單因素和多因素Cox分析Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis in immunohistochemical cohort

表3 GSE134292隊列中單因素和多因素Cox分析Table 3 Univariate and multivariate Cox regression analysis in GSE134292 cohort

OS：隨訪期間，免疫組織化學隊列中共有12例(19.0%)患者死亡，中位生存時間為20.3個月(IQR：12.4～41.0)。單因素Cox回歸分析顯示，分期(P=0.046，HR=6.669，95%CI：1.020～54.223)是OS的預測因素。GSE134292隊列中共有19例(33.3%)患者死亡，中位生存時間為30.7個月(IQR：12.1～50.5)。多因素Cox回歸分析顯示，分期(P=0.043，HR=4.330，95%CI：1.047～17.905)是OS的獨立預測因素。

DFS：隨訪期間，免疫組織化學隊列共有32例(50.8%)患者出現疾病進展，中位生存時間7.4個月(IQR：4.9～12.6)。多因素Cox回歸分析顯示，分期(P=0.001，HR=13.962，95%CI：3.159～61.710)是DFS的獨立預測因素。GSE134292隊列中共有43例(75.4%)患者出現疾病進展，中位生存時間7.0個月(IQR：3.8～10.3)。多因素Cox回歸分析顯示，各基線特征與基因表達水平均不是DFS的獨立預測因素。

IVRFS：隨訪期間，免疫組織化學隊列共有29例(46.0%)患者出現膀胱內復發，中位生存時間6.8個月(IQR：4.9～10.6)。Kaplan-Meier生存曲線表明，IL-10RA低表達具有更差的IVRFS(log-rankP<0.05，圖4)。多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤分期(P=0.001，HR=14.418，95%CI：3.292～63.149)和IL-10RA(P=0.044，HR=0.996，95%CI：0.992～0.998)是IVRFS的獨立預測因素。GSE134292隊列中共有30例(52.6%)患者出現膀胱內復發，中位生存時間7.5個月(IQR：4.2～10.3)。Kaplan-Meier生存曲線表明，IL-10RA低表達具有更差的IVRFS(log-rankP<0.05，圖4)。多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤位置(P=0.046，HR=2.491，95%CI：1.014～6.115)和IL-10RA(P=0.014，HR=0.515，95%CI：0.304～0.873)是IVRFS的獨立預測因素。

IL, interleukin; R, receptor; IVRFS, intravesical recurrence-free survival.圖4 免疫組織化學隊列(A)與GSE134292隊列(B)中IL-10RA的IVRFS生存曲線Figure 4 Kaplan-Meier survival curve of IL-10RA for IVRFS in immunohistochemical cohort (A) and GSE134292 cohort (B)

3 討論

既往研究表明，與歐美人群相比，亞洲人群具有高分級腫瘤和輸尿管腫瘤比例高的特點，本研究中兩組患者的基線特征數據無顯著差異，可能與樣本量較小有關。免疫組織化學隊列中，AdipoR1、IL-10及IL-10RA在高分期腫瘤中的表達水平高于低分期腫瘤，這一發現在GSE134292隊列中得到驗證，表明AdipoQ和IL-10及其受體可能參與腫瘤進展過程。此外，免疫組織化學結果表明，AdipoQ和LEP在高分期腫瘤組中呈高表達，但在GSE134292隊列中未得出類似結果，可能與GSE134292隊列中上述脂肪因子轉錄水平數據部分缺失，僅有13例(22.8%)AdipoQ數據及30例(52.6%)LEP數據相關。在Kaplan-Meier生存曲線及多因素Cox分析中，兩隊列結果均表明IL-10RA高表達是UTUC患者術后IVRFS的保護性因素，表明IL-10及其受體在UTUC復發過程中發揮重要作用。

GSE134282轉錄組測序數據及免疫組織化學染色均證明UTUC組織中表達AdipoR1，并在肌層浸潤性腫瘤中的表達水平高于非肌層浸潤性腫瘤。多項研究結果顯示，腫瘤組織中表達AdipoR1，如Kashiwagi等[8]發現，AdipoR1在膀胱癌組織中的表達水平與正常尿路上皮相比顯著升高，但與臨床病理特征無顯著相關性。AdipoQ與AdipoR1結合后主要激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路，進而抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、Janus kinase (JAK)/信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription, STAT)等促癌通路。近年來也有證據表明，AdipoQ通過非AMPK通路調節AdipoR1相關的神經酰胺酶活性[14]，神經酰胺酶產物S1P可促進細胞增殖和存活、血管生成和細胞遷移。在體外實驗中，AdipoQ與T-鈣黏蛋白和AdipoR1/R2結合后都表現出促進內皮細胞遷移和增殖的作用[15]。AdipoR1表達的調節機制尚不明確，有研究表明，長鏈非編碼RNA-ANRIL可抑制AdipoR1的表達及后續AMPK的磷酸化水平[16]。AdipoQ/AdipoR1/AdipoR2的表達水平與腫瘤預后的關系目前尚不明確，Chou等[17]發現，約80%腎細胞癌和膀胱癌組織表達AdipoR1，但在癌及癌旁組織對比中，AdipoR1/2及其mRNA表達均無顯著差異，與腫瘤預后也未發現顯著相關，AdipoQ及其受體的預測價值仍需進一步探究。

目前研究認為IL-10在腫瘤進展中發揮雙重性作用，IL-10與IL-10RA/IL-10RB結合后形成受體復合物，激活JAK/酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2, TyK2)并介導STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化和激活，進而促使STAT3核易位及后續多種促癌基因和抗凋亡基因表達[10]。在IL-10激活IL-10RA及后續JAK通路的過程中，需要募集磷酸化Src蛋白以啟動JAK通路的激活，有研究發現這一過程增強Src介導的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的表達，進而促進腫瘤形成[18]。Qian等[19]發現，IL-10在肝細胞癌中的表達高于癌旁組織，是肝細胞癌患者生存的危險因素，且IL-10高表達可抑制PD-L1表達。Hsu等[18]也同樣發現IL-10在肺癌腫瘤細胞及血清中高表達，并與較差的生存預后相關。Satyam等[20]的研究發現，包括IL-10在內的Th2細胞因子濃度在膀胱癌患者血清中顯著升高，由于尿路上皮癌位置的特殊性，也針對尿液中的IL-10水平進行了探究。Agrawal等[21]通過酶聯免疫吸附試驗定量檢測尿液中IL-10濃度，結果表明IL-10高水平與腫瘤分期、分級及復發風險相關。Cai等[22]研究了65例膀胱癌經尿道膀胱腫瘤切除術患者術前及術后的尿液IL-6/IL-10比值水平，發現尿液IL-6/IL-10比值是膀胱癌復發的獨立預測因素。

也有大量證據表明，IL-10直接作用于自然殺傷(natural killer，NK)細胞和細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導的抑癌作用，或作為抗炎因子通過抑制抗原呈遞細胞中主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ、共刺激分子及促炎細胞分子的表達實現對炎癥反應的抑制[10]。Mannino等[10]認為在惡性腫瘤細胞形成早期，IL-10主要介導NK細胞和CTL細胞發揮細胞殺傷作用，而當癌細胞發育成熟自身表達出IL-10R時，腫瘤微環境中的IL-10則轉變為發揮促癌作用。除腫瘤浸潤性巨噬細胞和淋巴細胞可釋放大量的IL-10外，腫瘤細胞也可通過自分泌方式促進自身增殖。有研究表明，部分腫瘤細胞所表達的IL-10R水平顯著高于周圍基質，且與不良的生存預后相關[23]。結合上述研究及本研究結果，我們猜測IL-10可通過介導細胞殺傷作用對早期腫瘤細胞增殖進行抑制，對于膀胱內復發是保護性因素。IL-10所發揮的雙重性作用可能受微環境中免疫細胞及其他細胞因子的調節，具體機制仍需進一步探究。目前仍缺少證明IL-10R在腫瘤細胞中表達的足夠證據，本研究結果顯示UTUC組織表達IL-10較少，可表達IL-10RA，需要進一步與癌旁組織表達水平的對比以探究其相關性。值得注意的是，有研究表明AdipoQ/AdipoR1可介導人調節性T細胞(Tregs)分泌IL-10，這可能意味著AdipoQ也參與Th2免疫反應過程[24]。

本研究存在局限性，研究受限于臨床資料的回顧性收集、較小的樣本量及結局事件數，可能存在Ⅱ類誤差；缺乏腫瘤組織與癌旁組織基因表達水平的對比。同時，血清及尿液中AdipoQ和IL-10的濃度測定可為進一步探究脂肪因子的作用機制提供依據，進一步擴大樣本量、前瞻性入組患者將作為我們未來工作的主要內容。