弱絮凝性下面啤酒酵母菌株的選育

劉小航，阮玉磊，宿萌，付曉芬，賀秀麗，郭立蕓，武曉樂,2，郭學武,2，肖冬光,2，陳葉福,2*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(工業發酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學)，天津，300457) 3(北京燕京啤酒股份有限公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京，101300)

在啤酒工業中，啤酒酵母菌株的絮凝能力是評價啤酒酵母菌株優劣的一個重要指標[1]。在啤酒主發酵結束前，強絮凝性酵母對酵母泥分離回用有利，但若酵母提前絮凝，則會引起發酵遲緩或停滯，最終嫩啤酒含糖量高，風味不理想。此外，絮凝太完全也會降低嫩啤酒中的酵母數，影響二次發酵等后熟進程[2-5]。選育弱絮凝性啤酒酵母菌株可達到延長酵母增殖穩定期，降低啤酒中乙醛含量，提升風味質量等目的。

研究顯示，涉及到啤酒絮凝性相關研究多為強絮凝性酵母菌株選育，弱絮凝性啤酒酵母育種實例較少。張建早等[6]先通過甲基磺酸乙酯誘變后利用連續培養方法對酵母進行馴化，得到了1株突變株S16，其絮凝能力比出發菌株提高了2.21倍。隨著絮凝相關遺傳機制不斷清晰，基因工程和代謝工程手段不斷豐富，通過分子操作可有效調控酵母的絮凝特性[7-8]，如通過不同啟動子控制絮凝基因的表達，可成功對絮凝時機和強度進行控制[9]。但當前由于消費者和行業本身負面態度，通過基因工程手段育種在食品行業仍難以被接受[10]。目前酵母育種途徑多樣，相比于傳統物理化學誘變選育等方法，常壓室溫等離子體誘變(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)以操作簡便、安全性高等優勢在微生物遺傳與育種領域上備受青睞[11-12]。WANG等[13]以KF-7為出發株，通過ARTP結合基因組改造和雜交策略，獲得1株耐多種脅迫的絮凝工業釀酒酵母菌株E-158。馮鵬鵬等[14]以工業酵母680bg為出發株進行ARTP誘變，獲得誘變菌株ARTP-162，其高級醇產量比出發株降低了約21%，且其他基本發酵性能無太大變化。

本研究以下面啤酒酵母L-1為出發菌株，對其進行ARTP誘變，并結合優化后的絮凝能力檢測方法對誘變菌株進行初篩與二輪復篩，以期篩選出絮凝能力減弱且其他發酵性能較優、遺傳性能較穩定的菌株，為后續工業啤酒酵母的選育和投入到工業啤酒的生產應用奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑

啤酒酵母菌株L-1，由北京燕京啤酒股份有限公司提供。

冰乙酸，天津化學試劑一廠；醋酸鈉，天津大茂化學試劑廠；次甲基藍，天津百世化工有限公司；CaSO4，天津市風船化學試劑科技有限公司；水合茚三酮、乙醛標準品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；麥芽糖標準品、麥芽三糖標準品，大連美侖生物技術有限公司。

1.1.2 培養基

麥芽汁培養基：14°P 麥芽汁，由北京燕京啤酒股份有限公司提供；CaSO4緩沖液：將6.80 g醋酸鈉、0.51 g CaSO4、4.05 g冰乙酸溶于1 L蒸餾水中，調節pH至4.5。

1.1.3 儀器與設備

ARTP-Ⅱ型誘變儀，北京思清源生物科技有限公司；ZXJD-A1270生化培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；Agilent 7890C氣相色譜儀、Agilent 1100 液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-1200型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；BX43 型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ARTP誘變

將L-1菌株培養至對數前中期并對其進行誘變，誘變過程及儀器參數參考文獻[14]。

1.2.2 啤酒發酵實驗

1.2.2.1 種子液擴培

一級種子液：取1環酵母菌株，接種于含5 mL 14°P麥汁的試管中，25 ℃靜置培養12 h。二級種子液：將一級種子液接種至含45 mL 14°P麥汁的250 mL三角瓶中，25 ℃靜置培養24 h。三級種子液：將二級種子液接種至含250 mL 14°P麥汁的500 mL三角瓶中，25 ℃靜置培養24 h。

1.2.2.2 啤酒發酵

初篩：將二級種子液離心后按1.6×107CFU/mL 的接種量接種至含70 mL 14°P麥汁的大試管中(規格為：30 mm×200 mm)，10 ℃靜置培養4 d。第一輪復篩：發酵體系與接種量同于初篩，培養時間由4 d增至7 d，每個樣品3個平行。第二輪復篩：將三級種子液離心后并用無菌水洗滌1次獲得菌泥，按1.6×107CFU/mL的接種量接種至含有900 mL 14°P麥汁的1 L量筒，10 ℃靜置培養，每個樣品3個平行。

1.2.3 絮凝能力的檢測

將ASBC(American Society of Brewing Chemists)吸光度法[15]進行優化后對酵母菌株的絮凝能力進行檢測。將發酵液混勻，分別取相同菌濃度(OD600值為6.5～7)發酵液于15 mL離心管，記為A、B;A管離心取沉淀，分別移取9 mL 蒸餾水和1 mL 250 mmol/L EDTA(pH=4.5)，使菌泥懸浮且振蕩混勻，取1 mL懸液稀釋10倍，測OD600并將該值記為ODA；B管離心取沉淀，先加10 mL 0.051%CaSO4溶液懸洗菌泥后并離心取沉淀，之后再加CaSO4緩沖液洗滌，渦旋振蕩器上振蕩15 s后離心管豎直放置6 min。取1 mL頂部液體稀釋3倍，測OD600并將該值記為ODB。絮凝值F按公式(1)計算：

(1)

式中：F，酵母菌株的絮凝能力，%；ODA，對A管處理后所測得的OD600值；ODB，對B管處理后所測得的OD600值

1.2.4 啤酒酵母死亡率的測定

使用次甲基藍染色法[16]測定酵母細胞死亡率。

1.2.5 α-氨基氮含量的測定

根據茚三酮顯色法[17]對發酵液中游離的α-氨基氮進行測定。

1.2.6 糖類含量的測定

使用液相色譜法測定發酵液中主要糖類含量[18]。

1.2.7 真正發酵度和酒精度的測定

根據GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》測定。

1.2.8 風味物質含量的測定

使用氣相色譜儀對蒸餾后的發酵液中風味物質進行測定。

氣相色譜條件：色譜柱Agilent CP-WAX(50 m×250 μm×0.25 μm)，載氣為高純氮氣(>99.999%)；柱流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度148.8 ℃；程序升溫：起始溫度35 ℃，保持1 min，以3 ℃/min 升至70 ℃，保持15 min, 再以3.5 ℃/min 升至190 ℃，保持22 min；進樣體積1 μL；分流進樣，分流比30∶1。

1.2.9 誘變菌株的遺傳穩定性實驗

將誘變菌株于麥芽汁斜面培養基中連續15次傳代培養，挑取第1、5、15代菌株，通過1 L量筒發酵檢測其絮凝能力及其他各項性能的穩定性。

2 結果與分析

2.1 ARTP 誘變條件的確定

將出發株L-1培養至對數成長前中期，對其進行ARTP誘變并繪制致死曲線，結果如圖1所示。隨著誘變時長的增加，酵母細胞的致死率也隨之提高：誘變時間為40 s時，酵母細胞的致死率為90.9%，誘變時間為55 s時，酵母細胞的致死率為100%，因此選定40 s作為誘變的處理時間。

圖1 ARTP誘變L-1的致死率曲線Fig.1 Lethal curve of L-1 induced by ARTP

2.2 誘變菌株的篩選

2.2.1 弱絮凝性菌株的初篩

將出發株L-1進行ARTP誘變40 s后稀釋涂布于平板中(確保每個平板所長出來單菌落個數約為100個)。為獲得生長性能良好的誘變株，從平板上共近4 000個單菌落中挑選出630個形態較大且邊緣較為光滑的單菌落。此后將630株誘變株同出發株L-1分成15批次，置于大試管培養4 d后，對其絮凝能力進行檢測，所得絮凝值頻數分布結果如圖2所示。相比于L-1絮凝能力而言，有413株誘變株的絮凝能力未得到大幅度改變(增幅或降幅小于10%)，而所獲弱絮凝性誘變株個數較少，其中誘變株絮凝能力降幅大于5%的有82株，因此選擇此82株誘變株進入到后續的復篩過程中。

圖2 初篩菌株的絮凝值頻數分布圖Fig.2 Frequency distribution diagram of flocculation value of primary screening strains注：絮凝值比值=誘變株絮凝值/出發株L-1絮凝值

2.2.2 誘變菌株的第一輪復篩

因獲得的誘變菌株較多，且在初篩時未做平行，故將82株弱絮凝性初篩菌株進行第一輪復篩，同時增測死亡率這一指標。值得說明的是，在初篩中，培養4 d后各發酵液中CO2的累計排放量少，說明此時發酵液中仍有較多可發酵性糖未被消耗，基于此現象結合已有的文獻報道[19]，猜測這也許會導致初篩中絮凝能力指標的測定誤差較大。為此，在第一輪復篩中，將培養時間增至為7 d。

2.2.2.1 絮凝能力的測定

第一輪復篩實驗所測絮凝能力結果如圖3所示，同樣的，選擇絮凝能力降幅大于5%的誘變菌株進入到第二輪次復篩中，在第一輪復篩中，獲得了50株弱絮凝性第一輪復篩株。除菌株73外，大部分菌株絮凝能力相比于L-1降低了約6%～10%。

圖3 誘變菌株絮凝能力的第一輪復篩結果Fig.3 Flocculation ability of mutagenic strains in first re-screening

2.2.2.2 死亡率的測定

發酵結束時，將50株弱絮凝性第一輪復篩株酵母泥進行收集并測定其死亡率，結果如圖4所示。在大試管體系發酵中，大部分弱絮凝性第一輪復篩株的死亡率低于L-1，同時由于死亡率較高的菌株310在前階段發酵實驗中均表現出較好的發酵性能，考慮到實驗的誤差較大，為此選取死亡率降幅較大的35株弱絮凝性第一輪復篩株和菌株310，進行第二輪量筒復篩。

圖4 誘變菌株死亡率的第一輪復篩結果Fig.4 Mortality of mutagenic strains after first re-screening

2.2.3 誘變菌株的第二輪復篩

對獲得的36株弱絮凝性第一輪復篩株進行第二輪復篩，并在主酵結束時對酵母泥的絮凝能力、死亡率、發酵液中α-氨基氮、主要糖類及風味物質的含量等指標進行檢測。由于菌株數目較多及發酵體系的擴大，采用三批次獨立的實驗來完成第二輪復篩。在三批次獨立的實驗中，由于第一批次發酵時長為9 d，考慮到發酵時間較長，在不改變絮凝能力等指標有效檢測時機條件下，將第二、三批二輪復篩主酵時長調為7 d。

2.2.3.1 絮凝能力的測定

在量筒發酵主酵結束時，對各菌株進行絮凝能力的檢測，各批次絮凝能力誤差較小，所得結果如圖5所示。在第二輪復篩中，36株第二輪復篩株的絮凝能力相比于L-1降低了2%～8%。

圖5 誘變菌株絮凝能力的第二輪復篩結果Fig.5 Flocculation ability of mutagenic strains in second re-screening

2.2.3.2 死亡率的測定

在量筒發酵主酵結束時，將36株弱絮凝性第二輪復篩株酵母泥進行收集并測定其死亡率，結果如圖6所示。L-1的死亡率為2.45%，相比于出發株，除了菌株310的死亡率(4.41%)有了較大幅度的提升以外，其余各誘變菌株的死亡率均有了不同程度的降低。

圖6 誘變菌株死亡率的第二輪復篩結果Fig.6 Mortality of mutagenic strain after second re-screening

2.2.3.3 α-氨基氮含量的測定

發酵液游離的α-氨基氮是影響啤酒中高級醇含量與啤酒質量的關鍵因素之一，因此，啤酒酵母消耗α-氨基氮能力也是評價優質酵母的重要指標之一，為此通過測定主酵結束時發酵液中游離的α-氨基氮含量來判斷各菌株消耗α-氨基氮的能力。

在第二輪復篩時，對發酵液中α-氨基氮含量差異較大。在第一批主酵9 d時(圖7-a)，L-1發酵液中α-氨基氮含量為57.87 mg/L，菌株310發酵液中α-氨基氮含量為43.28 mg/L，相比于L-1降低了25.21%，說明菌株310消耗α-氨基氮的能力強于L-1。相比于第一批實驗，第二、三批主酵7 d時發酵液中的α-氨基氮含量均有了較大幅度的提升。在第二批二輪復篩中(圖7-b)，L-1發酵液中α-氨基氮含量為89.27 mg/L，菌株179發酵液中α-氨基氮含量為68.28 mg/L，相比于L-1降低了23.51%，說明菌株179消耗α-氨基氮的能力強于L-1。在第三批二輪復篩中(圖7-c)，L-1發酵液中α-氨基氮含量為88.2 mg/L，菌株450發酵液中α-氨基氮含量為121.3 mg/L，相比于L-1提高了37.53%，說明除菌株450外，其他各誘變株消耗α-氨基氮的能力均不弱于L-1。

a-第一批；b-第二批；c-第三批圖7 第二輪復篩α-氨基氮含量測定結果Fig.7 Determination results of α-amino nitrogen content in the second re-screening.

2.2.3.4 主要糖類含量的測定

啤酒酵母消耗碳源能力是評價優質酵母的重要指標之一。理論上在相同時間內，消耗碳源能力越強的酵母，會產生更多乙醇。為此通過測定主酵結束時發酵液中主要糖類的含量來判斷各菌株消耗碳源的能力。

在第二輪復篩時，對發酵液中主要糖類的含量如圖8所示，同時由于在主酵7和9 d時，發酵液中的果糖及葡萄糖幾乎消耗完全，故未呈現。在第一批主酵9 d時，L-1發酵液中麥芽糖與麥芽三糖含量分別為10.89、11.09 g/L，低于各誘變株。菌株經誘變后，碳源消耗能力不強于出發菌株L-1。在第二批主酵7 d時，L-1發酵液中麥芽糖與麥芽三糖含量分別為21.79、13.36 g/L，菌株179發酵液中的麥芽糖與麥芽三糖含量分別為19.52、10.95 g/L，由此可知菌株179消耗碳源的能力稍強于L-1。在第三批主酵7 d時，L-1發酵液中麥芽糖與麥芽三糖含量分別為26.66、14.35 g/L，菌株361發酵液中的麥芽糖與麥芽三糖含量分別為20.74、12.98 g/L，293的發酵液中麥芽糖與麥芽三糖含量分別為18.68、12.42 g/L，由此可知菌株293與361消耗碳源的能力稍強于L-1。

a-第一批；b-第二批；c-第三批圖8 第二輪復篩麥芽糖與麥芽三糖含量測定結果Fig.8 Content of maltose and maltotriose in the second re-screening

2.2.3.5 真正發酵度與酒精度的測定

主酵結束后測定了L-1及各誘變株的酒精度和真正發酵度，結果見表1～表3。

表1 第一批二輪復篩酒精度與真正發酵度測定結果Table 1 Alcohol content and true fermentation degree of the first batch of second re-screening

由表1可知，在第一批主酵9 d時，L-1酒精度為3.74%，真正發酵度為57.91%，以L-1為對照，除菌株25、571、692、672、7外，其余各誘變株的此兩項指標均有不同程度的提升，其中菌株7的基本發酵性能明顯弱于出發株L-1。

由表2可知，在第二批主酵7 d時，L-1酒精度為2.82%，真正發酵度為47.14%，以L-1為對照，菌株353、446、179、906此兩項指標均有不同程度的提升。

表2 第二批二輪復篩酒精度與真正發酵度測定結果Table 2 Alcohol content and true fermentation degree of the second batch of second re-screening

由表3可知，在第三批主酵7 d時，L-1酒精度為2.78%，真正發酵度為40.85%，以L-1為對照，除菌株450外，其余各誘變株的此兩項指標均有不同程度的提升。

表3 第三批二輪復篩酒精度與真正發酵度Table 3 Alcohol content and true fermentation degree of the third batch of second re-screening

2.2.3.6 風味物質含量的測定

啤酒主酵結束后，檢測了各誘變株及L-1發酵液中主要的風味物質。由表4可知，在第一批主酵7 d時，以L-1為對照，除菌株672與692外其余各突變株發酵液中的乙醛含量有了不小程度的提升，各主要高級醇含量變化差異不明顯。

表4 第一批二輪復篩各菌株主要風味物質 單位：mg/L

由表5可知，在第二批主酵7 d時，菌株179發酵液中的乙醛與異戊醇等物質含量均低于L-1。

表5 第二批二輪復篩各菌株主要風味物質 單位：mg/L

由表6可知，在第三批主酵7 d時，菌株293、361發酵液中的乙醛含量明顯低于L-1，而主要高級醇含量無明顯變化。

表6 第三批二輪復篩各菌株主要風味物質 單位：mg/L

2.3 目的菌株遺傳穩定性實驗

在前階段初篩與二輪復篩實驗中，基于誘變菌株的絮凝能力、死亡率、消耗碳源與α-氨基氮能力、基本發酵能力以及對應的發酵液中風味物質的含量等一系列指標，挑選出了3株性能優良的目的菌株進行遺傳穩定性分析。如表7所示，隨著傳代次數的增加，目的菌株絮凝能力、死亡率及對應的發酵液中主要風味物質含量沒有太大的變化，表明了該3株目的菌株遺傳性能較為穩定。

表7 目的菌株遺傳穩定性分析實驗Table 7 The genetic stability analysis experiment of the target strain

3 結論

在啤酒行業中，良好絮凝能力的啤酒酵母決定著啤酒高質量的生產。近年來，ARTP誘變育種在食品領域仍是較熱門的誘變育種方法。本研究以L-1為出發菌株對其進行ARTP誘變并獲得630株誘變株，結合優化的絮凝能力檢測方法，通過大試管與1 L量筒體系進行初篩與第一、二輪次復篩，得到了179、293、361三株目的菌株，相比于出發菌株L-1，3株目的菌株絮凝能力分別降低了6.67%、6.67%和5.56%，死亡率分別降低了31.21%、34.57%和16.93%。同時其對應發酵液中乙醛含量均有不同幅度的降低，降幅分別為19.53%、19.17%和15.83%，此外，3株目的菌株的基本發酵性能也有不同幅度的提升，其對應的發酵液中高級醇含量變化不大，篩選出的菌株具有一定的實際應用潛力。