促進釀酒酵母在溶液體系中分散的研究

陳翔宇，李雪松，徐娟，李蒙蒙，林麗軍，陸利霞，劉元建，熊曉輝

(南京工業大學 食品與輕工學院，江蘇 南京，211800)

在一定條件下微生物細胞團聚在一起形成穩定、連續的多細胞聯結現象稱為微生物聚集[1]。微生物的聚集現象在自然界中廣泛存在，如釀造行業中的酵母細胞的絮凝現象[2]，廢水處理中以絮體污泥、生物被膜和顆粒污泥3種形態存在的微生物聚集體[3]，某些原生動物和單細胞藻類也具有絮凝或聚集現象[4]。生理上，聚集是微生物對不利環境采取的策略，如釀酒酵母形成絮凝后提高了對乙醇的耐受性[5]，丁香假單胞菌細胞聚集體更能耐受環境脅迫[6]，在干燥表面形成聚集(生物膜)的鮑曼不動桿菌存活時間更長[7]，聚集的金黃色葡萄球菌對紫外線的耐受性顯著高于非聚集型菌株[8]。

微生物聚集對其抗逆過程有著重要影響，但在微生物計數方面卻帶來了困難，尤其是微生物的直接計數過程，如平板計數法、顯微鏡計數法、圖像計數法、流式細胞儀法等，導致對微生物細胞計數的低估[9]。所以探索有效的促進微生物在水溶液中的分散方法，對微生物計數有著重要意義。

本文以釀酒酵母為研究對象，從分散指數和分布類型角度，研究了不同分散方法對釀酒酵母細胞在水溶液中分散效果的影響，并進行正交優化實驗，得到優化的分散條件，旨在為微生物細胞在溶液中的分散提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ATCC 9080，本實驗室保藏菌株。

1.1.2 試劑

0.01 mol/L PBS(pH=7.0)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，上海生工生物工程有限公司；吐溫-20，國藥集團化學試劑有限公司；酵母膏胨葡萄糖(yeast peptone dextrose，YPD)液體培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA)，青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

BM1000生物顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；SHP-100智能生化培養箱，上海三發科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒酵母培養過程中的生長及分散情況

種子液的培養：從平板中挑取釀酒酵母單菌落，接種于100 mL YPD培養液中，于30 ℃、160 r/min培養16 h后，得到種子液。

釀酒酵母生長變化：接種0.5 mL種子液于50 mL YPD培養液的150 mL錐形瓶，于30 ℃、160 r/min培養18 h。從0 h開始，每隔3 h取培養液，1 500 r/min離心5 min，用同體積無菌PBS重懸后，在光學顯微鏡下觀察釀酒酵母形態及分散情況，并用血球計數板測定細胞濃度。

1.3.2 釀酒酵母菌體的分散

1.3.2.1 釀酒酵母細胞分散指數測定

取培養至16 h的釀酒酵母菌液，在1 500 r/min離心5 min，菌泥用PBS洗滌1次后，將細胞濃度稀釋至106個/mL，再次離心后，1份菌泥用0.01 mol/L PBS重懸作為對照組，另一份進行分散處理，用血球計數板分別測定分散處理前后的釀酒酵母細胞數量。細胞分散指數的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：I，細胞分散指數；T1，加入分散劑釀酒酵母血球計數板5個中格細胞總數，T0，對照組釀酒酵母血球計數板5個中格細胞總數。

1.3.2.2 釀酒酵母分散處理單因素實驗

(1)吐溫-20對釀酒酵母分散性的影響

在無菌PBS中分別加入體積分數為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的吐溫-20，經0.22 μm濾膜過濾后得到不同濃度的PBST2(PBS-吐溫-20)溶液。取培養至16 h的釀酒酵母菌液，用0.01 mol/L PBS稀釋至細胞濃度為106個/mL，1 500 r/min離心5 min后，菌泥以不同濃度的PBST2重懸，放置15 min后，用血球計數板對不同處理組的釀酒酵母進行計數，計算不同濃度吐溫-20處理的釀酒酵母分散指數。

(2)EDTA對釀酒酵母分散性的影響

取培養至16 h的釀酒酵母菌液，1 500 r/min離心5 min，用無菌PBS洗滌并稀釋至細胞濃度為106個/mL，再次離心后，以2、4、6、7、8、9、10、12 mmol/L的無菌PBS-EDTA緩沖液重懸，用血球計數板對不同處理組的釀酒酵母進行計數，計算不同濃度EDTA處理的釀酒酵母分散指數。

(3)離子強度對釀酒酵母分散性的影響

取培養至16 h的釀酒酵母菌液，于1 500 r/min離心5 min，用無菌PBS洗滌并稀釋至細胞濃度為106個/mL，再次離心后分別以0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 mol/L的無菌PBS重懸后，用血球計數板對不同處理組的釀酒酵母進行計數，以0.01 mol/L PBS處理組為對照組，計算不同離子強度條件下的釀酒酵母分散指數。

(4)pH對釀酒酵母分散性的影響

配制pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的無菌PBS。取培養至16 h的釀酒酵母菌液，用無菌PBS洗滌并稀釋至細胞濃度為106個/mL，以不同pH的PBS重懸后，用血球計數板對不同處理組的釀酒酵母進行計數，pH 7.0為對照組，計算不同pH條件下的釀酒酵母分散指數。

(5)超聲波處理對釀酒酵母分散性的影響

取培養至16 h的釀酒酵母菌液，用無菌PBS洗滌并稀釋至細胞濃度為106個/mL，置于低頻超聲波(50 Hz)中分別處理5、10、15、20、30、40、45、50、60 s后，用血球計數板對不同處理組的釀酒酵母進行計數，未處理組為對照組，計算不同超聲波處理時間條件下的釀酒酵母分散指數。

1.3.3 釀酒酵母活性測定

對分散處理后的釀酒酵母菌液依據GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》進行濃度測定，分析不同處理對釀酒酵母活性的影響。

1.3.4 釀酒酵母分散效果正交優化試驗

根據單因素試驗的結果，選擇對釀酒酵母分散影響顯著的因素，確定正交試驗及其水平，進行正交試驗設計，考查其對釀酒酵母細胞分散的影響，對其結果進行優化，比較分析后得出最優分散組合。

1.3.5 釀酒酵母分散處理前后在溶液中分布類型分析

對不同分散處理前后的釀酒酵母菌液，在顯微鏡下隨機計數20個視野內的細胞數[10]，分析分散處理對釀酒酵母在溶液中分布類型的影響。

1.4 數據分析方法

采用Excel 2019進行數據整理，利用Origin 2021分析與作圖，利用SPSS 26對數據進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。每個處理組設置3個平行，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母的培養過程觀察

由圖1可知，隨著培養時間的增加，釀酒酵母細胞濃度逐漸變大，細胞之間的聚集越來越多，當培養時間達到9 h，細胞濃度為1.7×108個/mL時，觀察發現釀酒酵母細胞聚集在一起(圖1-c)，表明隨著培養時間延長，細胞濃度增大，細胞聚集加重。在YPD中進行好氧培養時，釀酒酵母以出芽的方式繁殖。由于營養充分，釀酒酵母細胞連續出芽形成呈藕節狀的假菌絲(圖1-b)；若出現不同方向的出芽繁殖，會形成分支假菌絲(圖1-d)。

通過對不同培養階段中假菌絲的觀察，在培養時間為0～12 h，營養充足的條件下，釀酒酵母細胞由單細胞出芽繁殖形成假菌絲形態，并且隨著培養時間的增加，酵母細胞增殖速度加快，組成假菌絲細胞串中的細胞數越來越多。當培養進入穩定期(12～18 h)，由于培養液中營養成分消耗以及細胞密度過大(圖1-f)，釀酒酵母細胞增殖速度減緩，細胞逐漸從假菌絲串脫落。當培養時間為15 h時(圖1-e)，觀察到視野中假菌絲基本消失，雖是稀釋10倍條件下，但細胞聚集仍然存在。在分析釀酒酵母分散性的過程中，為排除假菌絲形成的聚集對結果判斷的影響，選用培養時間為16 h的細胞進行實驗。

a-培養0 h形態;b-培養6 h形態；c-培養9 h形態；d-培養9 h稀釋10倍形態；e-培養15 h稀釋10倍形態；f-釀酒酵母細胞濃度圖1 YPD培養基中釀酒酵母好氧培養形態及細胞濃度Fig.1 Morphology and cell density of S.cerevisiae by YPD broth in aerobic culture

2.2 酵母細胞分散單因素實驗

2.2.1 不同濃度吐溫-20對釀酒酵母分散影響

由圖2可得，與對照組相比，吐溫-20處理的釀酒酵母分散指數增大，說明加入吐溫-20后釀酒酵母細胞的聚集得到了改善。當吐溫-20濃度為0.4%時，釀酒酵母分散指數為0.12，此后隨著吐溫-20濃度增大，分散指數無顯著性差異(P>0.05)，即濃度為0.4%～1%的吐溫-20對釀酒酵母均有較好促分散效果。實驗中發現增大吐溫-20濃度會產生較多泡沫，因此選擇0.4% 吐溫-20用于釀酒酵母促分散。

圖2 不同濃度吐溫-20對釀酒酵母分散指數的影響Fig.2 Effect of different concentrations of tween 20 on the dispersion index of S.cerevisiae注：不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)(下同)

釀酒酵母細胞壁由β-葡聚糖、甲殼素和甘露糖蛋白的纖維外層組成，這些成分的性質決定了的釀酒酵母的絮凝性[11]，尤其是細胞壁中的黏附分子影響細胞表面的疏水性[12-13]，釀酒酵母絮凝能力與細胞表面疏水性呈正相關[14]。吐溫-20作為一種非離子型表面活性劑，分子中含有較多的親水性基團，所以加入吐溫-20可能影響釀酒酵母細胞的表面疏水性，從而促進聚集細胞的分散。廢水的生物處理過程中，會使用TX-30、曲拉通X-100等表面活性劑從活性污泥中剝離微生物，表面活性劑將影響微生物分散性的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)分散到水相中，從而將活性污泥中的微生物分散出來[15]。而酵母菌的EPS相對于細菌合成產量更高[16]，并且參與凝膠狀網絡(生物膜)的形成，使細胞聚集在一起從而發揮保護功能[17]。所以，加入吐溫-20可能也會減少釀酒酵母細胞壁表面的EPS含量，從而達到分散細胞的效果。

2.2.2 不同濃度EDTA對釀酒酵母分散影響

由圖3可知，隨著EDTA濃度的增加，釀酒酵母的分散指數先呈現明顯的增加趨勢(P<0.05)，在EDTA濃度為8 mmol/L時分散指數為0.16，此后變化不顯著(P>0.05)。與對照組相比，EDTA對釀酒酵母細胞的分散有顯著效果(P<0.05)，且當EDTA濃度達到8～12 mmol/L，分散效果達到最佳。

圖3 不同濃度EDTA對釀酒酵母分散指數的影響Fig.3 Effect of EDTA concentration on the dispersion index of S.cerevisiae

釀酒酵母中，促進絮凝的一系列蛋白統稱為絮凝素，其中有一類蛋白由Flo1、Flo5、Flo9和Flo10組成，該蛋白與氨基酸序列有較高相似性，并能識別細胞表面的甘露糖殘基以促進絮凝[18-19]。陽離子在釀酒酵母絮凝過程中起著核心作用，其中Ca2+是影響較顯著的離子，且能促進絮凝素形成活性構象?；钚孕跄嘏c相鄰細胞壁上的甘露糖殘基識別并相互作用形成聚集[20]，隨著細胞聚集導致絮凝現象。EDTA是結合大多數二價金屬離子的螯合劑，與體系中的游離Ca2+形成絡合物，減少了游離Ca2+對絮凝素的活化作用，從而減少了酵母細胞之間的聚集。

2.2.3 離子強度對釀酒酵母分散影響

由圖4可得，隨著體系中離子強度的增加，分散指數呈現先增加后下降的趨勢，當PBS的緩沖液離子濃度為0.07 mol/L時，分散指數達到最大(I=0.09)，說明離子強度對釀酒酵母分散有顯著影響(P<0.05)，且分散效果最佳為0.07 mol/L。

圖4 離子強度對釀酒酵母分散指數的影響Fig.4 Effect of ionic strength on the dispersion index of S.cerevisiae

有研究表明提高懸浮緩沖液的離子強度(0.01～0.20 mol/L)，含2種表型蛋白(Flo1或NewFlo)的釀酒酵母菌株的絮凝性會隨之降低[21]。本實驗中釀酒酵母在離子強度為0.1 mol/L時相比低離子強度表現出聚集性降低的現象，可能是離子強度影響了絮凝素的性質。STRATFORD[22]認為高濃度的Na+和K+會引起釀酒酵母凝集素的扭曲，并拮抗Ca2+誘導的絮凝。高濃度的Na+和Cl-也會降低蛋白質分子疏水基團的溶解度，增強蛋白質周圍的水團簇，使疏水分子更加致密，從而增強絮凝作用[23]。

2.2.4 pH對釀酒酵母分散影響

由圖5可知，隨著緩沖液pH的升高，分散指數呈現先減少后基本不變的趨勢，說明低的pH環境(pH<7.0)下有助釀酒酵母細胞的分散。當pH>7.0，對酵母細胞的分散性影響不顯著(P>0.05)。

圖5 pH對釀酒酵母分散性的影響Fig.5 Effect of different pH on the dispersion index of S.cerevisiae

因為細胞壁中蛋白質和甘露聚糖的羧基和磷酸二酯基的電離，所以釀酒酵母細胞壁具有凈負電荷[20]。體系pH越高，細胞表面帶的負電荷則越強，靜電排斥力也就越強，細胞在高pH值的環境中應該更分散，這與本實驗結果不同。JIN等[21]同樣發現了這種矛盾的現象，而他認為高pH環境除增加了凈電荷外，也可能改變釀酒酵母細胞表面蛋白基團(如酵母凝集素分子)的電離，導致局部酵母凝集素構象的變化，使釀酒酵母細胞發生絮凝。CILLIERS等[24]也發現降低啤酒酵母懸浮液的pH值可以降低其絮凝度。

2.2.5 超聲波對釀酒酵母分散影響

如圖6所示，隨著超聲波時間的增加(0～60 s)，分散指數在短暫增加后開始減少，但除60 s外，其他處理組(5～50 s)分散指數均大于對照組，說明超聲波5～50 s對釀酒酵母的分散有顯著促進(P<0.05)作用，而超聲波處理60 s后釀酒酵母的分散指數小于對照組，說明超聲波處理60 s后的釀酒酵母細胞分散性反而不如對照組，原因有待研究。

圖6 超聲波時間對釀酒酵母分散指數的影響Fig.6 Effect of different ultrasound time on dispersion index of S.cerevisiae

2.3 不同分散處理對釀酒酵母活性影響

如圖7所示，不同濃度吐溫-20、EDTA以及不同離子強度處理組，處理前后平板法得到的菌落總數變化不明顯，說明吐溫-20(0.2%～1.0%)、EDTA(2～12 mmol/L)、離子強度(0.01～0.1 mol/L)不影響酵母細胞活性。從圖7-c可知，經pH>7.0的緩沖液處理后的釀酒酵母菌液，隨著pH的增大，菌落總數呈現逐漸下降的趨勢，這是因為堿性處理后的釀酒酵母細胞活性受到影響，導致菌落總數減少。圖7-e中超聲波處理后的菌落總數相比對照組增加的原因，可能是超聲波改善了釀酒酵母細胞的分散性，減少了細胞的黏連，使得平板計數結果增大，同時從圖7-e中也可以看出超聲波處理后對細胞活性無影響。

2.4 釀酒酵母分散條件正交實驗優化結果

在單因素試驗的基礎上，確定影響釀酒酵母細胞分散的主要因素及水平，以分散指數為考查指標，設計L9(33)正交試驗。試驗因素與水平設計見表1，結果見表2，采用SPSS 26.0對正交試驗結果進行分析，方差分析結果如表3所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of orthogonal test

由表2及表3可知，各因素對釀酒酵母細胞分散影響的主次為C>B>A，且因素C(EDTA)和因素B(超聲波時間)對實驗結果的影響極顯著(P<0.01)，因素A(吐溫-20)對實驗結果的影響顯著(P<0.05)。正交優化分散條件為A1B2C2(0.2% 吐溫-20、超聲波時間15 s、8 mmol/L EDTA)。經3次重復試驗驗證，該條件下的釀酒酵母細胞的分散指數為0.24，證明優化的分散條件是適宜的。

2.5 釀酒酵母分散處理前后溶液中細胞分布類型分析

微生物群體細胞在空間上的分布分為隨機分布、規則分布、集群分布3種基本分布類型。不同分布類型中微生物細胞的分散度不同，而這個微生物群體的分散度決定了方差(σ2)和均值(μ)的關系，由此可以用模擬方差和均值之間關系的多種數學模型來描述微生物群體的分布類型，泊松分布(σ2=μ)是隨機分布的合適數學模型，二項分布(σ2<μ)為規則分布的近似模型，負二項分布(σ2>μ)為描述集群分布的數學模型之一[10]。

計算不同分散處理的釀酒酵母菌液，數據方差和均值的比值(σ2/μ)，結果見圖8。未經吐溫-20處理的釀酒酵母細胞分布類型為集群分布；不同濃度吐溫-20處理后，分布類型變為規則分布，表明吐溫-20處理后的釀酒酵母分散性更好。不同濃度EDTA處理后釀酒酵母分布類型也由集群分布變成了規則分布；隨著緩沖液離子強度的增加，釀酒酵母分布類型也有類似變化。釀酒酵母在不同pH條件下的分布類型也不相同，當pH<7.0時為規則分布，而pH>7.0時為集群分布。超聲波處理組中，當經過超聲波處理5～50 s后，釀酒酵母由未超聲波處理時的集群分布變為處理后規則分布，而當超聲波時間為60 s，分布類型則為集群分布。細胞分布類型的變化表明適宜的分散處理可以將集群分布的釀酒酵母在一定程度變為規則分布，即可以改變釀酒酵母的分散性。

a-吐溫-20；b-EDTA；c-離子強度；d-pH；e-超聲波時間圖8 不同分散處理對釀酒酵母細胞分布類型的影響Fig.8 Effect of different dispersion treatment on distribution types of S.cerevisiae

3 結論

本文以釀酒酵母為研究對象，針對其細胞聚集現象，提出了有效的分散方法，在優化條件下可使其分散指數提高0.24，即比對照組細胞濃度提高了24%，也證明了對照組所測定的細胞濃度偏低。從溶液中細胞分布類型的變化上，表明所采用的分散方法對釀酒細胞分散有作用。同時，本研究所實驗的分散方法處理的釀酒酵母，通過平板計數分析對釀酒酵母細胞活性無影響，也表明對細胞分散的同時未影響其生長。本研究的分散處理可用于微生物計數方法的前處理中，更真實、準確反映樣品中微生物細胞的濃度。本研究僅針對釀酒酵母進行水溶液中分散研究，但對于其他微生物的分散，以及食品、藥品等基質中的分散效果，仍需進一步的研究。

在利用流式細胞儀分析微生物濃度中，為避免細胞聚集影響，有學者在樣品前處理的過程中也涉及到了微生物分散，如HICKEY等[25]在利用流式細胞儀分析奶酪中的瑞士乳桿菌活力時，為避免細胞聚集，把回收的菌重懸在含0.02%吐溫-20和1 mmol/L EDTA的緩沖液中，并進行適當稀釋后再進行分析；BROWN等[26]在利用流式細胞儀計數活性污泥中細菌數量時，先用5%吐溫-80和10 mmol/L焦磷酸鈉破壞并分散活性污泥中的細菌。在計數污泥中病毒數量時[27]，除用5%吐溫-80、10 mmol/L焦磷酸鈉處理活性污泥之外，還使用含1 mmol/L EDTA的緩沖液稀釋樣本，實驗結果均表明，經處理后的樣本經流式細胞儀分析后，呈現更大的計數結果。由此可見，對微生物細胞進行有效分散有著重要意義，也將為研究其他微生物分散提供參考價值。

本文研究了吐溫-20、EDTA、離子強度、pH、超聲波時間對釀酒酵母細胞分散的影響，結果表明，EDTA和超聲波時間對釀酒酵母細胞的分散有極顯著影響(P<0.01)，吐溫-20對釀酒酵母細胞分散性影響顯著(P<0.05)，并經正交優化得到適宜釀酒酵母的分散條件為體積分數0.2%的吐溫-20、超聲波處理15 s、8 mmol/L EDTA，可使釀酒酵母細胞分散指數達到0.24；對于分布類型為集群分布的釀酒酵母細胞，經有效分散處理后，其分布類型由集群分布轉為規則分布，且適宜的分散處理不影響釀酒酵母細胞活性。