三種葡萄醋對高脂飲食大鼠血脂水平的影響

陳璐，石俊，趙昊，張曉蒙，王妍凌，張晶晶，楊帆，盧灝澤，張鳳杰，金瑋鋆，于佳俊，薛潔*

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015) 3(西藏農牧學院 食品科學學院，西藏 林芝，860000)4(酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京，100015)

葡萄醋是以葡萄、葡萄汁等為原料，經酒精和醋酸雙重發酵而成，與糧食醋相比，葡萄醋色美味佳又兼具保健功能，其成分與葡萄酒相似，含有豐富的有機酸、氨基酸、多酚類物質、礦物質等有益成分[1]。葡萄醋中的有機酸能促進新陳代謝,加快肌肉中乳酸的分解，從而消除疲勞[2-3]；葡萄醋中的氨基酸等物質能刺激神經中樞，促使胃分泌更多的胃液，從而促進消化；葡萄醋還具有利尿、降血糖、降血脂、抗氧化、延緩衰老的功能[4-5]；另外，它還能夠破壞亞硝酸鹽，抑制堿性細菌的繁殖，起到防癌和抗癌的效果[6]。

由于高蛋白、高脂肪食物攝入量增加，高血脂癥患病人數也越來越多。高脂血癥是指血液中的一種或幾種脂質水平異常。目前，臨床上常采用藥物治療和飲食干預的方法控制和降低血脂水平。藥物治療所用的藥物，如羥甲基戊二單酰輔酶A還原酶抑制劑、煙酸類等，均存在一定的副作用，如肝臟功能損害、胃腸功能紊亂等[7-9]。飲食控制雖然能夠在一定程度上起到調節機體內脂質代謝的作用，但長期來看控制效果欠佳。相比之下，食用降血脂功能性食品可能是長期控制血脂更理想的方法。本研究以葡萄醋為研究對象，以健康大鼠作為試驗模型，研究葡萄醋對大鼠血液、肝臟等健康指標的調節作用，探討葡萄醋的作用機理，為后續深入探索葡萄醋與機體健康的關系提供堅實基礎，為消費者選擇葡萄醋提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物為SPF級KM雄性大鼠120只，體質量(30±2) g，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司,動物許可證號為SCXK(京)2019-0010。飼養環境為每天12 h光照、12 h黑暗，溫度為(25±1) ℃，相對濕度為60%，自由飲水和進食，無特定病原體。

所有動物都被保存在無病原體的環境中，并臨時喂食。動物的護理和使用程序得到了北京醫院倫理委員會的批準，并遵守所有適用的有關動物倫理使用的機構和政府法規。

1.1.1 飼料與藥物

普通飼料，鄭州大學實驗動物中心；辛伐他汀片,石藥集團歐意藥業有限公司；膽固醇，天津原四通化工廠；膽酸鈉，北京奧博星生物技術有限公司；吐溫-80，河南亞統食品原料有限公司；丙二醇，武漢勝天宇生物科技有限公司；豬油，四川省青川縣川珍實業有限公司。

脂肪乳劑配方：20 g豬油、10 g膽酸鈉、20 g膽固醇于60 ℃水浴下混合均勻制成油相。稱取30 g蔗糖，于60 ℃水浴下溶于30 mL蒸餾水制成水相。量取20 mL吐溫-80作為調和劑，20 mL 1，2-丙二醇作為表面活性劑，將油相、水相、調和劑以及表面活性劑于60 ℃水浴下混溶，攪拌至乳黃色。再使用研缽將乳黃色液體研至乳白色，制成乳劑。配制好后，冰箱冷凍儲藏。

1.1.2 實驗樣品

樣品A：葡萄醋(純葡萄汁發酵)、樣品B：葡萄醋[V(葡萄汁)∶V(藥食同源產品)=1∶1發酵]、樣品C：市售葡萄醋。其中樣品A和樣品B均由中國食品發酵工業研究院釀造；樣品B添加山楂、烏梅、陳皮、決明子、紫蘇、薄荷、茯苓中藥成分汁液。

總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒，南京建成生物工程研究所；基因組DNA提取試劑盒，Omega Bio Tek公司；高效RIPA裂解液，單去污劑裂解液(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)，北京索萊寶科技有限公司；0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)(pH 7.0～7.2)，通用型組織固定液(中性)，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX 50KBS高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；BG subMIDI多用途水平電泳儀、BG Power600 h電泳儀電源，上海珂淮儀器有限公司；全波段酶標儀，美國BioTek公司；BC C57 PCR儀、Tanon1600凝膠成像系統，上海天能科技有限公司；高速冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄醋生產工藝流程

樣品A制備流程：

釀酒葡萄→除梗壓榨→葡萄醪液→酒精發酵→過濾→調整酒精度(6%～6.5%)→醋酸發酵(34 ℃)→澄清過濾→葡萄原醋

樣品B制備流程：

釀酒葡萄→除梗壓榨→葡萄醪液→酒精發酵→過濾→調整酒精度(6%～6.5%)→加入藥食同源產品汁液→醋酸發酵(34 ℃)→澄清過濾→葡萄原醋

1.3.2 藥食同源產品汁液的制備方法

稱量藥材(烏梅1.5%、山楂1%，陳皮0.75%、紫蘇0.1%、決明子0.1%、薄荷0.1%、茯苓0.1%,均為質量分數)，加入蒸餾水，95 ℃浸提60 min，浸提完成過濾，再次加蒸餾水進行二次浸提，過濾備用。

1.3.3 大鼠分組及灌胃

120只KM雄性大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為12組(n=10)，分別為對照組、模型對照組、陽性對照組、樣品A高劑量組、樣品A中劑量組、樣品A低劑量組、樣品B高劑量組、樣品B中劑量組、樣品B低劑量組、樣品C高劑量組、樣品C中劑量組、樣品C低劑量組。除對照組以普通飼料喂養外，其余各組均在普通飼料喂養基礎上以脂肪乳劑灌胃造模，以6 mL/(kg·d)計，正常對照組每日以等量生理鹽水灌胃1次，共喂養4周后取各組動物血清檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C，判斷是否建模成功。

4周后，除對照組以普通飼料喂養外，其余各組均在普通飼料喂養基礎上以脂肪乳劑灌胃造模，以6 mL/(kg·d)計，正常對照組每日以等量生理鹽水在上午9點灌胃1次。陽性組、樣品低劑量組、中劑量及高劑量組每天分別以4、1.25、2.5、5 mL/(kg·d)相應藥物劑量在下午4點灌胃1次，對照組及模型組每天以等量生理鹽水灌胃。于8周末取動物樣本。檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、載脂蛋白A1(apolipoprotein A1, ApoA1)及載脂蛋白B(apolipoprotein B, ApoB)含量，并制作肝臟病理切片觀察組織病理變化。

1.3.4 樣品收集

在灌胃結束后，所有大鼠禁食12 h但不禁水，依次將大鼠移至無菌間用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，采用眼眶取血法收集血液樣本于離心管中， 3 000 r/min離心15 min，取無溶血血清用于相應指標測定；配合頸椎脫臼法將大鼠處死后，解剖取出肝臟，用冷生理鹽水沖洗血漬，濾紙吸干后稱重，選取肝臟左葉同一部位組織用通用型組織固定液(中性)固定，剩下肝臟組織置于離心管中放入液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.3.5 肝組織勻漿制備

取大鼠肝臟，每個樣品0.1 g，用經過預冷的PBS洗滌組織，用消毒后的剪刀將組織剪成小塊放入勻漿器并加2 mL新鮮裂解緩沖液，低溫研磨。將研磨后的勻漿放入離心管，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液用于組織蛋白、谷胱甘肽過氧化酶3、總超氧化物歧化酶和過氧化氫酶相應指標的檢測，操作方法及步驟按照相應試劑盒說明書進行。

1.3.6 檢測指標

1.3.6.1 體質量增長率和肝臟系數

喂養期間每周稱量體質量1次，記錄并計算每組平均體質量；解剖大鼠后取肝臟，沖洗后稱量質量，按公式(1)計算肝臟指數：

(1)

1.3.6.2 血清相關指標測定

將離心后的大鼠血清樣本，按照試劑盒說明書操作測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C等指標，每個指標平行測定3次。

1.3.6.3 肝臟病理切片制作

取出固定后的肝臟組織，用石蠟包埋做冷凍切片，接著用蘇木精-伊紅染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織病理切片的形態學變化，具體方法參照文獻[10]。

1.3.7 統計分析

運用Qiime 1.9.1計算相應指數；運用SPSS 17.0分析數據，結合單因素方差及顯著性進行分析，數據均采用平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著；數據分析方法：t檢驗。

2 結果與分析

2.1 試驗高脂模型建立結果分析

血清總膽固醇或甘油三酯異常升高時，臨床分別診斷為“高膽固醇血癥”和“高甘油三酯血癥”，當兩項指標均異常升高時，診斷為“混合型高脂血癥”?；旌闲透咧Y是臨床上較為普遍，且存在高危因素較多的一種高脂血癥類型[11-12]。

HDL-C被稱為好脂蛋白、好膽固醇，有利于血脂降低、軟化血管[13]。其可將膽固醇運輸到血管之外，運送至肝臟，在肝臟內轉換化為其他物質或能量進行代謝，從而達到清理血管的作用，不會形成血管黏稠度過高或者血管粥樣硬化等情況。LDL-C被稱為壞膽固醇，它可以運載膽固醇進入外圍組織細胞，可攜帶膽固醇存積在動脈壁上，積累后將引起動脈硬化[14-16]。

試劑盒檢測造模4周后的大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量見表1。模型組與對照組對比，模型組大鼠血清中TC、TG含量均極顯著升高(P< 0.01)，造模成功。這也說明，較長時間的高脂肪、高蛋白的飲食會引起機體內血清中的膽固醇與甘油三酯含量均升高，致使混合型高脂血癥的發生，達到混合型高脂血癥的判定標準，這也為下一步實驗的順利進行奠定了基礎。

2.2 不同樣品灌胃后對大鼠體質量的影響

體質量可以直觀反映動物狀態、代謝水平，可作為實驗過程中調整實驗方案的有力證據。如圖1所示。

a-樣品A；b-樣品B；c-樣品C圖1 各組大鼠每周體質量變化曲線Fig.1 Weekly weight gain line chart of each group of rats

在通過飼喂樣品干預4周后，大鼠體質量見表2：相對于模型組，3種樣品中各組大鼠體質量均有不同程度的降低，其中高、中劑量組體質量均有顯著降低(P<0.05)；相對于對照組，除陽性組，其他組大鼠體質量均顯著增長(P<0.05)。其中A、B樣品大鼠在第5周～第7周普遍出現體質量降低幅度較大情況，結合平時飼養情況，這可能與樣品發揮減脂作用及食欲有關，在此期間這幾組大鼠食欲均有降低的情況。研究表明，多酚類物質可能參與中樞神經系統的食欲控制，通過5-羥色胺、組胺、多巴胺及其受體控制食物的沖動和飽腹感[17]。本研究中各葡萄醋樣品對大鼠體質量均有不同程度的控制作用。

表2 第8周各組大鼠體質量Table 2 Final body weight of mice in each group

2.3 不同樣品灌胃后對大鼠血脂的影響

葡萄酒能增加HDL-C和載脂蛋白水平，作為“血管清道夫”，HDL-C能夠攝取血管壁內膜底層沉浸下來的LDL-C、TC、TG等有害物質，且使膽固醇構成從細胞膜流向血漿脂蛋白的濃度梯度，使其移至肝臟并分解代謝出體外，減少血漿HDL中游離膽固醇的濃度，對心血管疾病具有保護作用[18-20]。本研究比較了不同樣品灌胃后對大鼠血脂功能指標的影響，結果如表3所示。與模型組相比，樣品各組TC與TG均有降低。單就TC而言，樣品B高劑量組和樣品C高劑量組與模型組相比顯著降低(P<0.05)；就TG而言，樣品B高、中劑量組與模型組相比顯著降低(P<0.05)；就HDL-C而言，樣品各組有增高趨勢，樣品組中只有樣品B高劑量組與模型組差異性顯著(P<0.05)；對于LDL-C而言，樣品各組均有降低，樣品B各組與模型組差異顯著(P<0.05)。

綜上，樣品B對血脂各指標影響程度相對于其他樣品較為明顯，說明中藥葡萄醋中的中藥成分對血脂有改善作用；對于本實驗采用的灌胃劑量，樣品C中、低劑量組對于血脂影響差異不明顯，樣品B高、低劑量組對于血脂影響不明顯。長期飲用本實驗中的中藥葡萄醋可預防血脂沉積、動脈硬化、管腔變窄，以及缺血性心血管疾病，因此各組大鼠血脂中HDL-C升高、LDL-C指標顯著降低再次證明了葡萄醋對心血管等具有保護作用。

表3 第8周各組大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量 單位：mmol/L

2.4 不同樣品灌胃后對大鼠血清載脂蛋白的影響

血清ApoA作用和HDL-C相同，也是組成HDL-C的成分，它可以抑制動脈硬化的發生，導致冠心病、腦血栓、下肢動脈硬化發病率下降[21-22]。ApoB也由肝臟合成，是LDL-C的主要結構蛋白，約占LDL-C總蛋白含量的97%，ApoB的測定可直接反映LDL-C的水平[23]。

如圖2所示，ApoA1、ApoB與HDL-C、LDL-C數據相呼應，但與模型組對比，樣品各組差異均不顯著。3種樣品中，樣品B對于兩項指標改善幅度最大，樣品A與樣品C基本無差異。通過ApoA1及ApoB指標的變化可以說明，各組樣品對血脂均有改善作用，依舊可以證明葡萄醋對心血管病具有保護作用。

1#-對照組；2#-模型組；3#-陽性組；4#-樣品A高劑量組；5#-樣品A中劑量組；6#-樣品A低劑量組；7#-樣品B高劑量組；8#-樣品B中劑量組；9#-樣品B低劑量組；10#-樣品C高劑量組；11#-樣品C中劑量組；12#-樣品C低劑量組(下同)a-ApoA1；b-ApoB圖2 各組大鼠血清ApoA1和ApoB水平Fig.2 Effects of serum ApoA1 and ApoB levels in each group

2.5 不同樣品灌胃后對大鼠肝臟系數及組織病理學觀察

肝臟系數因其敏感度較高是毒理學中常用指標[24]。當肝臟系數增大時，可能出現肝臟充血、水腫或增生肥大等情況；當肝臟系數減小時，表示肝臟萎縮或其他退行性病變[25]。本研究分析了不同樣品灌胃后對大鼠肝臟系數的影響，如圖3所示，與模型組相比，陽性組大鼠差異顯著(P<0.05)；其他組差異不顯著；樣品組大鼠肝臟質量及肝臟系數有不同程度的降低，但降低規律并不與樣品及劑量高低相關聯。

a-肝臟系數；b-肝臟質量圖3 不同組別大鼠肝臟系數及肝臟質量Fig.3 Liver coefficients and liver weight of each group

圖4是各組大鼠肝臟組織的病理學切片顯微觀察結果，對照組大鼠肝細胞排列整齊，可見明顯的細胞核，胞漿著色較為均勻，未見脂肪變性。模型組肝細胞排列松散，肝細胞排列混亂且有腫大，細胞間隙和細胞內可見許多大小不等的空泡，中央靜脈周圍病變比較明顯，并呈彌漫性重度脂肪變性而導致輕微的脂肪肝。樣品A、C的中、低劑量組肝細胞排列也較為整齊，肝細胞較正常稍有腫大的現象，肝細胞間隙也可見少量脂肪滴而形成的空泡，但脂變肝細胞數目較模型組明顯減少；樣品B各量及樣品A、C高劑量組肝細胞排列較整齊，接近于正常，基本上沒有脂肪滴空泡，肝細胞基本恢復正常。綜合分析得知，樣品B各組及樣品A、C的高劑量組對大鼠肝臟有不同程度的降脂功能。

圖4 肝臟病理組織學觀察Fig.4 Histopathology of liver tissues from rats in different groups

3 結論

本實驗結果表明，不同樣品灌胃后大鼠的體質量均有不同程度的降低，其中A、B樣品大鼠在第5周～第7周體質量降低幅度較大；通過對大鼠血脂的檢測可以看出3種樣品均有降血脂的作用，其中樣品B效果更加明顯；通過對大鼠血清載脂蛋白的檢測可以發現，樣品各組ApoA1指標升高、ApoB指標降低，其中樣品B對于ApoA1、ApoB兩項指標改善幅度最大；不同樣品灌胃后各組大鼠肝臟質量及肝臟系數均有降低，但降低規律并不與樣品及劑量高低相關聯；由肝臟切片可見，與模型組相比樣品B各劑量及樣品A、C高劑量組肝細胞基本恢復正常，其他各組肝細胞均有不同程度的損傷。攝入葡萄醋后，機體內部脂質含量降低，分解脂質能力增強，由此可見葡萄醋對機體攝入脂質引起的油膩感有控制作用，同時也說明長期適量攝入葡萄醋對健康大鼠的血脂水平有明顯改善，以及能有效預防心血管病。綜合各項指標來看，3種樣品中加了藥食同源產品發酵的葡萄醋預防心血管病的作用最明顯。