CRISPR/Cas9編輯芥菜型多心皮油菜BjROP10基因的研究

徐珂，李爽，趙歌，孫振宇，李海源，李珂欣，王效華，徐平*，沈金雄

（1.臨沂大學農林科學學院，山東 臨沂，276000；2.華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室/國家油菜工程技術研究中心，湖北 武漢，430070）

油菜是世界上重要的油料作物之一，也是主要的食用植物油來源。油菜通常為兩心皮角果，每角果粒數多為15～20 粒，但在近幾年的研究中發現了多心皮油菜突變體，在單株角果數和千粒重相近的前提下，多心皮油菜每角果粒數可達30～40 粒[1]，是一種有利于油菜高產的優良性狀[2,3]。因此開展油菜心皮數發育分子機制的研究對揭示油菜心皮發育的機理和培育多心皮高產油菜具有非常重要的理論和實踐意義。

已有研究發現，CLAVATA（CLV）信號途徑相關基因CLV1、CLV2和CLV3的同源基因突變均可產生油菜多心皮性狀[4，5]，但對其調控機制尚不明確。G蛋白是所有真核生物中多種信號通路的關鍵調控因子。在植物中，G蛋白與多種農藝性狀相關，例如產量、器官大小、生物和非生物脅迫反應、共生和氮利用效率等，因此該類蛋白是目前植物研究的熱點[6]。研究發現，玉米中的Gα 蛋白（異源三聚體G蛋白的α 亞基）基因CT2通過傳導CLV 信號來調控莖頂端分生組織中干細胞的生長[7]，該基因的過量表達可使玉米產生小穗密度和籽粒行數增加、穗分生組織增大以及葉片直立等優異的農藝性狀變異[8]。擬南芥中的Gβ 蛋白（異源三聚體G 蛋白的β亞基）基因AGB1也可通過與另一個類似CLV1的受體RPK2的互作調節分生組織的大小[9]。白菜型油菜中Gα 蛋白基因BraA.Gα1在花和莖頂端分生組織中高表達[10]。小G 蛋白是一類單體G 蛋白，而ROP（Rho-related GTPase from plants）是植物中特有的一類小G 蛋白，參與調控植物生命活動的眾多生理過程[11,12]。擬南芥中共有11 種ROP，它們參與調控細胞極性的建立和維持[13,14]、細胞骨架的組織動態與囊泡運輸[15～17]、響應激素信號[18,19]、保衛細胞的開放和閉合[20]、植物防御病原體的反應[21,22]等重要的生命活動。蛋白免疫共沉淀試驗發現擬南芥ROP蛋白可與CLV1 蛋白相結合形成復合物，調控植物頂端分生組織的發育[23,24]。此外，研究表明ROPs 活性因子基因RopGEF7B參與調控水稻花器官發育，當RopGEF7B被T-DNA 插入以及RNAi 干涉以后，突變體均表現出第三輪和第四輪花器官（雄蕊和子房）數量增加的現象[25]，類似于水稻中FON1（CLV1同源基因）的突變體表型，即雌蕊數量增加的現象[26]，表明植物中ROP 家族基因在CLV 信號途徑中發揮著重要的作用。

前期研究發現芥菜型油菜J163-4 植株中BjMcl基因（CLV1的同源基因）的突變使其產生4 個心皮[27]，且小G 蛋白基因BjROP10的表達量相較于芥菜型兩室油菜顯著增加。本研究通過CRISPR/Cas9技術構建了BjROP10的雙靶點載體，通過遺傳轉化芥菜型多心皮油菜J163-4，最終獲得Bjrop10突變體，并鑒定分析了目標基因的突變位點。本研究為進一步解析BjROP10基因響應CLV 信號調控油菜心皮數發育的功能提供了材料基礎，也為研究油菜多心皮性狀發育的分子機制提供理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

芥菜型多心皮油菜J163-4 由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室油菜組提供，種植于臨沂大學實驗田。人工氣候培養箱里面培養油菜轉基因再生苗，光照為20 000 lx，溫度為22℃，黑暗培養8 h/光照培養16 h。人工氣候箱培養2周左右后，煉苗，移栽到大田。

1.2 方法

1.2.1 油菜BjROP10的克隆 利用CTAB 法[28]提取芥菜型多心皮油菜J163-4 幼嫩葉片的基因組總DNA。以NCBI 數據庫中芥菜型油菜基因組序列為參考，利用Primer3 設計BjROP10的擴增引物，引物序列為：ROP10-1L：5’-ATGGCTTCAAGTGCTTCGAAGTTC-3’和ROP10-1R：5’-CATCATCAATGCCGAGTCACCA-3’。使用Phusion 熱啟動II 高保真PCR 聚合酶混合物（Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix,Thermo Scientific?）擴增BjROP10，20μL PCR 反應體系包括：基因組DNA模板2 μL、ROP10-1L 引物1 μL、ROP10-1R 引物1μL、ddH2O 6 μL、Phusion 熱啟動II 高保真PCR 聚合酶混合物10 μL。PCR 反應程序為：94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35 個 循環，72℃10 min。PCR 產物利用天根科技有限公司的DNA純化回收試劑盒回收后，利用TaKaRa 公司的pMDTM18-T Vector Cloning Kit 進行克隆測序。在BRAD（http://brassicadb.cn/）網站分析BjROP10在芥菜型油菜基因組中的拷貝位點及同源基因位點。

1.2.2 CRISPR/Cas9 基因編輯雙靶點載體的構建 通過SoftBerry（http://linux1. softberry. com/berry. phtml）預測BjROP10的基因外顯子區域和內含子區域。利用NCBIblast 比對獲得BjROP10的保守區域。通過CRISPR-P 2.0（http://crispr. hzau. edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR）在BjROP10外顯子的保守區域篩選靶點并設計2 條sgRNA 序列，分別為TD1-GCGCAAACGTTGTAGTTGA（AGG）和TD2-AGAAGACTATAACAGATTA（AGG）。設計4 條PCR引物，引物序列分別為ROP1-TD1-BsF: 5’-ATATATGGTCTCGATTGGCGCAAACGTTGTAGTT -GAGTT-3’，ROP1-TD1-F0: 5’-TGGCGCAAACGTTGTAGTTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’，ROP1-TD2-R0: 5’ -AACTAATCTGTTATAGTCTTCTCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’，ROP1-TD2-BsR: 5’-ATTATTGGTCTCGAAACTAATCTGTTATAGTCTTCTCAA-3’。下劃線部分為TD1 和TD2 的sgRNA 靶點序列，粗體部分為BsaI 酶識別位點。以pCBC-TD1TD2 為模板，進行四引物PCR，其中ROP1-TD1-BsF 和ROP1-TD2-BsR 引物的濃度為10 μmol/L，ROP1-TD1-F0 和ROP1-TD2-R0引物的濃度為0.01μmol/L，20μL PCR 反應體系包括：pCBC-TD1TD2 模板2 μL、ROP1-TD1-BsF 引物1 μL、ROP1-TD2-BsR 引物1 μL、ROP1-TD1-F0引物1 μL、ROP1-TD2-R0 引物1 μL、ddH2O 4 μL、Phusion 熱啟動II 高保真PCR 聚合酶混合物10 μL。PCR 反應程序為：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35 個循環；72℃10 min。純化回收PCR產物，建立10μL 酶切連接體系：PCR 片段（626 bp）2 μL、pKSE401 質粒2 μL、10 × NEB T4 Buffer 1.5μL、10 × BSA 1.5 μL、BsaI（NEB）1 μL、T4 Ligase（NEB）/高濃度1 μL、ddH2O 6 μL。PCR 片段通過BsaI 位點克隆到pSKE401 載體，構建含T1 和T2 兩個 靶 點 的 CRISPR/Cas9 載 體 ROP10-TD1TD 2（圖1）。

圖1 基因編輯載體的構建Fig.1 Construction of genome editing vector

1.2.3 芥菜型油菜遺傳轉化 將ROP10-TD1TD2載體轉化農桿菌GV3101 后，在芥菜型四心皮油菜中進行農桿菌介導的遺傳轉化，轉化過程中使用卡那霉素進行陽性苗的篩選。ROP10-TD1TD2 在農桿菌中的遺傳轉化參照GV3101 Chemically Competent Cell 產品說明書，芥菜型油菜的組織培養方法參照已公開發布的國家發明專利[28]。

取移栽成活的油菜幼苗葉片，利用CTAB 法取基因組總DNA[29]，根據pKSE401 載體上的Cas9基因序 列，設 計PCR 引 物CAS9-1L：5’-TCGCTGCCAAGAATCTGTCGG-3’和CAS9-1R：5’-TCCACGATGGCCTTCTTCTGCT-3’。以油菜幼苗基因組DNA 為模板，通過PCR 進行轉基因驗證，PCR 反應程序為：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環；72℃10 min。

以ROP10-TD1TD2 轉基因油菜基因組DNA 為模 板，ROP10-1L 和ROP10-1R 為 引 物 進 行PCR 擴增。將擴增的DNA 片段進行TA 克隆后，挑選陽性單克隆進行測序，測序結果與野生型基因BjROP10進行BLAST分析，鑒定目標基因的突變位點。

2 結果與分析

2.1 芥菜型油菜中BjROP10及其同源基因序列分析

BLAST 分析發現，BjROP10在芥菜型油菜基因組中存在兩個位點，分別為位于B04 染色體的BjuB000002和位于B06 染色體的Bju046507。測序結 果 證 明，BjROP10與BjuB000002和Bju046507的序列完全一致。BjROP10的基因全長為1576 bp，CDS序列長度為651 bp，包含8個外顯子和7個內含子，編碼包含216個氨基酸的蛋白。此外，測序結果顯示BjROP10在芥菜型油菜基因組的A02 染色體上還存在一個同源基因BjuA02_ROP，該同源基因的基因全長為1506 bp，CDS 序列長度為615 bp，包含6個外顯子和5 個內含子，編碼包含204 個氨基酸的蛋白。BjROP10與BjuA02_ROP的CDS 序列存在27個位點的單堿基差異，且由于序列變異，BjuA02_ROP的CDS 序列相比BjROP10缺失最后一個外顯子（圖2）。為了進一步研究BjROP10的功能，且不受同源基因的干擾，分別在其第二個和第三個外顯子位置（BjROP10在該位置的序列與BjuA02_ROP存在單堿基位點的差異）設計2 個sgRNA 靶點TD1 和TD2（圖3），用于CRISPR/Cas9載體的構建。

圖2 BjROP10和BjuA02_ROP的蛋白質序列比對Fig.2 Comparision of protein sequences between BjROP10 and BjuA02_ROP

圖3 芥菜型油菜BjROP10的基因組和CDS序列分析及基因組編輯載體靶點的選擇Fig.3 Alignment of genomic and CDS sequence of BjROP10 and the selection of CRISPR target sites in Brassica juncea

2.2 油菜遺傳轉化及轉基因植株的獲得

利用CRISPR 載體ROP10-TD1TD2 通過農桿菌介導遺傳轉化油菜下胚軸（圖4A-D）。經過含卡那霉素的培養基篩選，共獲得22株油菜再生植株。取油菜再生植株幼葉提取基因組DNA，利用Cas9序列引物，通過PCR 對轉基因油菜植株進行驗證發現，其中20 株為轉基因陽性植株（圖4E），轉基因的陽性率約為91%。

圖4 ROP10-TD1TD2在芥菜型多心皮油菜J163-4中的遺傳轉化及遺傳轉化再生苗的PCR鑒定Fig.4 Agrobacterium-mediated genetic transformation of ROP10-TD1TD2 in J163-4 of multilocular Brassica juncea and PCR identification of regenerated seedlings of genetic transformation

2.3 轉基因油菜心皮表型的鑒定及BjROP10 基因編輯位點的鑒定

在20 株油菜轉基因陽性植株中，有13 株心皮數目發生改變，即角果由原來的4 心皮性狀變為2心皮、3 心皮或者5 心皮性狀（圖5）。其中，2 株表現出2 心皮、3 心皮、4 心皮、5 心皮角果并存的現象，4株表現出3 心皮和4 心皮角果并存的現象，5 株表現出4 心皮和5 心皮角果并存的現象，有2 株表現出3心皮、4 心皮和5 心皮角果并存的現象，而對照組中的3株非轉基因植株J163-4-1、J163-4-2、J163-4-3均表現為4心皮角果（表1）。

圖5 芥菜型油菜不同心皮數角果Fig.5 Siliques with different carpel numbers in Brassica juncea

表1 轉基因植株的角果性狀Table 1 Silique traits of transgenic plants

為進一步鑒定基因組編輯載體ROP10-TD1TD2 對BjROP10的突變情況，在T0植株中，測序分析了7 株心皮數發生變化的轉基因油菜，編號分別為Bjrop10-1～Bjrop10-7。結果顯示，這7 株的BjROP10基因序列均發生變異，且變異序列均位于BjROP10第481-1283 個核苷酸之間的T1 和T2 靶點位置。其中，7 株植株在T1 靶點處均發生了序列變異，Bjrop10-2、Bjrop10-3、Bjrop10-4、Bjrop10-6 和Bjrop10-7 在T2 靶點處也發生了序列變異。除Bjrop10-3 植株僅檢測到一個突變拷貝外，其它6 個轉基因植株均檢測到兩個突變拷貝（圖6）。經過編輯單株的基因型鑒定發現，Bjrop10-3植株為雜合突變，即BjROP10的1 個拷貝發生突變，而另外一個拷貝 沒 有 發 生 突 變。 而Bjrop10-1、Bjrop10-2、Bjrop10-4、Bjrop10-5、Bjrop10-6 和Bjrop10-7 植株均發生了嵌合突變，即BjROP10的兩個拷貝均發生了不同的序列變異，且在轉基因植株中沒有檢測到BjROP10的野生型拷貝。

如圖6 所示，Bjrop10-1 中的拷貝Bjrop10-1-1在T1 位點缺失1 個T 堿基，導致移碼突變且翻譯提前終止，拷貝Bjrop10-1-2 在T1 位點插入1 個T 堿基，導致該位點形成終止密碼子UGA，翻譯提前終止，而且第510位氨基酸由T堿基替換為C堿基為同義突變，突變前的密碼子AUU 和突變后的密碼子AUC 均編碼異亮氨酸（Ile）；Bjrop10-2 中，拷貝Bjrop10-2-1 在T1 和T2 靶點之間的序列發生了大片段的變異，導致第36-101 個氨基酸缺失，拷貝Bjrop10-2-2 在T1 和T2 靶點之間的序列發生了大片段的缺失，導致第52-101 個氨基酸發生移碼突變；Bjrop10-3 中檢測發現僅有一種變異拷貝，即在T1 靶點位置序列TG 突變為AACAGGACTACATACCAAAAGC 序列，且T2 靶點位置發生575 bp 的大片段缺失，但是T1靶點位置序列的變異產生終止密碼子UGA，導致翻譯的提前終止。 Bjrop10-4、Bjrop10-5 和Bjrop10-6 植株中的BjROP10拷貝均由于T1 靶點位置序列的缺失導致了移碼突變及翻譯提前終止。Bjrop10-7植株中的拷貝Bjrop10-7-1由于T1 靶點位置序列的大片段缺失，導致第44-71 個氨基酸發生移碼突變，拷貝Bjrop10-7-2 由于T1 靶點位置序列的缺失導致移碼突變及翻譯提前終止。以上突變最終導致BjROP10 蛋白的結構被破壞（圖7），轉基因植株的心皮數目發生改變。

圖6 不同轉基因植株中BjROP10基因序列的變異分析Fig.6 Variation analysis of BjROP10 gene sequences in different transgenic plants

圖7 不同轉基因植株中Bjrop10的蛋白序列Fig.7 Protein sequences of Bjrop10 in different transgenic plants

3 討論與結論

在油菜育種中，多心皮性狀是一種有著潛在利用價值的優異的高產性狀。近年來，已有較多的研究探討其形成的分子機制。目前在三大類型油菜（白菜型油菜、芥菜型油菜和甘藍型油菜）中均發現了多心皮性狀。已有研究認為CLV 信號途徑相關基因調控了油菜多心皮性狀的形成，例如，控制白菜型油菜多心皮性狀的BrCLV3是擬南芥CLV3的同源基因[4]，而控制芥菜型油菜的多心皮性狀的兩個基因BjMc1和BjCLV1均為擬南芥CLV1的同源基因[5,27,30]；將甘藍型油菜中CLV 信號途徑的三個重要成員CLV1、CLV2和CLV3的同源基因進行基因編輯后，均獲得了多心皮性狀[31]。本研究中，芥菜型多心皮油菜J163-4 為CLV1同源基因的突變體，其為四心皮性狀，且沒有嵌合現象，是當前報道中唯一沒有嵌合現象的多心皮油菜突變體[32]，也是研究油菜多心皮性狀形成的分子機制的優異材料。通過基因編輯技術將J163-4 中的BjROP10基因突變以后，突變體植株的心皮數發生變化，形成了兩心皮角果、三心皮角果、四心皮角果以及五心皮角果，證明芥菜型油菜中小G 蛋白基因參與CLV 途徑調控其心皮數的發育，但是究竟是通過何種分子機制進行調控，小G 蛋白基因BjROP10和CLV1存在怎樣的互作關系，還需要進一步的研究。本研究中所獲得的突變體為后續實驗提供了材料基礎。另外，在本研究中將小G 蛋白基因BjROP10突變后，突變體植株出現了多種心皮數目的現象，即嵌合現象，推測由于本研究調查的是基因編輯的T0突變體，同一個突變體植株中存在多個BjROP10基因的突變拷貝，從而導致了同一植株出現多種心皮數目的現象。后續試驗中，將觀察T0代自交后代的表型并鑒定其突變基因型，從而確定小G 蛋白基因BjROP10的各種突變拷貝對油菜心皮數發育的影響，這將為油菜多心皮發育的分子機制的研究奠定理論和實踐基礎。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術能夠快速準確地修飾基因組位點，在作物分子育種領域有著較高的發展潛力。當前，花生中通過CRISPR/Cas9 技術編輯了FAD2基因，獲得了其突變體，為高油酸花生育種提供了育種材料[33]；玉米中通過CRISPR/Cas9 技術對香味基因BADH2進行編輯，最終獲得了具有香味的玉米突變體，填補了當前玉米種質資源庫沒有香味玉米品種的空白[34]。水稻中通過CRISPR/Cas9 技術對香味基因Badh2和粒長基因GS3進行了定向編輯，成功獲得了長粒型香米品種[35]；此外，大豆中通過CRISPR/Cas9技術編輯了與重金屬轉運相關的蛋白基因GmHIPP26，獲得了目標基因的突變體，為研究GmHIPP26在大豆鎘脅迫中的功能提供了實驗材料[36]。本研究中也通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術獲得了油菜的小G 蛋白基因Bjrop10突變體植株，序列分析顯示BjROP10的突變主要為堿基的插入和缺失，且多個突變拷貝存在大片段缺失的現象，其中突變拷貝Bjrop10-2-2、Bjrop10-3 和Bjrop10-6-1中，T1 和T2 靶點之間的序列全部缺失，突變拷貝Bjrop10-2-1 的T1 和T2 靶點之間的序列出現了大片段變異，此外，本研究中BjROP10其它的突變拷貝也均在T1 或T2 處存在堿基的替換或缺失，證明本研究中使用的CRISPR/Cas9雙靶點系統的基因編輯能力很強。這將為后期油菜的分子育種提供實踐基礎和技術支撐，所獲得的突變體材料也將為油菜的多心皮育種提供新的種質資源。