基于UPLC-MS/MS技術的代謝組學方法研究鋁脅迫下花生的根系代謝

沈雪峰，盧文濤，陳勇

（1.廣東海洋大學濱海農業學院，廣東 湛江，524088；2.華南農業大學農學院，廣東 廣州，510642）

全世界約25億公頃耕地和潛在可耕地屬于酸性土壤，約占耕地和潛在可耕地總面積的50%[1]，主要分布在熱帶、亞熱帶及溫帶地區。中國酸性土壤分布遍及南方15 個省，總面積達21.8 萬公頃，約占全國耕地面積的22.7%[2]。當土壤pH 低至5.5 以下時，土壤中的鋁便以離子形式（Al3+）釋放入土中，交換性鋁占陽離子交換量的20%～80%，過量的鋁離子抑制植物的根系生長，影響水分和養分吸收，限制了作物的生長與產量[3,4]?？梢?，鋁毒害已成為制約酸性土壤中作物生長發育和產量形成的最有害因素之一[5,6]。

鋁毒害最明顯的癥狀是作物根系伸長生長受到抑制。根尖是最先感受鋁脅迫的部位，也是鋁誘導有機酸分泌的主要部位[7～9]。有機酸是緩解作物鋁毒害的一類重要物質[10]。張菁[11]研究發現，鋁脅迫誘導紫花苜蓿根系苯丙氨酸代謝途徑增強，促進酚酸類物質的形成，主要有香豆酸、阿魏酸、芥子酸和松柏醇。最近研究[12]報道，環境脅迫可誘導植物產生大量的黃酮和異黃酮類物質?？梢?，植物體內有機酸的代謝對于其抵御鋁脅迫具有重要作用。

花生（Arachis hypogaeaL.）是重要的油料和經濟作物。我國南方花生種植面積占全國花生面積的30%左右，但其單產卻一直低于全國平均水平，其中一個重要原因就是酸性土壤鋁毒害[13]。以往研究主要集中在鋁脅迫對花生生長發育的影響[14]、栽培措施對花生耐鋁性的影響[15]以及外源物質增強花生耐鋁性[16]等方面，而關于鋁脅迫對花生根系代謝學及其代謝通路的相關研究報道較少。因此，本研究基于超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術對鋁脅迫下兩個花生品種根系進行代謝組學分析，以確定鋁脅迫對花生根系生長發育過程中次級代謝產物的影響，揭示鋁脅迫對花生根系的代謝通路，為生產中有效降低鋁毒害提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

花生品種為花育23 號（H），購于山東省農業科學院花生研究所；粵油7號（Y），購于廣東省農業科學院作物研究所。其中，花育23 號為鋁敏感型花生品種，粵油7號為耐鋁型花生品種[17]。

1.2 試驗設計

花生種子經10%的H2O2溶液中消毒后，置于鋪有濾紙的培養皿中進行催芽，2 d后，選取發芽一致的種子，移入盛有營養土的穴盤中進行培養。待花生抽出第二片真葉后，將幼苗移入Hoagland營養液中，試驗設為對照（清水，CK）和鋁處理（0.3 mmol·L-1AlCl3·6H2O，分析純，根據鋁濃度篩選試驗結果而定），即花育23 號的對照（HC）和處理（HA），粵油7 號的對照（YC）和處理（YA），每個處理重復3 次。培養液每2 d 一換，隨后置于人工氣候室，溫度28℃/25℃（晝/夜），光照600 μmol·m-2·s-1，相對濕度75%左右。鋁脅迫7 d后，取各個處理的花生幼苗新鮮根系，用于代謝物的測定。

1.3 樣品提取

1.3.1 供試品制備 將根系樣品置于凍干機（Scientz-100F）中真空冷凍干燥，利用冷凍研磨儀（MM 400, 德國Retsch）研磨（30 Hz, 1.5 min）至粉末。稱取100 mg 粉末溶解于含有0.6 mL 70%甲醇的提取液中，置于4℃冰箱，期間渦旋6 次，提高提取率，10 000 ×g離心10 min，吸上清，過0.22μm微孔濾膜，保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 液相條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1 mm×100 mm；流動相：水相為超純水（加入0.04%的乙酸），有機相為乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脫梯度：0 min 有機相比例為5%，10 min 內有機相比例線性增加到95% 1 min，11.00～11.10 min，并 維 持 在95%1 min，有機相比例降為5%，并以5% 平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40℃；進樣量4μL。

1.3.3 質譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization, ESI）溫度550℃，質譜電壓5500 V，簾氣（curtain gas,CUR）30 psi，碰撞誘導電離（collisionactivated dissociation,CAD）參數設置為高。在三重串聯四級桿質譜（QQQ, Thermo Fisher）中，每個離子對是根據優化的去簇電壓（declustering potential, DP）和碰撞能（collision energy, CE）進行掃描檢測[18]。

1.3.4 代謝物定性與定量 基于邁維代謝生物科技有限公司自建數據庫MWDB（metware database）及代謝物信息公共數據庫，利用QQQ 的多反應監測模式（multiple reaction monitoring, MRM）對代謝物定性分析。獲得不同樣品的代謝物質譜數據后，對所有物質的質譜峰進行峰面積積分，并對不同樣品的相同代謝物質譜進行積分校正[19]。

1.4 數據處理與分析

采用多元統計分析，運用MetaboAnalyst R 包中的OPLSR. Anal 函數進行有監督的正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），用于區分組間的差異代謝物。根據OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in projection, VIP）和差異倍數值（fold change）以及單變量T 檢驗p 值篩選出差異代謝物。即fold change≥2 或fold change≤0.5，P 值≤0.05 以及VIP≥1 的代謝物被認為是差異代謝物。將獲得的差異代謝物信息映射到KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數據庫進行注釋，以獲得其富集到的KEGG代謝通路信息。

2 結果與分析

2.1 鋁脅迫后花生根系中代謝物分析

使用質控樣品（quality control，QC，由樣品提取物混合制備而成）分析花生根系樣品在相同的處理方法下系統檢測的重復性。通過QC 樣品的總離子流色譜圖（total ions current，TIC）進行重疊（圖1），并繪制了MRM 代謝物檢測多峰圖（多物質提取的離子流圖譜，XIC），可以得知，在所有樣品中總共鑒定出416 種代謝物，分為10 種類型，主要以酚酸類（phenolic acids，22.60%）、脂質（lipids，14.66%）、氨基酸及其衍生物（amino acids and derivatives，13.94%）、黃酮（flavonoids，11.78%）、核苷酸及其衍生物（nucleotides and derivatives，10.10%）、有機酸（organic acids，8.17%）、生物堿（alkaloids，6.01%）、木脂素和香豆素（lignans and coumarins，3.13%）、萜類（terpenoids，1.92%）和其它類（others，7.69%）為主（圖2）。

圖1 質控樣品質譜檢測總離子流重疊圖Fig.1 Overlapped total ions current of quality control samples

圖2 正離子模式（A）和負離子模式（B）混樣質控樣品的MRM代謝物檢測多峰圖Fig.2 Multiple reaction monitoring（MRM）analysis of mixed quality control（QC）sample under positive ion mode（A）and negative ion mode（B）

2.2 主成分分析

通過對樣品（包括QC）的主成分分析，初步了解4 組樣品之間的總體代謝差異和組內樣品之間的變異度大小[20]。從圖3 可以看出，UPLC-MS/MS分析得到的原始數據在PC1、PC2 兩個主成分中很好地分離、呈現。其中HCvsHA（花育23 品種，HC為對照處理，HA 為鋁脅迫處理）的第一主成分的貢獻率為81.71%，第二主成分的貢獻率為5.96%，兩者的貢獻率之和為87.67%；YCvsYA（粵油7 號品種，YC為對照處理，YA為鋁脅迫處理）的第一主成分的貢獻率為73.69%，第二主成分的貢獻率為8.69%，兩者的貢獻率之和為82.38%；HC vs YC（HC為花育23對照處理，YC為粵油7號對照處理）的第一主成分的貢獻率為75.52%，第二主成分的貢獻率為9.00%，兩者的貢獻率之和為84.52%；HA vs YA（HA 為花育23 鋁脅迫處理，YA 為粵油7號鋁脅迫處理）的第一主成分的貢獻率為79.30%，第二主成分的貢獻率為7.15%，兩者的貢獻率之和為84.45%；主成分結果表明，花育23 和粵油7 號區分明顯。從4 組樣品的聚類熱圖分析（圖4）可知，4組樣品區別明顯，組內平行樣品成分接近，證明樣品的可靠性。

圖3 PCA得分Fig.3 Score scatter plot for PCA

圖4 樣品總體聚類圖Fig.4 Sample overall clustering map

2.3 正交偏最小二乘法判別分析

依據正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型對代謝組數據進行分析，依據模型參數HCvsHA R2X= 0.876，R2Y= 1，Q2= 0.998；YCvsYA R2X=0.811，R2Y= 1，Q2= 0.989；HCvsYC R2X= 0.842，R2Y= 1，Q2= 0.991；HAvsYA R2X= 0.838，R2Y= 1，Q2= 0.997 來看，其中Q2大于0.9，說明OPLS-DA模型構建良好，預測性可靠。

2.4 差異代謝物篩選及分析

依據OPLS-DA 分析后，根據上調代謝物fold change≥2、下調代謝物fold change≤0.5 和VIP≥1 標準篩選出差異顯著的代謝物。在檢測的416 個代謝物中，HCvsHA 共篩選出155 個差異代謝物（圖5A），其中上調代謝物為27 種，下調為128 種；YCvsYA 共篩選出109 個差異代謝物，其中上調代謝物為28種，下調為81種（圖5B）；HCvsYC 共篩選出117 個差異代謝物，其中上調代謝物為35 種，下調為82種（圖5C）；HAvsYA共篩選出145個差異代謝物，其中上調代謝物為76 種，下調為69 種（圖5D）。鋁脅迫條件下，粵油7號vs花育23的上調表達代謝物含量遠多于下調代謝物，說耐鋁性品種具有自身的耐鋁基因。

圖5 兩品種與對照之間的差異代謝物火山圖Fig.5 Different metabolite volcano map between samples

對檢測到的代謝物進行log2FC 處理后，變化最顯著的20（上調和下調）個差異代謝物見圖6。

與HC 相比，HA 樣品中4 種酚酸類（阿魏酰芥子酰酒石酸異構體、芥子酰芥子酰酒石酸、芥子?？Х弱＞剖岙悩嬻w和芥子?？Х弱＞剖幔?，4種黃酮（槲皮素-7-O-葡萄糖苷、丙二酰黃豆苷、金圣草黃素7-O-己糖苷和丁香醛）和2 種其它類（驢食草酚和白藜蘆醇）的相對含量顯著增加；3 種有機酸（檸檬酸、奎尼酸和壬二酸），4 種酚酸類（3,4,5-三甲氧基苯基1-O-D-葡萄糖吡喃苷、trans-3-O-對香豆?？崴?、3-O-（E）-對香豆蔻?？鼘幩岷?-O-對香豆?？崴幔?，2 種木脂素和香豆素（東莨菪內酯和松脂醇-己糖）和1 種黃酮（矢車菊素3-O-葡萄糖苷）的相對含量降低（圖6A）。

與YC相比，YA樣品中7種酚酸類（芥子酰-P-香豆酰氨酸、對香豆酰芥子酰酒石酸、對香豆酰芥子酰酒石酸異構體、芥子酰芥子酰酒石酸、芥子酰酒石酸異構體2、芥子?？Х弱＞剖岷桶⑽乎＝孀吁＞剖幔?，3種黃酮（2-羥基-5-甲氧基-染料木素-4,7-O-二葡萄糖、丁香醛和花生四烯-1）的相對含量顯著增加；3 種有機酸（檸檬酸、奎尼酸和壬二酸），2 種酚酸類（苯甲酸和3-O-（E）-對香豆蔻?？鼘幩幔?，2 種脂質（9,10-二羥基-12-十八酸和花生四烯酸），1 種木脂素和香豆素（東莨菪內酯），1 種氨基酸及其衍生物（L-谷氨酸）和1 種核苷酸及其衍生物（腺苷-3-5-環單磷酸水合物）的相對含量顯著降低（圖6B）。

與HC 相比，YC 樣品中6 種黃酮（槲皮素-7-O-葡萄糖苷、丙二酰黃豆苷、金圣草黃素7-O-己糖苷、槲皮素3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、大豆苷和大豆苷-4-葡萄糖苷），3 種酚酸類（阿魏酰芥子酰酒石酸異構體、芥子酰芥子酰酒石酸和芥子?？Х弱＞剖岙悩嬻w）和1種其它類（驢食草酚）的相對含量顯著增加；6 種黃酮（槲皮素3-O-鼠李糖基半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-刺槐甙、蘆丁、矢車菊素3-O-葡萄糖苷和2-羥基-5-甲氧基-染料木素-4,7-O-二葡萄糖），3種酚酸類（trans-3-O-對香豆?？崴?、3-O-（E）-對香豆蔻?？鼘幩岷?-O-對香豆?？崴幔┖? 種木脂素和香豆素（松脂醇-己糖）的相對含量顯著降低（圖6C）。

與HA 相比，YA 樣品中5 種黃酮（槲皮素3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、金圣草黃素O-丙二酰己糖苷、2-羥基-5-甲氧基-染料木素-4,7-O-二葡萄糖、4-羥基甘草查爾酮A 和芹菜素5-O-葡萄糖苷），2 種氨基酸及其衍生物（L-無水天冬酰胺和反-4-羥基-L-脯氨酸），2種酚酸類（芥子酰芥子酰酒石酸和對香豆酰芥子酰酒石酸異構體）和1種萜類（24,30-二羥基-12（13）烯羽扇豆醇）的相對含量顯著增加；6 種酚酸類（白皮杉醇、毛蕊糖甙、對香豆酰肉桂酰酒石酸、二對香豆酰蘋果酸、綠原酸和肉桂酸），2 種黃酮（2-羥基-5-甲氧基-染料木素-O-鼠李糖-葡萄糖和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷）和2 種核苷酸及其衍生物（鳥苷3,5-環單磷酸和腺苷-3-5-環單磷酸水合物）的相對含量顯著降低（圖6D）。

2.5 差異代謝物代謝通路富集分析

基于KEGG 數據庫，對差異代謝物進行了KEGG 顯著性富集分析[21]。在HCvsHA 鑒定的155個差異代謝物中，有27 個有對應的KEGG 注釋，共涉及47 條代謝通路（圖7）；在YCvsYA 鑒定的109個差異代謝物中，有23 個有對應的KEGG 注釋，共涉及47 條代謝通路；在HCvsYC 鑒定的117 個差異代謝物中，有24個有對應的KEGG 注釋，共涉及43條代謝通路；在HAvsYA 鑒定的145 個差異代謝物，有42個有對應的KEGG注釋，共涉及60條代謝通路。

圖7 樣品差異代謝物KEGG分類圖Fig.7 KEGG classification graph of different metabolites

進一步對每條通路途徑中富集到的差異代謝物的含量進行分析，異黃酮生物合成、苯丙烷生物合成和異喹啉生物堿生物合成均在HCvsHA 中升高；碳青霉烯生物合成、煙酸和煙酰胺代謝、泛酸和輔酶A 生物合成均在YCvsYA 中升高；異黃酮生物合成、類黃酮生物合成和苯丙烷生物合成均在HCvsYC 中升高；嘌呤代謝、苯丙氨酸代謝和異黃酮生物合成均在HAvsYA中升高（圖8）。異黃酮類化合物是苯丙烷類代謝途徑的一個分支所合成的一類酚類次生代謝產物。綜合分析來看，差異代謝物在異黃酮生物合成代謝通路中富集顯著。

圖8 樣品差異代謝物KEGG富集圖Fig.8 KEGG enrich graph of different metabolites

3 討論與結論

3.1 鋁脅迫對花生根系的影響

鋁毒是酸性土壤中作物生長最重要的限制因素[9,22]。前人關于花生酸性土鋁毒害的相關研究主要集在鋁對花生形態、發育和產量的影響方面[2,23]。根系作為鋁脅迫最敏感的部位，受到鋁脅迫后，主根變粗變短、根尖膨大變褐、側根和根毛減少甚至消失[5,7]，從而抑制養分吸收和干物質積累，但其抑制程度因基因型而異。本研究選用兩個基因差異比較大的花生品種為材料，在前期的試驗中[17]，發現鋁脅迫下兩個品種的根系存在明顯差異。這也與詹潔[13]等人的研究結果相一致。

3.2 鋁脅迫對花生根系有機酸的影響

作為植物耐鋁性的機制之一，植物可以通過根系分泌有機酸來解除或減輕鋁的毒害，分泌的有機酸主要包括檸檬酸、蘋果酸及草酸[24]。韋冬萍[10]利用200μmol·L-1AlCl3處理油菜后，與對照相比，根系中的檸檬酸和蘋果酸分別增加了111%和223%。本研究發現，鋁脅迫下，與對照相比，在兩個花生品種中均檢測到了含量比較高的三種有機酸，分別為檸檬酸、奎尼酸和壬二酸。

3.3 鋁脅迫對花生根系代謝的影響

Xiao 等[21]研究發現，經GO 和KEGG 通路分析，鋁脅迫下花生根系幼苗根系中與有機酸轉運、金屬離子轉運、轉錄調控和程序性細胞死亡（PCD）有關的基因。本研究采用廣泛靶向代謝組學技術，以兩種不同耐鋁性花生品種為材料，研究鋁脅迫對其產生的代謝物的影響。從花生幼苗根系中共檢測出416 種代謝物，HCvsHA 共篩選出155 個差異代謝物，占共有代謝物的37.26%，YCvsYA 共篩選出109 個差異代謝物，占共有代謝物的26.20%，HCvsYC 共篩選出117 個差異代謝物，占共有代謝物的28.13%，HAvsYA 共篩選出145 個差異代謝物，占共有代謝物的34.86%。主要包含酚酸類、黃酮、有機酸、木脂素和香豆素、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物和其他等次級代謝產物。代謝途徑主要涉及糖酵解、三羧酸循環、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、尿素循環、脂肪酸氧化和糖異生作用，提供了花生幼苗根系發育所需要的營養物質和其它代謝所需要的能量（如ATP）。代謝組分析結果與其它研究結果也相似。本研究清楚地揭示，鋁脅迫能夠顯著促進次生代謝產物的合成，這為花生幼苗增強耐鋁性提供了重要信息。而本研究主要是針對花生育23 和粵油7 號兩個花生栽培品種開展代謝組學研究，為獲取盡可能詳盡的物質信息，將進一步對花生屬中其他種開展研究，為我國南方地區的花生種植奠定理論基礎。