鹽堿水環境對脊尾白蝦基因組DNA甲基化的影響*

秦 楨 李吉濤 李明棟 王佳佳 葛倩倩 劉 萍 李 健

鹽堿水環境對脊尾白蝦基因組DNA甲基化的影響*

秦 楨1,2李吉濤2①李明棟2王佳佳2葛倩倩2劉 萍2李 健2

(1. 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 山東 青島 266071)

為探討鹽堿水環境對脊尾白蝦()基因組DNA甲基化的影響，本研究利用MethylRAD-Seq技術探究了長期鹽堿水養殖組(SAS)和正常海水養殖對照組(SW)脊尾白蝦鰓組織中的DNA甲基化水平，并對關鍵通路和基因進行了差異表達分析。結果顯示，脊尾白蝦鰓組織基因組中CG和CWG位點(W=A或T)分別檢測到2347003和416176處甲基化，甲基化普遍存在于基因組的基因間區和內含子區域，共篩選到8805個(8189個CG-DMSs和616個CWG-DMSs)差異甲基化位點，鹽堿水環境下DNA甲基化水平略有增強。通過KEGG富集分析發現，DMS所在差異表達基因顯著富集在HIF-1信號通路和剪接體通路，通路中、和等關鍵基因在脊尾白蝦鹽堿水環境適應中可能發揮著重要作用；對SW和SAS組差異甲基化基因(DMG)進行篩選，得到158個CG-DMGs和94個CWG-DMGs，其中，富集到脂質代謝和囊泡介導的轉運通路中的DMG最多；此外，有一些DNA甲基化位點與基因表達呈負相關，表明DNA甲基化與基因調控之間存在復雜的聯系，大部分基因組DNA甲基化對基因表達有正調控效應。本研究結果首次分析了在鹽堿水環境下脊尾白蝦鰓組織的DNA甲基化水平特征，為解析甲殼類鹽堿水環境適應機制提供了基礎信息。

脊尾白蝦；鹽堿水環境；DNA甲基化；差異表達基因

受氣候、地形等自然和人為因素的影響，全球土壤和水的鹽漬化程度正在增加(常玉梅等, 2021)。據研究推測，這些地區在未來將日趨擴大，嚴重威脅水產養殖的發展空間(張建峰, 2008)。目前，已有大量研究集中在鹽堿地管理和鹽堿水對水生動物(包括甲殼類)的毒性影響(Arooj, 2021; Chen, 2020; Conrado, 2017; 楊富億等, 2004)。為促進鹽堿地水產養殖的發展，對一些適應性較強的品種開展了鹽堿地池塘養殖，例如耐鹽堿魚類、廣鹽性魚類和蝦蟹類等，目前應用于鹽堿水規?；B殖的品種包括羅非魚()、梭鱸()和凡納濱對蝦()等(徐文龍等, 2021; 來琦芳等, 2021)。對魚類耐鹽堿機制的研究主要集中在生理和分子調控機制(滲透壓調節、氨氮代謝、激素調節等)方面，而對甲殼動物耐鹽堿的研究則主要集中在對堿度脅迫的耐受能力及其生理變化(常玉梅等, 2021)。然而，目前對甲殼類動物耐鹽堿的分子機制尚不清楚。

越來越多的證據表明，表觀遺傳學調控機制在生物對環境脅迫后的適應性調控過程中占據著至關重要的地位(Xu, 2020; Han, 2021)。研究發現，生物體可以通過DNA甲基化調節當代和后代的環境適應能力，比如對低氧、低鹽、鹽堿等環境脅迫的適應(Wang, 2021; 王會等, 2017; 環朋朋等, 2019; Su, 2020)。在甲殼動物中，有學者開展關于DNA甲基化對其生長發育、防御生物和非生物脅迫(包括熱應激、鹽度、重金屬等)的影響。例如，薛蓓等(2017)研究了脊尾白蝦() 4個生長發育階段線粒體基因組的甲基化水平，發現脊尾白蝦通過甲基化調節能量代謝影響機體的生長發育進程。熱應激下，鹵蟲()和海鞘()的胞嘧啶甲基化導致基因的差異表達(Norouzitallab, 2014; Hawes, 2018)。Lovett等(2001)研究發現，甲基法尼酯(methyl farnesoate)能夠調節岸蟹()機體滲透壓，使其適應鹽度變化很大的河口環境。年齡、取樣地點、水溫、禁食和鎘暴露均能顯著影響淡水鉤蝦()基因組胞嘧啶的甲基化水平(Cribiu, 2018)。

脊尾白蝦俗稱海水小白蝦、白米蝦，是我國東部沿海廣溫廣鹽的重要中小型經濟蝦類，以黃、渤海產量最高，年產量數千噸(Ge, 2015; Fan, 2020)。近年來，脊尾白蝦養殖業迅速擴大，成為促進我國沿海漁業經濟發展的重要品種(柳飛等, 2016; 李明棟等, 2021)。在濱海鹽堿水試養脊尾白蝦過程中，發現脊尾白蝦雖然能夠正常生存，但其生長及繁殖能力在高碳酸鹽堿度下明顯降低(Ge, 2019; 柳飛等, 2016)。開展脊尾白蝦鹽堿適應機制解析，對耐鹽堿良種培育和鹽堿水養殖具有重要意義。本研究利用河北滄州養殖基地脊尾白蝦耐鹽堿品系和山東日照試驗基地脊尾白蝦“黃育1號”作為研究對象，利用高效、低成本全基因組DNA甲基化檢測技術(MethylRAD-Seq)對脊尾白蝦鰓組織DNA甲基化水平進行分析，篩選與鹽堿脅迫相關的關鍵基因和重要甲基化位點，旨在為解析脊尾白蝦適應鹽堿水環境的分子機制提供基礎數據，為甲殼類鹽堿適應機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究用脊尾白蝦“黃育1號”養殖于山東省日照海辰水產有限公司正常海水中(鹽度25、pH 8.2、碳酸鹽堿度2.0～3.0 mmol/L)，脊尾白蝦耐鹽堿品系養殖于河北滄州濱海型鹽堿水中(鹽度15～20、pH 8.3～9.2、碳酸鹽堿度3.5～8.0 mmol/L)。根據實驗目的，正常海水養殖對照組(SW)取自日照養殖的“黃育1號”健康成蝦，長期鹽堿水養殖組(SAS)為2019年“黃育1號”引入河北滄州濱海型鹽堿水選育3代的成蝦個體。實驗用脊尾白蝦體長為(5.65±0.50) cm，體重為(1.52±0.38) g，隨機選取體質健康、活力良好的個體。進行實驗前3 d停止喂食，待蝦狀態穩定后解剖其鰓組織于–80℃下保存。SW和SAS組分別取6個生物平行，每個平行3份鰓組織，各組織樣品分別標記為SW1～3和SAS1～3，用于后期DNA和總RNA提取。

1.2 DNA提取和文庫構建

采用TIANamp Marine Animals DNA Kit (TIANGEN)提取DNA，利用核酸定量儀(Thermo, NanoDrop 2000)和1%瓊脂糖檢測DNA質量、濃度和完整性。利用修飾依賴性內切酶EI 5U于37℃酶切4 h消化基因組DNA，按照10 μL酶切產物與0.80 μL特異性接頭、1 μL 10×T4ligase buffer、1 μL 10 mmol/L ATP和2 μL T4DNA ligase (400 U/μL)的比例混合，加超純水使總體積為20 μL。4℃連接6～8 h，連接產物經特異性引物反應擴增，反應條件：98℃初始變性30 s，98℃ 20個循環變性5 s，60℃退火20 s，72℃片段延伸10 s。每個樣品平行擴增3管，用于后續回收目的片段。取3 μL PCR產物用8%聚丙烯酰胺凝膠進行非變性電泳檢查。然后按照制造商說明將PCR產物用SteadyPure Agarose Gel DNA Purification Kit (Accurate Biotechnology Co., Ltd)進行切膠回收。利用QIAquick PCR Purification Kit和Qubit對PCR產物進行純化和定量，基于MethylRAD技術構建標簽文庫，由上海歐易生物醫學科技有限公司采用Illumina SE sequencing (50 bp)測序平臺進行文庫測序。

1.3 數據處理與統計分析

1.3.1 原始數據的質控 利用Illumina測序平臺得到的原始圖像數據文件經堿基識別轉化為原始測序序列(raw reads)。在組裝之前，通過預處理(隨機截取103%的數據，去除距5′或3′端13～17 bp的片段、有待檢測酶切位點的片段和低質量片段)對原始數據進行過濾與質控，得到各樣品的高質量的有效數據(clean reads)，進行后續的數據分析。

1.3.2 甲基化位點水平的定量 以本課題組前期組裝的脊尾白蝦全基因組序列為參考基因組(數據尚未發表)，使用Bowtie 2軟件(V2.3.4.1)對clean reads進行比對，參數設置為：--no-unal。比對完成后，去除能夠同時比對到參考序列的多個位置的reads，采用RPM (reads per million)為單位對甲基化位點水平進行定量，計算公式為位點甲基化水平定量值=位點覆蓋reads數/文庫高質量reads×1000000。根據比對結果，統計CG位點(CmCGG、GmCGG、CmCGA、AmCGG、CmCGC、CmCGT、TmCGG和GmCGC)和CWG位點(mCAG和mCTG)的數目、電子酶切位點數目及reads深度，從而描繪整條染色體上2種位點的分布情況。

通過修飾依賴型核酸內切酶(EI酶和PI酶)進行電子酶切，識別C5-甲基化胞嘧啶(5-mC)和C5-羥甲基化胞嘧啶(5-hmC)，得到一個30 bp (28～ 37 bp)左右的酶切片段。圖1為EI酶和PI酶的酶切位點示意圖。對于mCG位點，只選擇EI酶的CmCGG位點和PI酶的8種比較穩定的CG位點進行下游數據分析(Boers, 2018)；對于mCHG (H代表簡并堿基A、C、T)位點，EI酶和PI酶都采用mCAG和mCTG結果，用CWG表示(W代表簡并堿基A、T)。

圖1 LpnPI酶和FspEI酶的酶切位點

1.3.3 甲基化位點注釋及分布 根據甲基化位點的位置信息，使用SnpEff軟件(V 4.1g)位點進行注釋，給出每個位點所在的基因元件以及位點注釋的詳細信息，利用bedtools軟件(V 2.25.0)統計各個樣品中不同基因元件中甲基化位點的分布情況，進一步選取基因轉錄起始位置(TSS)上下游各2 kb區段，轉錄終止位置(TTS)上下游各2 kb區段及基因體(genebody)，將分布在不同區域的每個基因的序列均分為多個窗口，統計每個窗口的RPM值，將所有基因相同窗口的RPM值取平均，作為該窗口的RPM值，描述測序reads在上述區段的分布趨勢。

1.3.4 甲基化位點的差異分析 將各個樣本的base mean值作為測序深度的表達量估算值，利用DESeq包(V 1.36.0)對測序深度進行標準化處理，計算差異倍數，并采用負二項分布檢驗對reads數進行差異顯著性檢驗，以此來篩選差異甲基化位點(DMS)。默認<0.05且差異倍數(fold change)大于2為篩選差異的條件。使用bedtools軟件對各個比較組中不同基因元件中甲基化位點的分布情況進行統計。記錄DMS的分布，并統計DMS在不同基因功能元件上的分布。統計DMS的甲基化水平，用以描述DMS所在基因的甲基化水平，獲得DMS所在差異表達基因(DEG)。根據GO (Gene Ontology, http://www. geneontology.org/)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg/)數據庫進行GO和KEGG pathway功能和富集分析。< 0.05的GO term被認為是顯著富集，Benjamini- Hochberg多重檢驗校正所有值以獲得FDR。

1.3.5 基因水平的甲基化差異分析 以某一基因內的所有甲基化位點水平之和代表該基因的甲基化水平，對SW和SAS兩組樣品進行組間比較。同樣計算差異倍數，利用負二項分布檢驗的方式對基因進行差異顯著性檢驗，最終根據差異倍數及差異顯著性檢驗結果來篩選差異甲基化基因(DMG)。由DMG組成基因集，根據GO和KEGG數據庫進行GO和KEGG pathway功能和富集分析。

1.3.6 通過qRT-PCR驗證差異甲基化基因和差異表達基因 利用TRIzol試劑(Invitrogen)提取鰓組織樣本的總RNA，經核酸定量儀(Thermo, NanoDrop 2000)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和質量。按照HiScriptⅡ Q Select RT SuperMix for qPCR (Vazyme)說明書進行RNA反轉錄，合成cDNA。以cDNA為模板進行引物的驗證和后續2組脊尾白蝦鰓組織的甲基化特征分析。為了驗證由MethylRAD-seq確定的脊尾白蝦鰓組織中DMS相關的DEG，選取顯著富集的KEGG通路相關的12個DEGs進行了qRT-PCR分析。用于qRT-PCR分析的mRNAs引物見表1。以18S為內參，引物序列如下：5′-TATACGCTA GTGGAGCTGGAA-3′和3′-GGGGAGGTAGTGACGA AAAAT-5′ (李美玉等, 2012; Wang, 2015)。在7500 fast Real-Time PCR系統(Applied Biosystems)中，使用SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies)進行qRT-PCR。取每個時間點的3個轉錄組樣本進行qRT-PCR，每個生物重復進行3個技術重復。使用CT方法(2?ΔΔCt)計算目的基因的相對表達量(Tapia, 2017)。

表1 用于qRT-PCR分析的mRNA引物

Tab.1 Primers of mRNAs used for the qRT-PCR analysis

2 結果與分析

2.1 DNA甲基化測序結果統計

對SAS和SW的6個樣本進行MethylRAD測序和數據統計，測序結果顯示，平均每個樣本獲得184 868 782條原始數據。對完成過濾質控的CG和CWG位點進行酶切，共獲得55 642 471條有效數據，占總reads的35.04%～37.49%。統計每條scaffold上各種酶切位點的數目，每組有效數據平均88.71%可比對到脊尾白蝦的參考基因組，共有22 633 946條有效數據在參考基因組上有唯一比對位置，具體測序信息見表2。

2.2 組間甲基化位點的分布統計

根據參考基因組比對結果，統計6個樣品篩選到的甲基化位點數目及平均測序深度，在SW組的3個樣品中平均發現377 441和64 655個CG和CWG型DNA甲基化位點，平均甲基化位點覆蓋深度分別為7.990和5.203 (表3)。在SAS中共發現404 893個和74 071個CG和CWG型DNA甲基化位點，平均甲基化覆蓋率分別為7.986和5.183，每個樣本DNA甲基化位點(CG位點和CWG位點)的測序覆蓋深度見表3。此外，與SW相比，SAS中CG處的DNA甲基化水平增加了0.05%，CWG處的DNA甲基化也增加了0.38%。這些結果表明，對于脊尾白蝦鰓組織來說，mCG二核苷酸的胞嘧啶上發生突變是甲基化的主要表現形式，同時鹽堿脅迫下，脊尾白蝦鰓組織基因組的甲基化水平有所升高。

表2 MethylRAD文庫測序數據統計

Tab.2 Statistics of sequencing data of MethylRAD library

根據甲基化位點的位置信息，對位點進行注釋，發現這些DNA甲基化位點主要分布在5′端的核酸區、外顯子、基因區、基因間區、內含子、剪接位點、3′端的核酸區域，CG型甲基化位點在不同功能元件上的分布數量均顯著多于CWG型，但CG和CWG兩種類型位點的分布趨勢基本一致，基因間區中分布的甲基化位點比例最高，其次是內含子區?？傊?，鹽堿脅迫導致基因組功能組成元件中CG和CWG位點分布具有重疊變化(圖2)。統計reads在轉錄起始位置(TSS)上下游各2 kb區段，轉錄終止位置(TTS)上下游各2 kb區段和基因體的分布趨勢，結果發現各個樣品之間的DNA甲基化水平趨勢是相似的，DNA甲基化位點多分布在基因體，DNA甲基化位點分布曲線在TSS的下游序列和TTS的上游序列甲基化標簽頻率明顯高于其他序列(圖3)。

2.3 差異甲基化位點表達分析

測序深度信息進行標準化處理后，分別篩選到8189個和616個CG型差異甲基化位點(CG-DMSs)和CWG型差異甲基化位點(CWG-DMSs) (圖4)。CG-DMS和CWG-DMS大多數分布在基因間區和內含子區，DMS在不同功能元件上的分布詳情見圖5A和B?？梢钥闯鯟G-DMS的數目顯著多于CWG-DMS，基因間區和內含子區篩選到的DMS占較大比例。

2.4 位點水平的甲基化差異分析

對DMS所在的差異表達基因(DEG)進行GO功能富集分析，分析了CG和CWG甲基化水平中DEG最顯著豐富的前30條GO terms。分析基于篩選3個類別中具有2個以上不同表達位點相關基因的GO條目，根據每個條目對應的–lg10從大到小排序10個，分為生物過程、細胞成分和分子功能。在CG-DEG中，最顯著富集的GO term包括RNA剪接(RNA splicing)、剪接體復合體(spliceosomal complex)和ATP依賴的5′-3′DNA解旋酶活性(ATP-dependent 5′-3′ DNA helicase activity) (圖6A)。CWG-DEG的GO富集分析結果表明，生物過程、細胞成分和分子功能中最顯著富集的GO term分別是上皮細胞遷移，開放性氣管系統(epithelial cell migration, open tracheal system)、中心體(centrosome)和蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)(圖6B)。

表3 甲基化位點數據及其深度統計

Tab.3 Statistics of methylation site data and depth

圖2 甲基化位點在不同基因功能元件上的分布

A：CG位點的分布；B：CWG位點的分布

A: Distribution of CG methylation site; B: Distribution of CWG methylation site

圖3 甲基化位點在TSS、TTS和Genebody的分布

A：CG位點在TSS的分布；B：CG位點在TTS的分布；C：CG位點在TSS、TTS和Genebody的分布；D：CWG位點在TSS的分布；E：CWG位點在TTS的分布；F：CWG位點在TSS、TTS和Genebody的分布

A: Distribution of CG sites in TSS; B: Distribution of CG sites in TTS; C: Distribution of CG sites in TSS, TTS, and Genebody; D: Distribution of CWG sites in TSS; E: Distribution of CWG sites in TTS; F: Distribution of CG sites in TSS, TTS, and Genebody

圖4 差異甲基化位點統計

KEGG通路分析用于篩查DEG在CG和CWG甲基化水平上的生物學通路和信號轉導。圖7顯示了CG-DMG富集到的前20個KEGG通路。結果顯示，CG-DMG在HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、剪接體(spliceosome)、孕酮介導的卵母細胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)、卵母細胞減數分裂(oocyte meiosis)和細胞周期(cell cycle)通路顯著富集(圖7A)。下調DEG在富集剪接體通路，而上調DEG在HIF-1信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟、卵母細胞減數分裂、細胞周期和cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)顯著富集(圖7B, C)。HIF脯氨酰羥化酶()、己糖激酶()、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶mTOR樣()和溶質載體家族2 (促進葡萄糖轉運蛋白)成員1 ()在HIF-1信號通路中顯著富集上調表達(表4)。細胞分裂周期5樣蛋白()、U1小核核糖核蛋白()、前mRNA處理因子()、剪接因子()、WW結構域結合蛋白()基因參與剪接體途徑且顯著下調表達(表4)。

圖5 差異甲基化位點在不同基因功能元件上的分布

A：CG位點的分布；B：CWG位點的分布

A: Distribution of CG methylation site; B: Distribution of CWG methylation site

圖6 CG和CWG以及上調和下調差異甲基化位點所在基因的前30個GO功能條形圖

A：CG位點DEG的GO分類前30；B：CWG位點DEG的GO分類前30

A: The top 30 GO classification of the DEGs at the CG site; B: The top 30 GO classification of the DEGs at the CWG site

圖7 CG差異甲基化位點所在基因的前20條KEGG富集分析

A：CG差異甲基化位點的KEGG富集分析top 20；B：下調表達CG差異甲基化位點的KEGG富集分析top 20；C：上調表達CG差異甲基化位點的KEGG富集分析top 20

A: The top 20 KEGG enrichment analyses of the CG-DEG; B: The top 20 KEGG enrichment analyses of down-regulated expression of CG-DEG; C: The top 20 KEGG enrichment analyses of up-regulated expression of CG-DEG

表4 HIF-1信號通路和剪切體通路中差異表達基因

Tab.4 Differentially expressed genes of HIF-1 signaling pathway and spliceosome

2.5 基因水平的甲基化差異分析

對不同比較組間的差異表達甲基化位點所在基因進行統計，差異甲基化基因數目見圖8。CG位點共注釋到12892個表達甲基化基因，其中篩選到158個CG型差異甲基化基因(CG-DMGs)，包括77個(48.73%)上調表達和81個(51.27%)下調表達；CWG位點注釋到8666個甲基化基因，其中94個顯著差異表達，上調基因33個(35.11%)，下調基因61個(64.89%)。與DMS表達相同，下調表達基因多于上調表達。

圖8 組間差異甲基化基因火山圖

A：CG型差異甲基化基因分布；B：CWG型差異甲基化基因分布

A: Distribution of CG-DMG; B: Distribution of CWG-DMG

通過對差異甲基化基因進行GO功能富集，對基因的功能進行描述。GO富集分析前30如圖9所示：CG-DMG在肌肉組織發育(muscle organ development)過程顯著富集(圖9A)；CWG-DMG在囊泡介導的轉運(vesicle-mediated transport)、細胞膜(membrane)和鐵離子結合(zinc ion binding)等離子轉運過程中顯著富集(圖9B)。

CG-DMG共富集到39條顯著富集KEGG通路(0.05)，可分為5類，包括cellular processes (4條)、environmental information processing (6條)、genetic information processing (2條)、metabolism (16條)和organismal systems (11條)(圖9C)。發現41%的相關基因與代謝過程(16條)相關，其中脂質代謝通路(6個)中富集到的基因數目最多(圖9C)。CWG-DMG富集到21條KEGG通路，與CG型不同的是，CWG型缺少genetic information processing條目，大部分基因與生物過程(6條)相關，但信號轉導通路(4個)中富集到的基因數目最多(圖9D)。

2.6 組間差異甲基化位點在差異甲基化基因上的分布

對2組DMS和DMG進行比對分析，196個CG- DMSs對應到125個CG-DMGs上，36個CWG-DMSs比對到34個CWG-DMGs (表5)?；蚝图谆稽c表達大部分呈正相關，但有一少部分位點與基因呈負相關。共13個CG-DMSs與對應的9個CG-DMGs呈負相關，其中，有8個CG-DMSs高甲基化而基因表達下調，5個CG-DMSs低甲基化而基因表達上調，只有2個CWG-DMSs與對應的2個CWG-DMGs呈負相關，均是高甲基化而基因下調表達(表6)。對所篩選到的負相關的甲基化位點所在功能元件進行統計，發現CG-DMS和CWG-DMS絕大比例分布在基因間區，僅有1個CG-DMS分布在內含子區，具體詳情見表6。

2.7 qRT-PCR驗證

為了驗證MethylRAD-seq檢測到的DMS所在DEG的甲基化水平變化及其在鹽堿環境下基因表達水平之間的相關性，利用qRT-PCR分析評估了與HIF-1信號通路、剪接體、孕酮介導的卵母細胞成熟、卵母細胞減數分裂和細胞周期通路相關的12個DEGs。結果顯示，這些基因存在顯著差異表達：、、、、和上調表達；、、、、和下調表達。長期鹽堿水養殖環境使脊尾白蝦鰓組織中這些基因的DNA甲基化狀態發生顯著變化 (圖10)。

圖9 差異甲基化基因的GO功能和KEGG通路富集

A：CG型差異甲基化基因的GO分類；B：CWG型差異甲基化基因的GO分類；C：CG型差異甲基化基因的KEGG富集通路；D：CWG型差異甲基化基因的KEGG富集通路

A: GO functional classification of CG-DMG; B: GO functional classification of CWG-DMG; C: KEGG pathway enrichment of CG-DMG; D: KEGG pathway enrichment of CWG-DMG

表5 差異甲基化位點映射到差異甲基化基因的數量統計

Tab.5 Quantitative statistics of differential methylation sites mapped to differential methylation genes

表6 差異甲基化位點與差異甲基化基因呈負相關的基因

Tab.6 Genes with negative correlation between differential methylation sites and differential methylation genes

圖10 KEGG富集途徑中差異表達基因的qRT-PCR結果

3 討論

DNA甲基化對真核生物生長發育至關重要，包括調節配子的形成、早期胚胎發育、細胞分化、衰老和致癌等關鍵過程(Varriale, 2006; 蔡影等, 2018)。無脊椎動物的整體基因組胞嘧啶甲基化水平較低，甲殼類動物和昆蟲相比其他無脊椎動物如軟體動物的胞嘧啶甲基化水平更低(Gavery, 2013)。本研究中，通過對正常海水養殖和長期鹽堿水養殖的脊尾白蝦鰓組織構建DNA甲基化文庫，利用MethylRAD測序，發現了一些可能與脊尾白蝦鰓組織響應鹽堿脅迫的差異甲基化位點及其相關基因和差異甲基化基因。結果顯示，SAS組鰓組織基因組中CG和CWG位點略有增加，表明鹽堿水環境誘導脊尾白蝦鰓組織基因組中DNA甲基化升高，通過激活或抑制某些通路的表達來適應鹽堿環境，在脊尾白蝦適應外界環境的變化中發揮著非常重要的作用。環境變化總能引起水生生物DNA甲基化的變化，研究發現，水環境中化合物和溫度等外界環境變化能夠引起斑馬魚()和仿刺參() DNA甲基化水平升高(陳宏姍等, 2016; Yang, 2020)。隨著環境條件的變化，水生生物DNA甲基化的水平可能出現趨勢性變化，例如，隨著干露脅迫時間的增長，太平洋牡蠣()基因組甲基化水平呈現先增高后降低的趨勢；斑馬魚ZF4細胞在短期低溫培養時基因組DNA甲基化水平明顯增高，但長期低溫培養后DNA甲基化水平反而下降(張鑫等, 2017; 侯艷雯等, 2019)。也有研究表明，高溫脅迫使得仿刺參、蝦夷扇貝()和近江牡蠣() CG平均甲基化水平顯著降低(溫爭爭等, 2021; 吳彪等, 2016; 王翠麗等, 2019)。之前的研究發現，CG位點在各種物種中顯示出較高水平，范圍從蝦夷扇貝約89.5%到仿刺參約91% (呂佳, 2013; 李玉強等, 2018)。除CG外，CWG甲基化在基因內并不常見，但在基因組的基因間和內含子區域中更為豐富(Lister, 2009)。本研究中，甲基化位點水平相對定量結果顯示，脊尾白蝦CG型甲基化與其他海洋無脊椎動物類似，是甲基化主要的表現形式。

DNA甲基化水平根據基因組功能元件的不同而變化，且在基因組的基因間區和內含子區域中更為豐富。研究表明，DNA甲基化的分布主要分布在基因間、外顯子、內含子、下游和上游區域(Saha, 2020; Li, 2021)。此外，大量研究發現，脊椎動物甲基化位點主要在啟動子區(promoter)分布，啟動子區CG型甲基化水平決定轉錄水平結果(Xu, 1999; Yoder, 1997; Jiang, 2019; 齊云峰等, 2019)。但海洋無脊椎動物香港巨牡蠣()、仿刺參等甲基化位點在基因間區和內含子區中更豐富(Rajan, 2021; 李玉強等, 2018;李欣容, 2022)。這與本研究中CG和CWG位點在不同功能元件中的分布結果相一致。同樣，本研究中，基因體的甲基化水平高于TSS和TTS。DNA甲基化會形成不易去除的局部異染色質化狀態，表明基因體具有相對穩定的染色體結構，抑制轉錄水平的進行?；騿幼訁^通常位于TSS的上游，負責基因的表達調控(Jiang, 2019)。在人()體組織中的研究表明，TSS下游區域的甲基化是基因表達的高度信息。本研究中，甲基化水平高峰期明顯處于TSS區下游，進一步推測脊尾白蝦基因間區CG型甲基化水平的高低可能影響基因在轉錄水平的表達，并且對轉錄水平抑制表達有著重要作用。在位點水平上對DEG進行GO分析發現，這些基因主要分為3類GO terms，包括生物過程、細胞成分和分子功能。這些功能包括RNA剪接、DNA重組轉錄調控和DNA模板，表明鹽堿脅迫誘導的甲基化變異抗性基因(Ackah, 2022)。進一步對DEG進行KEGG途徑富集分析表明，HIF-1信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟、卵母細胞減數分裂、細胞周期和剪接體途徑在脊尾白蝦鰓組織的鹽堿脅迫響應中起關鍵作用。

鰓是水生動物氧氣運輸、滲透壓調節、離子轉運、酸堿調節等的主要組織，環境因子如鹽度、pH、低氧等均可能造成鰓組織損傷，從而影響呼吸和離子轉運等功能(Nikinm, 2014)。缺氧誘導因子1(HIF-1)是一種堿性螺旋–環–螺旋–PAS結構域轉錄因子，能夠調控機體對環境適應性應答(楊夢思等, 2016)。另外，HIF-1可增強氧氣供給并介導低氧適應性反應。以往的研究發現，脊尾白蝦在低溶氧環境下易誘導HIF產生，從而刺激血液氧的供應能力(曹梅等, 2021)。高鹽堿脅迫會改變機體的滲透壓和酸堿平衡，機體不僅能通過離子調控、應激蛋白合成等維持，也會產生自我調節機制適應環境脅迫(王楠等, 2015)。在高鹽脅迫下，水生生物同樣易產生氧化應激及滲透壓失衡，Bal等(2021)觀察到高鹽水環境中印度囊鰓鯰()血紅蛋白含量顯著下降，耗氧率升高。在高堿度下，水環境無法維持羅非魚機體中足夠的溶解氧水平，最終導致死亡，若能保持水中充足氧含量，在高堿度下生物死亡率不會增加(Colt, 2013)。本研究發現，、、和在HIF-1信號通路中顯著富集上調表達。作為一種轉移酶，能夠催化葡萄糖的磷酸化，這是葡萄糖代謝的第一步，并能抑制ADP (Majewski, 2004)。mTOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶蛋白家族，能夠促進物質代謝，參與細胞凋亡、生長、增殖和運動，調節蛋白質合成和轉錄(Sarbassov, 2005)。同時，qRT-PCR結果顯示，基因的表達水平同甲基化水平均顯著上調，這意味著、、mTOR和可通過保持高甲基化水平促進其相應靶基因表達以響應鹽堿脅迫。

剪接體是由大量蛋白質和小核RNA組成的大型核糖核蛋白復合物，主要存在于真核細胞的細胞核中，是一種在轉錄后的初級轉錄物(Marondedze, 2020)。本研究中，、、、和參與剪接體途徑并且顯著下調表達，這意味著鹽堿脅迫減少了RNA過程和蛋白質合成通路。進一步表明，鹽堿脅迫可能通過減少RNA的合成，降低鰓組織的代謝速率以及參與RNA剪接的基因的甲基化狀態來抑制RNA剪接?？傊?，這些結果表明，DNA甲基化可能調節了以上基因以響應鹽堿脅迫。我們推測脊尾白蝦由于長期生活在鹽堿環境，DNA甲基化水平變化在響應鹽堿脅迫中發揮重要作用，鹽堿脅迫致使HIF-1信號途徑增強，同時抑制了剪接體的表達，從而進化出獨特的生存機制。

基因水平的GO和KEGG富集結果表明，鹽堿脅迫不僅影響細胞的生長發育，還與離子轉運有關，表明脊尾白蝦對鹽堿有較強的適應性。同時，本研究發現一些差異甲基化基因在一些信號通路中富集。離子轉運相關基因在許多生理功能和細胞過程中影響不同的滲透調節(Cao, 2019; Si, 2019; Zimmer, 2021)。另外，水生動物對外部非生物環境的適應不僅有內在的調節，而且取決于能量的支持(Song, 2021; Su, 2020; Root, 2021)。脊尾白蝦因長期鹽堿脅迫而導致脂質過氧化和生理代謝的變化，本研究中能量代謝通路和脂質代謝通路顯著富集，推測脊尾白蝦通過調節鰓組織DNA甲基化水平對能量代謝通路和脂質代謝通路的影響適應鹽堿水環境。

解整合素金屬蛋白酶17 (ADAM17 protein, ADAM17)是一種跨膜金屬蛋白酶，能夠參與多種蛋白質胞外域脫落，具有黏附和蛋白水解特性，參與細胞分子、生長因子受體及表皮生長因子受體過程，在膜結合型蛋白的翻譯后修飾中發揮關鍵作用(王超男等, 2016; Li, 2015)。鹽堿脅迫后ADAM17可能通過低甲基化促進膜結合型蛋白的翻譯后修飾，促進質膜對胞內環境的維持。類纖維囊蛋白(fibrocystin- L-like, FPC-L)是一個單次跨膜的受體樣蛋白，含有一個潛在蛋白激酶C磷酸化位點，胞外區存在被高度糖基化的可能(連培文等, 2011)。鹽堿脅迫下脊尾白蝦鰓組織中FPC-L可能發生糖基化，對翻譯后蛋白進行了修飾，從而適應鹽堿環境。細胞色素P450 (cytochrome P450 2L1-like, CYP450)主要分布在內質網和線粒體內膜上，能夠參與環境化合物在內的外源性物質(在類固醇/甾醇)的代謝(Ventura, 2017)。鹽堿水環境中，CYP450可能誘導脊尾白蝦鰓組織細胞凋亡，內質網和線粒體相關的凋亡途徑可能發揮了重要的作用。本研究中，我們發現ADAM17、FPC-L和CYP450呈現出低甲基化狀態。然而，對應的差異甲基化基因卻顯示表達水平在鹽堿環境下顯著升高，這表明DNA甲基化可能通過激活蛋白激素和防御化合物來誘導脊尾白蝦中ADAM17、FPC-L和CYP450的調節以適應鹽堿水環境。

4 結論

本研究通過對正常海水養殖和長期鹽堿水養殖脊尾白蝦的甲基化水平比對分析發現，鹽堿水環境下DNA甲基化水平略有增強，甲基化位點豐富呈現在基因間區和內含子區域并且在TSS區下游出現甲基化水平高峰期。分析了脊尾白蝦鰓組織在2種養殖水環境中位點和基因水平的富集通路及組間DMS和DMG的表達情況，提示和基因共同參與的HIF-1信號通路和和基因共同參與的剪接體通路可能在脊尾白蝦鹽堿水環境適應中發揮重要作用。進一步研究參與HIF-1信號通路和剪接體通路的基因表達情況，為揭示脊尾白蝦鹽堿水環境適應機制提供新的見解。位點水平和基因表達呈負相關的ADAM17、FPC-L和CYP450可作為后期解析脊尾白蝦鹽堿水環境下表觀調控的重點研究對象。因此，該研究將為揭示鹽堿水環境對脊尾白蝦的影響提供新的理論依據。

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Effects of Saline-Alkaline Water Environment on DNA Methylation of

QIN Zhen1,2, LI Jitao2①, LI Mingdong2, WANG Jiajia2, GE Qianqian2, LIU Ping2, LI Jian2

(1. National Experimental Teaching Demonstration Center of Aquatic Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao, Shandong 266071, China)

The global levels of soil and water salinization and alkalinization are increasing with the influence of climate and topography changes, as well as other natural and human factors. Saline-alkaline water (SAW) all over the world has specific characteristics such as high alkalinity, high pH, and complex water quality types, which inhibits the survival and culture of common aquatic animals. The ridgetail white prawnis an economically important marine shrimp with many advantages, such as widely environmental adaptability, rapid growth, and good reproductive capability. It is potentially suitable for large-scale culture in SAW; however, its adaptability to this environment remains unclear. Exploring theadaptability mechanism to SAW will help to guide culture management for marine crustaceans. In this study, the DNA methylomes of thegill tissue cultured in SAW and normal seawater (SW) were analyzed and the impact on gene regulation was investigated by MethylRAD sequencing. The results showed 2 347 003 and 416 176 methylations at the CG and CWG sites (W = A or T), respectively. Comparing the SAW and SW groups, the CG and CWG loci in the SAW group increased slightly, indicating that SAW induced more DNA methylation in the gill cells that activated or inhibited pathways and played a crucial role in the environmental changes adaption. Methylation was prevalent in the exon, intron, splice site, and upstream and downstream regions of thegill genes, as well as in the intergenic regions. DNA methylation sites were mostly distributed in the Genebody. The DNA methylation distribution curve peaked in the downstream sequence of the transcription start site and upstream sequence of the transcription termination site. The methylation label frequency was significantly higher in these regions in relation to other sequences. A total of 8805 differential methylation sites (DMSs) were screened, including 8189 CG DMSs and 616 CWG DMSs. Obviously, the CG DMS was significantly higher than the CWG DMS. The intergenic and intron regions accounted for a large proportion of the DMS observed. Overall, the DMS showed a higher trend in the genic downstream regions of the gene relative to upstream regions. The Gene Ontology (GO) enrichment analysis of the differentially expressed genes (DEGs) based on the DMS showed enrichment of genes involved in the "development, heterochrony, and protein disables isomerase activity," which played a role in the CG level down-regulation. In addition, "incubation involved in sorocarp development" and "nucleus and double-stranded RNA binding" were molecular functions up-regulated by the CG methylations. The down-regulated genes with CWG methylation were enriched for the "regulation of transcription and DNA template" process, while the up-regulated genes were enriched for the "epithelial cell migration and open trail” system. These two processes were induced incultured in saline-alkali water. The key genes in the HIF-1 signal and spliceosome pathways, such as,, and, play an important role in response to saline-alkaline stress; therefore, the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis based on DMS of the DEG was performed. In addition, 158 CG methylated genes (MGs) were detected in DEGs from shrimps exposed to SAW, among which 77 and 81 were up- and down-regulated, respectively. Moreover, 94 CWG MGs were differentially expressed, from which 33 and 61 were up- and down-regulated, respectively. GO enrichment analysis of the CG MGs showed significant enrichment of the "muscle organ development" process; CWG MGs were significantly enriched for the "vesicle-m transport" and "membrane mediated zinc binding plasma transport" processes. This indicated thatwas damaged by the saline-alkaline environment, but the shrimp may adapt to this stress by adjusting the ion balance. The KEGG enrichment analysis indicated that lipid metabolism and signal transduction pathways may play crucial roles in thegill tissue response to saline-alkaline stress. Moreover, changes in lipid peroxidation and physiological metabolism may be caused by long-term saline-alkaline stress. The energy metabolism pathway was significantly enriched and many different genes in the lipid metabolism pathway were expressed in the stressed. Therefore, it was speculated that the changes in DNA methylation level might play an important role in response to saline-alkaline stress. Overall, the results showed that a series ofphysiological activities related to environmental adaptation was activated by SAW. In addition, a small number of methylated loci were negatively correlated with gene expressions, which indicated a complex relationship between DNA methylation and gene regulation. Although,, andshowed hypomethylation, the corresponding differentially MGs showed a significantly increased expression level in a saline-alkaline environment. Therefore, genomic DNA methylation may promote gene expression under saline-alkaline stress, including the,, andgenes. This study analyzed the DNA methylation levels in gill tissue ofcultured with SAW and provided information that will further elucidate the molecular mechanisms involved in crustacean adaptation to saline-alkaline environment.

; Saline-alkaline water environment; DNA methylation; Differentially expressed gene

LI Jitao, E-mail: lijt@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20220310001

S917.4

A

2095-9869(2022)04-0033-18

*國家重點研發計劃課題(2019YFD0900404-03)、國家自然科學基金項目(32072974)、財政部和農業農村部: 國家現代農業產業技術體系和中國水產科學研究院基本科研業務費項目(2020TD46)共同資助 [This work was supported by National Key Research and Development Program of China (2019YFD0900404-03), National Natural Science Foundation of China (32072974), China Agriculture Research System of MOF and MARA, and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD46)]. 秦 楨，E-mail: 1285946211@qq.com

李吉濤，研究員，E-mail: lijt@ysfri.ac.cn

2022-03-10,

2022-04-07

http://www.yykxjz.cn/

秦楨, 李吉濤, 李明棟, 王佳佳, 葛倩倩, 劉萍, 李健. 鹽堿水環境對脊尾白蝦基因組DNA甲基化的影響. 漁業科學進展, 2022, 43(4): 33–50

QIN Z, LI J T, LI M D, WANG J J, GE Q Q, LIU P, LI J. Effects of saline-alkaline water environment on DNA methylation of. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(4): 33–50

(編輯 馮小花)