嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖頭腎轉錄組分析*

朱鑫海 張紫瑞 周麗穎 湯環宇 敖士齊 周一凡 高曉建 姜 群 張曉君

嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖頭腎轉錄組分析*

朱鑫海 張紫瑞 周麗穎 湯環宇 敖士齊 周一凡 高曉建 姜 群 張曉君①

(揚州大學動物科學與技術學院 江蘇 揚州 225009)

嗜水氣單胞菌()是嚴重危害翹嘴鱖()養殖生產的主要病原之一，為揭示嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖后宿主基因表達水平的變化，篩選免疫相關基因，解析翹嘴鱖應答病原細菌感染的分子機制，本研究以病原嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖，于感染24 h后，采集感染組與對照組翹嘴鱖頭腎組織，采用Illumina Hiseq 2000進行了RNA-Seq分析，原始數據拼接后組裝共獲得53 040個單基因(unigene)?；虿町惐磉_分析結果顯示，感染組和未感染組翹嘴鱖存在526個差異表達基因，包括254個上調基因和272個下調基因，其中，免疫相關的顯著上調的差異基因主要有炎癥和免疫原性細胞因子白介素、補體系統、MHCⅠ型抗原提呈、溶菌酶、絲氨酸蛋白酶抑制因子、泛素蛋白連接酶等。GO富集分析發現，差異基因主要涉及免疫應答反應和炎癥反應等，經KEGG富集分析顯示，89個通路富集顯著，免疫相關的代謝通路主要有內吞作用和吞噬體等。此外，實時熒光定量PCR驗證結果表明，所選取7個差異表達免疫相關基因與RNA-seq結果具有相似的表達趨勢。本研究為揭示翹嘴鱖對病原微生物感染的防御分子機制奠定了理論基礎。

翹嘴鱖；嗜水氣單胞菌；轉錄組；差異表達基因

嗜水氣單胞菌廣泛分布于各種淡水水域，宿主范圍十分廣泛，是淡水魚類最為常見的重要病原菌(秦莉等, 2014)，也是一種典型的人–獸–魚共染的病原菌(王藝等, 2019)，可引起人胃腸道感染、胃腸道外感染及敗血癥等(張曼等, 2020; 李小艷等, 2020)。該菌對鱖魚的危害頗為嚴重，感染后可引起肝、脾、腎等組織產生免疫反應，以抵御細菌感染。頭腎作為魚類重要的造血器官和免疫器官，其中的巨噬細胞與B淋巴細胞共同介導和參與免疫反應，維護魚類的機體健康(田敬云等, 2005)。高通量測序技術(RNA-seq)能獲得特定條件下生物體細胞或組織的所有轉錄本信息(曹梅等, 2021)，被廣泛應用于分析病菌感染宿主后的免疫應答。嗜水氣單胞菌是危害鱖魚養殖生產的主要病原，該菌感染鱖魚引起的免疫反應卻少有報道。因此，本研究利用RNA-seq技術對嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖后進行轉錄組分析，篩選翹嘴鱖免疫相關的差異表達基因，開展GO (gene ontology)分子功能注釋和KEGG通路富集分析，并利用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)技術對隨機選取的等7個與免疫相關的差異表達基因(DEGs)進行相對定量分析，以期獲得可能參與免疫反應的候選基因和調控通路，從而為解析翹嘴鱖免疫應答提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗鱖魚與菌株

健康翹嘴鱖由江蘇揚州市董氏特種水產有限公司提供，體重為(130±5) g。實驗前，于水溫為(26±2)℃的淡水循環養殖系統中暫養1周，以適應實驗環境。

實驗用嗜水氣單胞菌G3菌株分離于發病翹嘴鱖，由本實驗室保存(張悅等, 2017)。實驗挑取純培養菌株接種于LB培養液培養16 h，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用pH 7.2的無菌PBS緩沖液重懸菌體，并將菌懸液濃度調至2.3×106CFU/mL。

1.2 人工感染實驗

將健康的翹嘴鱖分為感染組與對照組。感染組每尾腹腔注射100 μL嗜水氣單胞菌懸浮液，對照組按同樣方式和劑量注射無菌PBS緩沖液。注射24 h后，每組隨機挑選3尾，取出頭腎組織，于液氮中備用。

1.3 RNA提取、cDNA文庫構建和轉錄組測序

采用Trizol法提取感染組與對照組翹嘴鱖頭腎組織總RNA，設置3個重復，RNA樣品使用DNaseⅠ去除基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠初步評價RNA質量，并分別使用NanoPhotometer?分光光度計、Agilent 2100生物分析儀進行RNA的純度、濃度及完整性檢測。使用poly-Toligo-attached磁珠純化mRNA，并利用隨機引物和反轉錄酶合成第1條cDNA；第2條cDNA由DNA聚合酶Ⅰ、RNase H、dNTPs合成；cDNA片段通過AMPure XP系統進行純化，PCR擴增獲得cDNA文庫；最后，在Illumina Hiseq 2000平臺上測序。

1.4 轉錄組denovo組裝和基因注釋

將Illumina Hiseq高通量測序平臺測得的原始數據去除接頭(adapter)、包含ploy-N和低質量reads質控后，用軟件Trinity (http://trinityrnaseq.sourceforge. net/)進行序列拼接得到unigene，使用BLAST算法(-value<10–5)對組裝的Unigene序列進行遺傳相似性比較，以進行蛋白質功能注釋，包括GO、COG (clusters of orthologous groups)、KOG (eukaryotic orthologous groups)、KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)、Nr (non-redundant)、Swiss-Prot、Pfam和EggNOG (evolutionarygenealogy of genes: non- supervised orthologous groups)數據庫。

1.5 基因差異表達分析

通過DESeq軟件對測序數據進行比對分析，并將錯誤發現率(false discovery rate，FDR)作為篩選差異表達基因(DEGs)的指標，篩選的標準是Fold Change≥2且FDR<0.01，將篩選出的DEG通過GO數據庫進行Pathway注釋并篩選富集GO條目和Pathway顯著性篩選。

1.6 熒光定量PCR驗證

利用qRT-PCR檢測7個選擇的免疫相關基因，以進一步驗證轉錄組測序的準確性。采用Primer Premier 5設計特異性引物并合成，引物序列見表1。qRT-PCR反應體系共20 μL，其中，正反向引物(10 μmol/L) 各0.4 μL、2×SuperMix 10 μL、ddH2O 8.2 μL、稀釋的cDNA模板1 μL。反應程序：94℃，5 min；94℃，10 s；60℃，30 s；72℃，15 s，共40個循環。以為內參基因，用2–??Ct法計算基因的相對表達量。

2 結果

2.1 測序數據及質量情況

利用Illumina HiSeq2000對翹嘴鱖頭腎組織進行測序，拼接共獲得53 040個的unigene，平均長度為1236 bp，N50為2319 bp，長度為300～500 bp的unigenes有21 667個，約為全部unigenes的40.85%。GC含量區間為48.23%～50.59%，Q30≥93.87% (表2)。測序數據與拼接結果比對顯示，6個樣本中能定位到組裝轉錄本上的clean reads所占的百分比在71.86%～ 77.44%之間。

2.2 unigene功能注釋

將unigene與GO、COG、KOG、KEGG、Nr、Swiss-Prot、Pfam和EggNOG共8個數據庫進行比對并注釋，共有21 693條unigene被注釋(表3)。

2.3 差異表達基因篩選

翹嘴鱖感染嗜水氣單胞菌24 h后的頭腎組織的轉錄組文庫與對照組比較分析。結果顯示，翹嘴鱖頭腎組織差異表達基因(DEGs)有526個，其中，差異表達上調基因有254個，差異表達下調基因有272個(圖1)。此外，翹嘴鱖感染嗜水氣單胞菌后免疫相關的主要差異表達基因顯示，上調表達的基因主要有炎癥和免疫原性細胞因子白介素(、、)、補體系統()、MHCⅠ型抗原提呈()、抗菌肽溶菌酶()、絲氨酸蛋白酶抑制因子()、泛素蛋白連接酶()等(表4)，說明這些免疫相關基因參與到抵抗嗜水氣單胞菌入侵的途徑中，對翹嘴鱖起到免疫保護作用。

表1 qRT-PCR所用引物

Tab.1 Primers for qRT-PCR

表2 樣品測序數據與組裝結果統計

Tab.2 Summary of sequencing and transcriptome assembly

注：Control-1、Control-2、Control-3為對照組；AH-1、AH-2、AH-3為實驗組。

Note: Control-1, Control-2, Control-3 were control groups; AH-1, AH-2, AH-3 were experimental groups.

表3 Unigene注釋統計

Tab.3 Summary of unigenes annotation

圖1 對照組和實驗組差異表達基因火山圖

軸表示fold change，軸表示差異表達的顯著性。

The x-axis represents fold change, the y-axis indicates significance of differential expression.

2.4 差異表達基因的GO功能分類分析

為進一步探究病原嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖后差異表達基因的功能，對差異表達基因進行GO功能注釋(圖2)。顯著富集GO條目主要涉及生物學過程(biological process, BP)、細胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)，分別為22、17和23個。細胞組分富集最顯著的為細胞、細胞組分、生物膜和生物膜組分；分子功能類富集最顯著的為結合和催化活性；生物學過程類富集最顯著的為細胞過程和單個有機體過程。此外，大量差異表達基因富集至與免疫相關的條目，如免疫系統過程、對刺激的反應、抗氧化活性等。

2.5 差異基因KEGG富集分析

共富集到89個代謝通路，選取前20位顯著富集通路進行KEGG富集分析，發現與免疫相關的代謝通路主要有內吞作用(endocytosis)、吞噬體(phagosome)、TGF-beta信號通路(TGF-beta signaling pathway)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)等(圖3)。內吞作用代謝通路如圖4所示，表明嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖后引起、、、和等參與內吞作用的相關基因顯著上調，而、和等參與內吞作用的相關基因顯著下調；吞噬體代謝通路(圖5)表明，嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖后引起、和等參與吞噬作用的相關基因顯著上調，而和等參與吞噬作用的相關基因顯著下調。

表4 感染嗜水氣單胞菌后差異表達的上調的主要免疫相關基因

Tab.4 Up-regulated immune-related DEGs after A. hydrophila infection

圖2 嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖實驗組與對照組表達差異基因GO分析

2.6 免疫相關基因qRT-PCR驗證

為了進一步驗證RNA-seq數據的準確性，選擇免疫相關基因、8、、、、和進行qRT-PCR分析。結果顯示，翹嘴鱖感染嗜水氣單胞菌24 h后，免疫相關基因的熒光定量表達結果與轉錄組測序結果一致(圖6)，此結果驗證了轉錄組測序數據的可靠性。

3 討論

翹嘴鱖在養殖過程中遭受多種病原的感染，其中，嗜水氣單胞菌感染會造成翹嘴鱖出血性敗血癥，嚴重損傷腎臟、肝臟及脾臟等組織，造成壞死和解體等病理變化(Chen, 2018)。本研究通過對嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖頭腎組織的轉錄本進行分析，挖掘免疫應答基因，為揭示翹嘴鱖抗嗜水氣單胞菌感染的分子機制提供理論依據。目前，高通量測序技術在嗜水氣單胞菌感染水產養殖動物后的宿主免疫反應研究中得到了廣泛應用。Xu等(2021)利用高通量測序技術比較了嗜水氣單胞菌感染和未感染的黃鱔()脾臟組織中基因表達差異，其中，上調表達基因有928個，下調表達基因有573個。Yuan等(2021)利用高通量測序技術比較了嗜水氣單胞菌感染和未感染的大口黑鱸()脾臟組織中基因表達差異，其中，上調表達基因有1748個，下調表達基因有2120個。Luo等(2018)利用轉錄組測序技術檢測嗜水氣單胞菌感染的長江鱘()，結果顯示，在感染的頭腎組織中共檢測到1728個DEGs，其中，980個上調表達基因和748個下調表達基因。本研究中，高通量測序結果顯示，嗜水氣單胞菌感染后，翹嘴鱖頭腎組織存在526個差異表達基因，其中，差異表達上調基因有 254個，差異表達下調基因有272個，大量基因都與炎癥、免疫、防御反應相關，這可能與嗜水氣單胞菌在翹嘴鱖體內大量復制和宿主抵抗細菌感染有關，表明嗜水氣單胞菌進入翹嘴鱖體內后，可誘導機體的非特異性免疫應答反應。

圖3 嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖實驗組與對照組表達差異基因KEGG通路富集分析

圖中每個圓表示1個KEGG通路。

Circle in the figure represents a KEGG pathway.

圖4 內吞作用的信號通路

基因表達上調和下調分別用紅色和綠色方框表示，下同。

The red boxes represent genes up-regulating, the green boxes represent genes down-regulating. The same as below.

圖5 吞噬體的信號通路

圖6 嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖后差異表達基因qRT-PCR分析

Fig.6 Comparative analysis of qRT-PCR of differentially expressed genes ofinfected with

病原生物感染水生動物后獲得大量差異表達基因，為分析宿主免疫應答方式和免疫防御提供了數據支持(劉文靜等, 2013)。本研究發現，嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖后，白介素8、、、補體系統受體、抗原提呈、溶酶體、絲氨酸蛋白酶抑制因子和泛素蛋白連接酶等免疫相關基因表達顯著上調，說明這些基因在感染中參與應答反應。其中，白介素IL是參與炎癥反應，免疫調節，刺激T細胞、B細胞增殖等免疫應答的關鍵因子(McBeath, 2007)。類似的研究發現，大西洋鮭()在接種殺鮭氣單胞菌()疫苗后，在其肝臟和腎臟中的表達顯著升高(Fast, 2007)。斑馬魚()在接種遲緩愛德華氏菌減毒疫苗后，基因出現明顯的上調表達(Yang, 2013)。MHC分子屬于免疫蛋白超家族，包括MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子，MHCⅠ類主要組織相容性復合抗原的功能是呈遞細胞內病原產生的肽給CD8+T細胞，誘導T細胞活化并殺死靶細胞。費超(2013)研究發現，用減毒鰻弧菌()注射斑馬魚能有效激發和免疫應答。溶菌酶基因在先天性免疫系統中充當著重要角色，負責抵抗病原微生物的入侵。Zhang等(2018)研究發現，加州鱸()感染嗜水氣單胞菌后，表達量顯著提高。

為更好地了解病原宿主之間的免疫應答及由細菌感染引起的一系列免疫反應的分子機制，本研究對嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖后頭腎組織差異表達基因進行GO富集和KEGG富集分析。GO富集分析顯示，顯著富集與免疫相關的GO條目有免疫系統過程、對刺激的反應、抗氧化活性等，說明嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖，導致宿主產生強烈的免疫應答反應。KEGG富集分析顯示，顯著富集的免疫相關通路有內吞作用和吞噬體。內吞作用是細胞外物質通過質膜的變形運動進入胞內的過程，也是病原感染細胞的常見感染途徑，在病原感染宿主細胞的早期發揮作用(Mayor, 2007)；從內吞作用通路可以看出(圖4)，顯著上調基因(、、、和)參與了網格蛋白(clathrin)介導的內吞途徑，而發動蛋白(dynamin)是該內吞途徑重要的蛋白，在網格蛋白介導的內吞過程中發揮“剪刀”的作用，將網格蛋白包被小窩與質膜分離(彭鏡等, 2011)；顯著下調基因(、和)也參與了網格蛋白介導的內吞途徑，并且G蛋白偶聯受體(GPCR)信號通路受到了以β抑制蛋白(β-arrestion)為主的一系列輔助蛋白的負調節(殷琳等, 2019)。此外，吞噬作用在魚類抵御病原細菌感染過程中發揮重要作用，對入侵的外源物質進行吞入和破壞(Zhao, 2016; 王超等, 2020)。吞噬過程主要分3個步驟：首先，病原細菌黏附到吞噬細胞表面；其次，抗原受體復合物通過內吞途徑形成吞噬體；最后，病原在吞噬體內被消除(Gotthardt, 2002; 邰光富等, 2013; Keller, 2017)。從吞噬體通路可以看出(圖5)，上調表達基因(、和)在病原識別到加工、運輸、呈遞中發揮重要作用，吞噬細胞表面的受體(和)首先識別病原，之后形成吞噬體，再通過微管蛋白(TUBB)等細胞骨架成分轉運至溶酶體，微管蛋白在吞噬作用中起著重要作用(Gunning, 2015)。

綜上所述，本研究利用RNA-seq技術分析了翹嘴鱖感染嗜水氣單胞菌后的應答反應，獲得多個顯著差異表達基因，這些差異表達基因參與了重要的信號通路，尤其是免疫信號通路。研究結果為揭示翹嘴鱖感染嗜水氣單胞菌的應答機制提供參考，為嗜水氣單胞菌引起翹嘴鱖細菌性敗血癥的防治提供理論基礎。

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Transcriptomic Analysis of the Head Kidney ofInfected with

ZHU Xinhai, ZHANG Zirui, ZHOU Liying, TANG Huanyu, AO Shiqi, ZHOU Yifan, GAO Xiaojian, JIANG Qun, ZHANG Xiaojun①

(College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009, China)

is one of the main pathogens seriously endangering mandarin fish farming and production. In order to explore the changes in host gene expression levels ininfection, screen for immune-related genes, and analyze the molecular mechanism ofinfected within response to pathogenic bacterial infectionThe head kidney tissues of the infected and control groups were collected 24 h after inoculation and used for mRNA extraction, and transcriptome sequencing was performed using high-throughput sequencing technology. A total of 53 040 single genes (unigenes) were obtained from the original sequencing data through de novo assembly. The results of gene differential expression analysis showed that there were 526 differentially expressed genes, of which 254 were upregulated and 272 were down-regulated in the infected and control groups. Among the differentially expressed genes, several key genes involved in the immune response, such as interleukin-8, interleukin-6 receptor, interleukin 17 receptor, lysozyme, complement receptor type 1, antigen processing and presentation, serine protease inhibitor, and E3 ubiquitin-protein ligase were present. Gene ontology analysis revealed that the different genes were mainly involved in immune response and inflammation. A KEGG analysis showed that there were 89 significantly enriched and immune-related metabolic pathways mainly involved with endocytosis and phagosomes. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) verification was performed on seven DEGs, and the results showed that RT-qPCR was consistent with RNA-Seq analysis. These results lay a theoretical foundation for a follow-up study of gene function and in-depth exploration of the molecular defense mechanism ofagainst pathogenic microorganism infection.

;; Transcriptome; Different expression gene

ZHANG Xiaojun, E-mail: zxj9307@163.com

10.19663/j.issn2095-9869.20210406001

S917.1

A

2095-9869(2022)04-0208-10

*江蘇省農業科技自主創新資金項目(CX(18)2012)資助[This work was supported by Jiangsu Agricultural Science and Technology Innovation Fund (CX(18)2012)]. 朱鑫海，E-mail: 18761046291@163.com

張曉君，E-mail: zxj9307@163.com

2021-04-06,

2021-06-01

http://www.yykxjz.cn/

朱鑫海, 張紫瑞, 周麗穎, 湯環宇, 敖士齊, 周一凡, 高曉建, 姜群, 張曉君. 嗜水氣單胞菌感染翹嘴鱖頭腎轉錄組分析. 漁業科學進展, 2022, 43(4): 208–217

ZHU X H, ZHANG Z R, ZHOU L Y, TANG H Y, AO S Q, ZHOU Y F, GAO X J, JIANG Q, ZHANG X J. Transcriptomic analysis of the head kidney ofinfected with. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(4): 208–217

(編輯 馬璀艷)