基于窄內徑毛細管-LIF 檢測系統的miR-221-3p 超小體積無擴增檢測

高瀟瀟，王亮霞，常亞冉，張文美，汪夏燕

北京工業大學環境與生命學部化學與生物系，北京 100124

0 引 言

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類序列非常短的（約19-24 nt）蛋白質非編碼RNA 分子，主要通過誘導信使RNA（mRNA）降解和翻譯抑制來調節基因表達。miRNA 的異常表達與許多生物過程和疾病有關[1，2]，尤其是癌癥[3，4]、心臟病[5]、神經系統疾病[6，7]等[8，9]，且每種疾病的發生往往伴隨著多種miRNA 的異常表達。因此，miRNA 的檢測可以為了解多種生物過程及準確診斷疾病提供有價值的信息。miRNA 具有尺寸小、豐度低、易降解、家族成員間序列相似等特點[10,11]，因此，直接定量檢測miRNA 是具有挑戰性的難題。多數miRNA 檢測方法是基于擴增或修飾的，比如實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）[12]、微陣列[13]、二代測序[14]、等溫擴增[15]等技術。這些依賴于擴增的方法會引起定量偏差、保真度低等問題。因此，發展無擴增的miRNA檢測方法具有重要意義。

通常，基于無擴增的miRNA 檢測方法其特異性和靈敏度均比基于擴增的方法低，因此，對探針的識別能力和儀器的靈敏度要求更高。通過設計miRNA 的雜交探針，可以在復雜體系中特異性識別miRNA。常用的miRNA 雜交探針有兩種：單鏈DNA[16]和莖環結構的DNA[17]。分子信標（molecular beacon，MB）是Tyagi 和Kramer 在1996 年設計的一種莖環結構的寡核苷酸熒光探針[18]，可以對核酸進行識別，具有特異性強、背景信號弱、靈敏度高等特點，在生物醫學等領域廣泛應用。此外，具有高親和力和高特異性的鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）和肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）的探針也被用于miRNA 的無擴增檢測。

隨著液相色譜設備逐漸微型化，內徑較小的微/納米通道由于具有超小體積需求以及高的分離效率被用于液相色譜分析[19,20]，在DNA、蛋白質、氨基酸等生物樣品的分析中表現出較高的分離效率以及靈敏度[21～23]。本研究將內徑為1.06 μm 的窄內徑毛細管與高靈敏的激光誘導熒光檢測系統耦聯，構建窄內徑毛細管-激光誘導熒光（LIF）檢測系統，并用于分子信標探針標記的微小核糖核酸221-3p（miR-221-3p）的無擴增檢測，以miR-221-3p 為檢測靶標設計了鎖核酸（LNA）修飾的MB（LNA/MB-221）探針，優化了LNA/MB-221 探針的緩沖體系以及與靶標雜交的最適溫度，評價了方法的檢出限，并對人胚肺成纖維細胞和非小細胞肺癌細胞的miR-221-3p 進行了檢測及相對表達量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

儀器：VeritiPro?96 孔梯度型熱循環儀（Thermo Fisher 公司）；Generadar 618 型核酸電泳儀（深圳市海普諾科技發展有限公司）；Gel Doc XR+型凝膠成像系統（Bio-Rad 公司）；BioPhotometer Plus 型核酸蛋白測定儀（Eppendorf 公司）；LightCycler 96型實時熒光定量PCR 儀（Roche 公司）；GenPure UV/UF 型超純水系統（Thermo Fisher Scientific公司）。

試劑與材料：三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化鎂（MgCl2·6H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、硼酸（H3BO3）等試劑均為分析純，購于國藥集團；RPMI-1640 培養基、Ham’s F-12K 培養基、胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素以及L-谷氨酰胺等細胞培養相關試劑購于Gibco 公司；miRNA 標準品和焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水購于蘇州吉瑪基因股份有限公司；瓊脂糖購于Biowest 公司；DNA 標準分子量Marker 和上樣緩沖液購于上海捷瑞生物工程有限公司；iTaq Universal qPCR mix 購自Bio-Rad 公司；miRNA 第一鏈cDNA合成試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；LNA/MB-221 探針由Takara 公司合成；QIAzol 裂解液和miRNeasy 試劑盒購于Qiagen 公司；實驗用水為超純水。

1.2 試劑配制

Tris-EDTA（TE）緩沖液：稱取2.423 g Tris 和0.744 5 g EDTA 溶于200 mL 超純水中，用1 mol/L的HCl 調節pH 值至8.01，得到濃度為100 mmol/L的TE 溶液。

MgCl2溶液：稱取2.030 g MgCl2·6H2O 溶 于100 mL 超純水中，用1 mol/L NaOH 調節pH 值至8.0，得到濃度為100 mmol/L 的MgCl2溶液。

Tris-硼酸（TBE）電泳緩沖液：稱取54.0 g Tris、3.72 g EDTA和27.4g硼酸溶于1L超純水中，用1 mol/L NaOH 調節pH值至8.3，配制成TBE 儲液（5×），再稀釋為TBE 緩沖液（0.5×）作為電泳工作液。

1.3 樣品處理及核酸雜交

本研究中所使用的miRNA 序列從miRBase 數據庫中獲取，探針序列根據miRNA 序列設計。miR-221-3p 的序列如下：AGC UAC AUU GUC UGC UGG GUU UC；LNA/MB-221 探針序列如下：FAM-AGC GTC GAA ACC CAG CAG ACA ATG TAG CTG ACG CT-Dabcyle（FAM 為6-羧基熒光素；Dabcyle 為4-(4′-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸）。樣品溶解之前先置于高速離心機內，以12 000 r/min 的轉速離心1 min，將吸附于管壁或蓋子中的樣品離心至管底。根據樣品管壁上標注的物質的量加入適量的溶劑，將LNA/MB-221 探針用超純水溶解至20 μmol/L，miRNA 用DEPC 溶液溶解至20 μmol/L。為避免樣品反復凍融，分別將DNA 和miRNA 以10 μL 分裝后于冰箱中-80 ℃保存，使用時稀釋至2 μmol/L。將等濃度等體積的miR-221-3p 和LNA/MB-221 混合，在熱循環儀中以95 ℃5 min、不同退火溫度（室溫、55～75 ℃）孵育30 min、4 ℃5 min 的條件下進行雜交。

1.4 窄內徑毛細管-LIF 檢測系統的構建

窄內徑毛細管-LIF 檢測系統是由窄內徑毛細管、壓力艙和可視化聚焦的激光誘導熒光檢測器組成，如圖1(a)所示。所用激光誘導熒光檢測系統由本課題組自行搭建，檢測系統由激發光路、熒光收集光路和成像校準光路構成[24]。本小組將原焦距750 mm 的平凸圓形柱面透鏡改為焦距300 mm 的柱透鏡，使光學系統擁有更好的聚光能力，同時減小可視化實時成像校準激光誘導熒光檢測系統的體積。

采用掃描電子顯微鏡（SEM）對窄內徑毛細管的截面進行表征。如圖1(b)所示，毛細管內徑為1.06 μm。將窄內徑毛細管安裝在檢測系統上，向毛細管內注入TE 緩沖液，通過可視化實時成像聚焦，然后向毛細管內注入樣品，在穩定激光功率（1 mW）下檢測樣品的熒光信號。采用LabVIEW軟件對檢測過程進行實時監測。

圖1 （a）窄內徑毛細管-LIF 檢測系統示意圖；（b）窄內徑毛細管截面的SEM 圖Fig.1 (a)Schematic diagram of narrow inner diameter capillary -LIF detection system;(b)SEM image of the cross-section of narrow inner diameter capillary

1.5 LNA/MB-221 探針與miR-221-3p 雜交效率的檢測

用0.5 g 瓊脂糖與50 mL TBE 緩沖液制作濃度為1%的瓊脂糖凝膠，將待檢測的雜交樣品與上樣緩沖液（5×）混勻，依次取5 μL 于點樣孔中，在100 V 電壓下電泳45 min。電泳結束后，在凝膠成像系統中觀察并拍照，根據電泳條帶數量評價雜交效率。

1.6 細胞培養及miRNA 提取

非小細胞肺癌細胞系A549 細胞、人胚肺成纖維細胞系HFL-1 細胞均購于中國科學院細胞庫。A549 細胞和HFL-1 細胞分別使用RPMI-1640 和Ham’s F-12K 培養基培養。RPMI-1640 培養基中加入體積分數10%的胎牛血清、200 μg/mL 的L-谷氨酰胺和100 U/mL 的青-鏈霉素；Ham’s F-12K 培養基中加入體積分數10%的胎牛血清、1%的L-谷氨酰胺、1%的非必需氨基酸和1%的丙酮酸鈉溶液。將細胞以每孔3×105個的密度接種于6 孔板中，置于37 ℃，含5% CO2的培養箱中培養。當細胞覆蓋度達到90%時，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗，棄上清，添加1 mL QIAzol裂解液裂解細胞。將裂解物收集在1.5 mL 微量離心管中，使用miRNeasy 試劑盒提取miRNA。用核酸蛋白測定儀測定miRNA 濃度，A549 細胞和HFL-1 細胞中提取到的總miRNA濃度分別為2 469.4 ng/μL 和812.7 ng/μL。

1.7 RT-qPCR 檢 測miRNA 表 達

miRNA 第一鏈cDNA 合成：反應體系為20 μL，其中反轉錄緩沖液10 μL、酶2 μL、總miRNA 100 ng，加無RNA 酶的水定容至20 μL。反應條件為：37 ℃60 min，85 ℃5 min，再冷卻至4 ℃保存。

miRNA 熒光定量PCR：miR-221-3p 的引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列為5′-CAG CTA CAT TGT CTG CTG GGT TTC-3′。 將cDNA 合成產物稀釋50 倍后進行PCR 檢測，反應總體系為20 μL，其中iTaq Universal qPCR mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、稀釋后的cDNA 2 μL，最后加無RNA 酶的水定容至20 μL。使用Roche Light Cycler 96 擴增儀進行PCR 擴增反應，反應條件為：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃10 s，40個循環。以U6 作為內參基因，用于標準化分析，采用比較Ct 法定量計算相對基因表達。

2 結果與討論

2.1 條件優化

MB 是一種具有發夾結構的熒光標記核酸探針，影響MB 探針的外部因素有溫度、pH 值和緩沖液的離子濃度[25]。高溫以及高pH 值均會破壞分子信標的莖環結構，使其變成隨機的線狀結構，導致熒光基團和猝滅基團間的距離變大，猝滅基團不能汲取熒光從而產生熒光信號。緩沖液中的離子濃度影響MB 探針莖環結構的穩定性，進而影響探針的熒光強度。由于本研究中不涉及高pH 值環境，因此，僅對緩沖體系中的MgCl2濃度以及雜交溫度進行優化。

2.1.1 緩沖體系MgCl2濃度

在保持室溫和pH 8.0 不變的TE 緩沖體系中，探討了MgCl2濃度對LNA/MB-221 探針熒光信號的 影 響。圖2(a)為LNA/MB-221 探 針（0.01～1 μmol/L）在不同濃度（0～7 mmol/L）MgCl2溶液中的熒光強度變化?？梢杂^察到，不同濃度的LNA/MB-221 探針在不含MgCl2的溶液中熒光強度均是最高的，而加入MgCl2之后，探針的信號顯著降低，且隨著MgCl2溶液濃度的不斷升高，探針的信號強度逐漸減弱；當MgCl2溶液濃度大于等于3 mmol/L時，探針的信號強度趨于穩定。圖2(b)為10 nmol/L LNA/MB-221 探針在不同濃度MgCl2溶液中的熒光強度?？梢杂^察到，當MgCl2溶液濃度大于等于3 mmol/L 時，LNA/MB-221 探 針 無 明 顯 的 熒 光 信號，接近基線。因此，為保證探針本身的信號不干擾miRNA 的檢測，本文選用4 mmol/L 的MgCl2溶液作為緩沖體系。

圖2 （a）0.01～1 μmol/L LNA/MB-221 探針在不同濃度MgCl2溶液中的熒光強度；（b）10 nmol/L LNA/MB-221探針在不同濃度MgCl2溶液中的熒光強度Fig.2 (a)The fluorescence intensity of 0.01～1 μmol/L LNA/MB-221 probe in various concentration of MgCl2 solution;(b)the fluorescence intensity of 10 nmol/L LNA/MB-221 probe in various concentration of MgCl2 solution

2.1.2 雜交溫度

雜交過程的退火溫度會影響核酸的穩定性及雜交效率。在室溫～75 ℃考察了溫度對LNA/MB-221 探針和miR-221-3p 雜交樣品的影響。如圖3 所示，從室溫至75 ℃，LNA/MB-221 探針均能與miRNA 雜交，圖中未出現非特異性條帶。采用激光誘導熒光檢測不同溫度下雜交樣品的熒光強度。不同雜交溫度下的樣品熒光強度間差異較小，其中以溫度為65 ℃時的樣品熒光信號略強。因此，本文選用的雜交溫度為65 ℃。

圖3 不同退火溫度下LNA/MB-221 與miR-221-3p雜交樣品的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of the hybrid of LNA/MB-221 and miR-221-3p at different annealing-temperature M：DNA marker；1：miR-221-3p；2：LNA/MB-221；3：room temperature；4：55 ℃；5：60 ℃；6：65 ℃；7：70 ℃；8：75 ℃

2.2 檢出限

由MgCl2濃度優化實驗結果可知，10 nmol/L LNA/MB-221 探針在3～7 mmol/L MgCl2緩沖體系中幾乎無熒光信號，因此可認為，探針本身在所檢測條件下對背景信號無貢獻，只有與靶標結合后才會產生熒光信號。

將LNA/MB-221 探針與等摩爾量的miR-221-3p雜交，檢測不同濃度雜交樣品的熒光信號強度，以評價檢測方法的靈敏度。在100 psi（145 psi=1 MPa）氣壓下進樣10 s，再以800 psi的氣壓驅動，檢測LNA/MB-221 探針與miR-221-3p 雜交后樣品（1～10 nmol/L）的熒光強度，進樣量約為850 fL，結果如圖4(a)所示。濃度為1、2.5、5、7.5、10 nmol/L 的雜交樣品峰高的相對標準偏差分別為4.4%、5.2%、6.2%、4.2%和7.4%（n=3），表明該方法對LNA/MB-221 與miR-221-3p雜交樣品的檢測具有良好的重現性。1 nmol/L 雜交樣品色譜峰的信噪比約為3.26（大于3 倍信噪比），因此，基于分子信標探針對miR-221-3p 的濃度檢出限為1 nmol/L，物質的量檢出限為8.5×10-22mol，約為508 個分子。

圖4(b)為濃度1～10 nmol/L 雜交樣品的熒光強度與濃度的線性關系圖，相關系數為0.999 6，表明線性關系良好。

圖4 （a）雜交樣品的色譜峰（插圖為1 nmol/L 雜交樣品的色譜峰）；（b）雜交樣品的熒光強度與濃度的線性關系圖Fig.4 (a)Chromatogram of the hybrid (the inset presents the chromatogram of the hybrid of 1 nmol/L);(b)linearly fitted plot of fluorescence intensities and concentrations of the hybrid

2.3 特異性

為了研究LNA/MB-221 探針對檢測miR-221-3p 的特異性，對在大多數細胞中高表達的miR-21以及miR-205 的干擾能力進行了考察。在相同實驗條件下，將1 μmol/L LNA/MB-221 探針分別與等 摩 爾 量 的miR-221-3p、miR-21 和miR-205 進 行雜交，隨后以800 psi 壓力持續將樣品注入毛細管中，檢測其熒光信號，結果如圖5 所示。探針濃度為1 μmol/L，遠大于10 nmol/L，因此，探針本身有微弱的背景信號；miR-21 和miR-205 與探針的雜交樣品呈現一定的熒光強度變化；而miR-221-3p 與探針雜交樣品熒光強度顯著。結果表明，該方法對miRNA-221-3p 的檢測具有較高的特異性。

圖5 LNA/MB-221 探針檢測miRNA 的特異性Fig.5 Specificity of LNA/MB-221 probe for miRNA detection

2.4 細胞中miR-221-3p 的檢測

將該方法用于HFL-1 細胞和A549 細胞總miRNA 樣品中miR-221-3p 的相對表達量分析，以評價該方法在實際樣品中檢測miRNA 的可行性。圖6(a)為HFL-1 細胞和A549 細胞中miR-221-3p的熒光信號峰，HFL-1 細胞的檢測信號較A549 細胞高，與文獻報道的miR-221-3p 在衰老的HFL-1細胞中顯著上調的結果[26]一致。采用RT-qPCR 法測定了miR-221-3p 的相對表達量，以驗證本文結果。圖6(b)為RT-qPCR 法測定HFL-1 細胞和A549 細胞中miR-221-3p 的相對表達量。結果表明，HFL-1 細胞中miR-221-3p 的表達量較A549 細胞中高，與本文無擴增檢測得到的結論相似。這表明了本研究中所使用的無擴增的熒光方法檢測結果具有一定的準確性。

圖6 HFL-1 細胞和A549 細胞miR-221-3p 的檢測（a）激光誘導熒光法檢測HFL-1 和A549 細胞中miR-221-3p 的色譜圖；（b）RT-qPCR 法測定HFL-1 和A549 細胞中miR-221-3p 的相對表達量Fig.6 The detection of miR-221-3p in HFL-1 and A549 cell(a)The chromatogram of miR-221-3p in HFL-1 and A549 cells were detected by LIF detection system;(b)the relative expression of miR-221-3p in HFL-1 and A549 cell lines was determined by RT-qPCR

3 結 語

本研究以內徑為1.06 μm 的毛細管耦聯可視化實時成像的LIF 檢測器構建了窄內徑毛細管-LIF檢測系統，用于分子信標探針標記的miRNA 無擴增檢測。以miR-221-3p 為靶標設計鎖核酸修飾的分子信標探針LNA/MB-221，對LNA/MB-221 探針緩沖體系中MgCl2溶液濃度和雜交溫度進行了優化。當MgCl2溶液濃度大于3.0 mmol/L 時，探針的背景干擾較??；雜交溫度為65 ℃時，探針與靶標雜交樣品的熒光信號最高。LNA/MB-221 探針與miR-221-3p 的雜交樣品在低濃度范圍內（1～10 nmol/L）具有良好的線性相關性，濃度檢出限為1 nmol/L，且樣品僅消耗850 fL，其物質的量檢出限為8.5×10-22mol，約為508 個分子。此外，采用該方法對HFL-1 和A549 細胞中miR-221-3p 實現了無擴增檢測，與RT-qPCR 檢測結果一致。無擴增的檢測方法有望為基于miRNA 的復雜人類疾病監測和檢測提供新的思路。