負載分子信標的生物礦化納米載體用于檢測microRNA

吳玉婷，王彩霞?，劉志洪，2?

1. 湖北大學化學化工學院/有機化工新材料湖北省協同創新中心/有機功能分子合成與應用教育部重點實驗室，湖北 武漢430062；2. 武漢大學 化學與分子科學學院，湖北 武漢430072

0 引 言

微小核糖核酸microRNA（簡稱miRNA）是一類長度為19～23 個核苷酸的短單鏈非編碼RNA，其異常表達與腫瘤的發生和發展密切相關，因此miRNA 作為腫瘤標志物和治療靶點的研究受到了廣泛關注[1,2]。逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）是基因檢測中最常用的miRNA 檢測方法，但由于設備昂貴、檢測過程復雜，只能用于體外檢測，不能滿足在活細胞中檢測miRNA 的需求。分子信標（molecular beacon，MB）作為最常用的核酸探針具有高生物相容性和高選擇性，且易于合成、可設計性強，在基因檢測方面表現出很大優勢[3～5]。MB 是一類具有莖環（stem-loop）發夾結構的單鏈核酸分子，識別序列位于環路區域，其莖區域熒光團的熒光易被附近的猝滅基團猝滅[4]；當遇到特定RNA時，MB 的發夾結構與其形成穩定的雜化雙鏈而打開，可使熒光恢復[6，7]。因此，可以利用體系中MB熒光信號的變化來檢測目標RNA。但通常情況下，游離的MB 不易被活細胞攝取，而易被細胞內的核酸酶降解，導致假陽性信號的產生，從而影響MB 的檢測效果[8]。為了實現活細胞內高靈敏度檢測miRNA，迫切需要設計一種能將MB 高效遞送至細胞內的納米載體。用于遞送MB 的無機納米載體主要有金屬及其化合物[9，10]、金屬-有機框架[11]、碳基材料[12]等。但這些材料存在難以降解的問題，可能導致生物毒性。使用不同的生物模板（如蛋白質和多肽）修飾無機物，可以得到生物礦化納米載體，制備方法簡單、降解性能好，且易于修飾，具有廣闊的臨床應用前景[13,14]。磷酸鈣、碳酸鈣、硅酸鈣等是生物硬組織的主要無機成分，可以在酸性環境下降解成無毒的離子，參與生命體的正常代謝。因此，基于磷酸鈣、碳酸鈣、硅酸鈣等的生物礦化納米材料具有良好的生物相容性和降解性能，可用于遞送蛋白質、多肽和藥物，廣泛用于疾病的診斷與治療[15～18]。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為一種生物礦化相關蛋白，其分子中的酸性殘基可以螯合過飽和亞穩態溶液中的Ca2+形成成核位點，不斷濃縮Ca2+以增加局部過飽和度，隨后在磷酸鹽參與下，自發形成磷酸鈣（CaP）[19，20]?；谝陨涎芯?，本文以白蛋白為生物模板，表面礦化磷酸鈣，得到一種生物礦化納米載體BSA/CaP，再通過Ca2+與MB 的靜電相互作用負載MB，得到納米探針MB@BSA/CaP，并將其用于檢測腫瘤細胞中過表達的標志物miRNA-155。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

儀 器：RF-6000 型 熒 光 光 譜 儀（Shimadzu 公司），Nicolet iS10 型Fourier 轉換紅外光譜儀（FTIR，Thermo Scientific 公司），JEM-2100 型透射電子顯微鏡（TEM，JEOL 公司），ZS90 型納米粒度電位儀（DLS，馬爾文公司），LSM-880 型多光子共聚焦熒光顯微鏡（CLSM，Zeiss 公司）。

試劑：氯化鈣、BSA 均為國產分析純試劑；噻唑藍（MTT）、細胞核染色劑（Hoechst 33342）均為國產生化純試劑；脫氧核糖核酸酶（DNase Ⅰ）購自寶生物工程（大連）有限公司；Dulbecco 改良培養基（DMEM）和商用脂質體載體（Lipofectamine 2000）均來自賽默飛世爾科技公司；DNA 寡核苷酸和miRNA 購于上海生工生物工程公司，詳細序列見表1；實驗用水均為超純水。

表1 DNA 寡核苷酸和miRNA 序列Table 1 Sequences of DNA oligonucleotide and miRNA

1.2 合成方法

1.2.1 BSA/CaP 納米載體的合成

根據文獻方法[19]制備納米載體。將10 mg BSA加入到1 mL DMEM（含有0.9 mmol/L PO43-）培養基中，用封口膠密封，在37 ℃培養箱中靜置孵育24 h后，加入10 μL CaCl2（1 mol/L）溶液，繼續孵育24 h，13 300 r/min 離心15 min，用超純水清洗干凈，得到BSA/CaP 納米載體。將BSA/CaP 在超純水中分散，配制1 mg/mL 分散液，于-20 ℃保存備用。

1.2.2 MB@BSA/CaP 納米探針的合成

將10 mg BSA 加入到1 mL DMEM 培養基中，用封口膠密封，在37 ℃培養箱中靜置孵育24 h。將10 μL CaCl2（1 mol/L）分別與不同濃度的MB 分散液（100～400 nmol/L）混合，振蕩2 h，加入到上述體系中，繼續孵育24 h，13 300 r/min 離心15 min，用超純水清洗干凈，得到MB@BSA/CaP 納米探針。將MB@BSA/CaP 在超純水中分散，配制1 mg/mL 分散液，于-20 ℃保存備用。

另外，將商用脂質體載體Lipofectamine 2000（1 mg/mL, 2 μL）與MB 分散液（100 μmol/L,1 μL）混合，加 入100 μL 培 養 基，靜 置20 min，得 到Lipofectamine 2000/MB，用作細胞實驗的對照組。

1.3 檢測方法

測試MB 的選擇性。將100 nmol/L 的miRNA-10b、miRNA-27a、miRNA-21、miRNA-221、miRNAlet 7a、miRNA-155 與100 nmol/L 的MB 在pH 為7.40 的Tris-HCl 雜 交 緩 沖 溶 液（含1 mmol/L 的MgCl2和100 mmol/L 的KCl）中 共 孵 育40 min，用熒光光譜儀測試體系的熒光光譜，考察MB 的選擇性。 此MB 的熒光基團是FAM，猝滅基團是BHQ1。

使用僅修飾熒光團FAM 的MB-FAM 測試在BSA/CaP 納米載體中的負載量。將10 μL 1 mol/L CaCl2溶 液 分 別 與 不 同 濃 度（100、200、300、400 nmol/L）的MB-FAM 混合，振蕩2 h。樣品用超純水多次離心、洗滌，除去未負載的MB-FAM。根據MB-FAM 熒光標準曲線，計算負載量和包封率。

測試納米載體的保護性能。將不同MB 負載量的MB@BSA/CaP 納米探針在超純水中分散，使MB 的終濃度均為100 nmol/L。在MB 分散液和不同MB 負載量的MB@BSA/CaP 分散液中分別加入10 μL 的100 U/mL DNase Ⅰ，于搖床中37 ℃振蕩30 min，測試體系的熒光光譜。同時檢測相同條件下不加DNase Ⅰ的體系的熒光光譜。此實驗中使用的MB 熒光基團是FAM，猝滅基團是BHQ1。

1.4 細胞內檢測miRNA-155

人源乳腺癌細胞（MCF-7 細胞）和鼠源腦微血管內皮細胞（bEnd.3 細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司）的培養：將細胞置于含10%胎牛血清、1%抗生素（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）的DMEM 培養基中，于37 ℃、5% CO2的濕潤環境中培養。

為了檢測細胞內miRNA-155，首先將MCF-7細胞（或bEnd.3 細胞）接種于35 mm 玻璃底培養皿中，每皿的接種密度為1×105個細胞，于培養箱中37 ℃孵育24 h，移去培養基，再加入含有Lipofectamine 2000/MB 或MB@BSA/CaP 的新鮮培養基，MB 的終濃度為100 nmol/L，再次孵育6 h，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗3 次，加入細胞核染色劑Hoechst 33342（終濃度7.5 μg/mL）與細胞共培養10 min，標記細胞核，最后用共聚焦熒光顯微鏡進行細胞成像分析。此實驗中使用的MB 熒光基團是Cy5，猝滅基團是BHQ2。

2 結果與討論

2.1 BSA/CaP 納米載體的表征

本文制備了BSA/CaP 納米載體，并通過多種測試手段對其表征，如圖1 和圖2(a)～(d)所示。從CaP、BSA 和BSA/CaP 的FT-IR 圖（圖1）可以看出，BSA/CaP 的譜中同時觀察到BSA 的C=O 振動特征峰（1 643 cm-1）和CaP 的P—O 振動特征峰（1 036 cm-1），證明BSA/CaP 納米載體成功合成。從BSA/CaP 的TEM 圖（圖2(a)）可以看出，BSA/CaP 納米載體為中空球型結構，平均尺寸約60 nm；BSA/CaP 的DLS 圖（圖2(b)）顯示，BSA/CaP 的水合粒徑為118 nm，分散系數（PDI）為0.119，具有良好的分散性；BSA/CaP 的Zeta 電位圖（圖2(c)）顯示，BSA/CaP 表面帶負電荷，其表面電位與BSA 的電勢接近。將BSA/CaP 負載帶正電荷的熒光染料Cy7，分別加入到pH 5.00 和pH 7.40 的緩沖溶液中，考察了體系的熒光強度變化。如圖2(d)所示，在中性環境中（pH 7.40），體系熒光強度（激發波長λex=750 nm，發射波長λem=796 nm）較弱，說明有少量的Cy7 從載體中釋放；而當pH 值為5.00 時，體系熒光信號顯著增強，表明有大量Cy7 從載體中釋放。這是由于BSA/CaP 納米載體中的CaP 在酸性環境下水解生成了鈣離子和磷酸根離子[15]，使載體不穩定，導致大量Cy7 的釋放。 納米載體的酸響應性能有助于其在細胞溶酶體酸性環境（pH 5.00）中快速釋放負載的MB，并在鈣離子作用下促進MB 從溶酶體中逃逸，與細胞質中miRNA-155 反應，避免MB 在溶酶體中長時間滯留而被酶降解，從而提高探針檢測miRNA-155 的靈敏度。

圖1 CaP、BSA 和BSA/CaP 的FT-IR 圖Fig.1 FT-IR spectra of CaP, BSA and BSA/CaP

圖2 BSA/CaP 的TEM 圖（a）、DLS 圖（b）、Zeta 電位圖（c）；(d)不同pH 值條件下BSA/CaP 釋放Cy7 的熒光強度變化曲線Fig.2 TEM (a), DLS (b), Zeta potential(c)images of BSA/CaP;(d)the change curves of fluorescence intensity of Cy7 released from BSA/CaP at different pH conditions

2.2 MB@BSA/CaP 納米探針的表征

對MB@BSA/CaP 納米探針進行表征，結果如圖3(a)～(c)所示。在構建MB@BSA/CaP 納米探針之前，首先考察了MB 對miRNA-155 的選擇性。此MB 的熒光基團是FAM，猝滅基團是BHQ1。如圖3(a)所示，MB 與miRNA-155 共孵育40 min 后，體系的熒光強度（λex=490 nm，λem=523 nm）顯著增強，增強倍數（F/F0）為25，而與miRNA-10b、miRNA-27a、miRNA-21、miRNA-221 和miRNA-let 7a 等非目標miRNA 幾乎不發生反應，表明MB 對miRNA-155 表現出良好的響應能力和選擇性。

圖3 （a）MB 對miRNA155 的選擇性；（b）MB-FAM 熒光強度與濃度的線性關系；（c）BSA/CaP 對MB-FAM 的負載量和包封率Fig.3 (a)MB’s selectivity toward miRNA155;(b)linear relationship between MB-FAM fluorescence intensity and concentrations;(c)the loading capacity and encapsulation efficiency of MB-FAM in the BSA/CaP

將僅修飾熒光基團FAM 的MB-FAM 負載到BSA/CaP 納米載體中，考察體系熒光強度（λem=523 nm）的變化，并根據體系熒光強度隨濃度變化的標準曲線（圖3(b)），計算負載量和包封率，結果如圖3(c)所示。在BSA/CaP 納米載體中加入400 nmol/L MB-FAM 時，MB-FAM的負載量為331.24 nmol/L，包封率為82.81%，表明BSA/CaP納米載體可高效負載MB-FAM。

研究了不同MB 負載量對MB@BSA/CaP 納米探針的粒徑和形貌的影響。如圖4 所示，不同MB負載量的納米探針形貌相似，均為中空球型結構，且隨著加入MB 濃度的逐漸增加，納米探針的粒徑由（57.7±3.3）nm 增加至（78.1±4.0）nm。進一步通過DLS 測得MB@BSA/CaP 納米探針的水合粒徑也是隨著MB 負載量的增加而增大（表2），但其PDI 值始終在0.200 左右，表明納米探針具有良好的分散性。

圖4 不同MB 負載量的MB@BSA/CaP 的TEM 圖和相應的粒徑分布圖（插圖）Fig.4 TEM images and corresponding particle size distributions images (illustration)of MB@BSA/CaP loaded with different amounts of MB

表2 不同MB 負載量MB@BSA/CaP 納米探針的水合粒徑和PDITable 2 Hydrodynamic size and PDI of MB@BSA/CaP nanoprobes loaded with different amounts of MB

2.3 MB@BSA/CaP納米探針的抗DNase Ⅰ降解性能

研究了游離MB 和不同MB 負載量MB@BSA/CaP 納米探針抗DNase Ⅰ（1 U/mL）降解的性能，結果如圖5(a)所示。游離的MB 與DNase Ⅰ共孵育后熒光顯著增強，是由于游離MB 容易在DNase Ⅰ作用下被降解，熒光基團和猝滅基團之間距離增大，熒光共振能量轉移（FRET）作用消失，從而使熒光信號恢復。相比之下，不同MB 負載量MB@BSA/CaP納米探針與DNase Ⅰ共孵育，熒光強度發生了不同程度的增強。當MB 的加入量為100 nmol/L 或200 nmol/L 時，納米探針的熒光信號僅有微弱增強，表明納米載體可以有效阻止MB 被DNase Ⅰ降解。當MB 的加入量為300 nmol/L 或400 nmol/L 時，熒光信號增強明顯，證明MB 部分被DNase Ⅰ降解，納米載體的保護作用有所減弱。這是因為加入MB濃度過大時，MB 會吸附至納米載體外表面，導致納米載體的保護作用減弱。分別將游離的MB 和不同MB 負載量MB@BSA/CaP 納米探針與目標物miRNA-155（100 nmol/L）在雜交緩沖溶液中共孵育（如圖5(b)所示），可以發現，隨著MB 負載量增加，納米探針對miRNA-155 響應的熒光信號逐漸增強，也證明了納米載體對MB 的保護作用逐漸減弱。因此，為了提高納米探針在細胞內檢測miRNA的準確性，避免產生假陽性信號，MB 的加入量應低于200 nmol/L。

圖5 游離的MB 和不同MB 負載量MB@BSA/CaP 納米探針與DNase Ⅰ反應后的熒光強度（a）以及與目標物miRNA-155 反應后熒光強度變化曲線（b）Fig.5 Fluorescence intensity for free MB and MB@BSA/CaP nanoprobe loaded with different amount of MB reacted with DNase Ⅰ(a);plot for the fluorescence intensity of probes reacted with the target miRNA-155 and time (b)

2.4 MB@BSA/CaP 納米探針的細胞內熒光成像

將不同用量的MB@BSA/CaP 納米探針與MCF-7 細胞共孵育24 h 后，通過MTT（噻唑藍）法測定細胞存活率，考察了MB@BSA/CaP 納米探針的細胞毒性。納米探針的用量在10～400 μg/mL 范圍內，細胞存活率均大于90%，表明納米探針細胞毒性低，具有良好的生物安全性，適用于細胞成像。

研究了MB@BSA/CaP 納米探針對MCF-7 細胞內miRNA-155 的熒光成像。此實驗中使用的MB 熒光基團是Cy5，猝滅基團是BHQ2。將游離MB、MB@BSA/CaP 和Lipofectamine 2000/MB 分別加入到MCF-7 細胞中共孵育（MB 100 nmol/L），通過共聚焦熒光顯微鏡觀察成像效果，結果見圖6。如圖6(a)所示，MCF-7 細胞與游離MB 共孵育幾乎無明顯熒光，這是因為游離MB 很難穿透細胞膜而被細胞攝取，導致成像效果差。將商用脂質體載體Lipofectamine 2000 負 載 MB 制 備 探 針 Lipofectamine 2000/MB，加入到MCF-7 細胞中，觀察到較明顯的紅色熒光。而在MCF-7 細胞中加入MB@BSA/CaP 納米探針后觀察到強烈紅色熒光，是由于納米探針被MCF-7 細胞攝取后，在胞內溶酶體酸性環境下釋放MB 與miRNA-155 雜交，使MB 的發夾結構打開，熒光恢復。根據圖6(b)，MB@BSA/CaP 組的細胞平均紅色熒光強度是Lipofectamine 2000/MB 組細胞的5.07 倍。這也進一步證實MB@BSA/CaP 比Lipofectamine 2000 更容易被MCF-7 細胞攝取，能夠將更多的MB 遞送至細胞內與miRNA-155 反應，從而提高MB 檢測細胞內miRNA 的靈敏度。

圖6 （a）MCF-7 細胞與游離的MB（A）、Lipofectamine 2000/MB（B）和MB@BSA/CaP（C）共孵育后的CLSM 圖像；（b）A-C 對應的平均紅色熒光強度細胞核用Hoechst 33342 染色；成像條件：λex=643 nm，λem=650-754 nmFig.6 (a)CLSM images of MCF-7 cells incubated with free MB (A), Lipofectamine 2000/MB (B), and MB@BSA/CaP nanoprobe (C);(b)mean red fluorescence intensity in images A-C The cell nuclei were stained by Hoechst 33342;imaging condition：λex=643 nm, λem=650-754 nm

miRNA-155 可能與多種腫瘤的發生和發展有密切關系[21,22]。因此，進一步通過測定MB@BSA/CaP（MB 100 nmol/L）納米探針在腫瘤細胞（MCF-7）和正常細胞（bEnd.3）中的熒光強度，評估不同細胞內miRNA-155 的表達。如圖7 所示，與bEnd. 3細胞相比，MCF-7 細胞與MB@BSA/CaP 納米探針共孵育后的體系顯示出更強的熒光信號，其平均紅色熒光強度是bEnd.3 細胞體系的8.10 倍。這是由于腫瘤細胞中表達了更多的miRNA-155 所致。結果表明，該納米探針可對細胞內不同表達量的miRNA-155 進行可視化成像檢測。

圖7 （a）MB@BSA/CaP 納米探針分別與bEnd.3 細胞和MCF-7 細胞孵育后的CLSM 圖像；（b）(a)圖的平均紅色熒光強度細胞核用Hoechst 33342 染色；成像條件：λex=643 nm，λem=650-754 nmFig.7 (a)CLSM images of MB@BSA/CaP nanoprobe incubated with bEnd.3 cells and MCF-7 cells respectively;(b)mean red fluorescence intensity in image (a)The cell nuclei were stained by Hoechst 33342;imaging condition：λex=643 nm, λem=650-754 nm

3 結 語

本文利用生物礦化法構建了一種酸響應的生物礦化納米載體BSA/CaP，通過靜電相互作用高效負載MB，制備了MB@BSA/CaP 納米探針。該納米探針制備方法簡單、分散性良好，為中空球型結構，MB 負載量高（331.24 nmol/L），其粒徑隨著MB負載量的增加而增大，且細胞毒性低，可被腫瘤細胞高效攝取,并可用于胞內miRNA-155 可視化成像檢測。另外，該納米載體可保護MB 不被DNaseⅠ降解，從而減少假陽性信號的產生，提高了探針檢測的準確性。本工作為腫瘤標志物的檢測提供了一種新穎可靠的方法，有望在復雜的生理環境中識別腫瘤細胞。