比率型近紅外熒光探針檢測小鼠體內半胱氨酸

畢文強，段 釬，李 貞

湖北大學化學化工學院/有機化工新材料湖北省協同創新中心/有機功能分子合成與應用教育部重點實驗室，湖北武漢430062

0 引 言

半胱氨酸（cysteine, Cys）是20 種天然氨基酸中唯一含有還原性硫醇基團的氨基酸，在許多生理和病理過程中起著關鍵作用[1～4]。正常水平的Cys（30～200 μmol/L）能維持各種蛋白質和抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的合成[5]，同時也是人類新陳代謝中硫化物的來源[6，7]。然而，過量的Cys 與許多疾病息息相關，如類風濕性關節炎、帕金森病、阿爾茨海默癥等疾病[8，9]。同時，有報道稱缺乏Cys 會導致生長緩慢、水腫、肝臟損傷、皮膚病變等。Cys 被認為是早期診斷和治療以及疾病監測最重要的生物標志物之一，開發有效手段對生物體系中的Cys 進行分析檢測具有巨大的應用前景。

傳統的Cys 檢測方法包括高效液相色譜法、質譜法、毛細管電泳法和電化學方法等[10～17]。但這些方法具有成本高、時間長、預處理復雜等缺點，在生物體系中的應用受到限制。熒光探針因其高效、快速、成本低和靈敏度高等優點被應用于生物體系中Cys 的檢測[18，19]，一些基于萘酰亞胺、熒光素、咔唑、氨基喹啉或香豆素等熒光團的Cys 探針相繼出現[20～24]。但由于探針在體內分布不均以及生物體環境差異，導致其成像結果不夠準確。比率型熒光探針能夠有效消除上述因素所帶來的干擾，顯著提高成像結果的準確性[25]。目前可應用于特異性檢測Cys 的比率型熒光探針較少，亟需設計構建新型的Cys 比率型熒光探針。

基于此，我們設計并合成了一種可特異性檢測Cys 的比率型近紅外熒光探針Cy-B。該探針在近紅外光激發下，發射位于808 nm 的熒光信號；而當其與Cys 反應后，產物能夠在635 nm 處產生熒光信號，且隨著Cys 濃度增加，808 nm 處的熒光信號逐漸減弱，635 nm 處的熒光信號逐漸增強。利用熒光發射的雙通道信號，可構建比率型探針，實現體內Cys 的高準確度分析檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

試劑：3，3′-雙十八烷基氧碳花菁高氯酸鹽（DiOC18(3)）、N-甲基馬來酰亞胺（NMM）、N-乙基馬來酰亞胺（NEM）、二硫蘇糖醇（DTT）、丙烯酰氯、溴-十一酸等試劑購于上海阿拉丁試劑公司；其他化學試劑和溶劑均為分析純級，購自國藥集團化學試劑有限公司或阿拉丁試劑公司；實驗用水均為電阻率18.2 MΩ·cm 的超純水。

儀器：Avance Neo 400 型磁共振儀（Bruker 公司），6224 TOF 液質聯用儀（Agilent公司），RF-6000型熒光光譜儀（Shimadzu 公司），UH-4150 型紫外-可見近紅外吸收光譜儀（Hitachi公司），Multiskan FC 型酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）LSM-880 型多光子共聚焦熒光顯微鏡（Zeiss 公司），IVIS Lumina LT 型小動物活體成像儀（PerkinElmer公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 探針Cy-B 的合成方法

探針Cy-B 的合成路線如圖1 所示。

圖1 Cy-B 的合成路線Fig.1 Synthesis route of Cy-B

其中化合物1～4 參照文獻方法合成[25，26]。終產物Cy-B 的合成步驟如下：將化合物4（918 mg，1 mmol）和K2CO3（280 mg，2 mmol）溶 于20 mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室溫下攪拌30 min后，將丙烯酰氯（136 mg，1.5 mmol）溶于10 mL DMF 后緩慢加入上述體系，室溫攪拌6 h。反應完成后，首先將反應液用乙酸乙酯和水（80 mL，體積比20∶1）混合溶液萃取，有機相用無水Na2SO4干燥后減壓蒸餾得到粗產物。最后將粗產物采用硅膠柱層析法（淋洗劑為二氯甲烷/甲醇，體積比20∶1）分離提純，得到綠色固體產物Cy-B。產物的磁共振氫譜1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)化學位移δ：7.61(t,J=9.3 Hz, 4H),7.42(d,J=3.2 Hz,4H),7.33～7.18(m,2H), 6.85(d,J=17.1 Hz,1H), 6.72(dd,J=17.2,10.3 Hz,1H),6.45(d,J=10.2 Hz,1H),6.24(d,J=14.1 Hz,2H),4.18(t,J=6.1 Hz,4H),3.99(t,J=6.5 Hz,4H),2.67(s, 4H),2.26(t,J=7.3 Hz, 4H), 1.93～1.81(m, 2H), 1.71(t,J=6.3 Hz, 4H), 1.53(s, 12H), 1.42～1.26(m, 16H),1.23(m,20H),0.87(t,J=7.4 Hz,6H)；磁共振碳譜13C NMR(101 MHz，DMSO)δ：14.00，19.09，20.98，24.14，24.95，26.49，27.31，27.91，28.89，29.08，29.22，29.25，30.68，33.97，39.43，44.05，49.22，63.79，101.26，111.89，121.27，122.99，125.48，127.09，129.09，129.98，131.17，136.55，139.67，141.41，142.53，158.75，163.76，172.03，173.38。高分辨質譜（HRMS，m/z）：[M]+理論值為971.687 2，實測值為971.684 9。

1.2.2 緩沖溶液中Cys 的檢測

考察緩沖溶液中探針Cy-B 的響應性能。探針Cy-B 溶于二甲基亞砜（DMSO）制備成10 mmol/L儲備液。測試時，使用4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖溶液（EtOH/HEPES 體積比1∶4，pH 7.4）將探針儲備液稀釋至5 μmol/L，加入不同濃度（0～150 μmol/L）的Cys，反應30 min，測試體系在720 nm 光激發下808 nm 處的熒光發射光譜及520 nm 光激發下635 nm 處的熒光發射光譜。

考察探針Cy-B 對Cys 響應的特異性。在Cy-B（5 μmol/L）溶液中加入150 μmol/L 的活性氧或活性氮類（H2O2、HClO、·OH、HNO、NO2-、ONOO-）、活性硫類（NaHS、Na2SO4、Na2S2O3、H2Sn）、金屬離子（NaCl、Fe2+、KCl、Cu2+）以及生物分子（葡萄糖（Glucose）、牛血清白蛋白（BSA）、半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH））等干擾物，反應30 min，分別測試在720 nm 光激發下808 nm 處及520 nm 光激發下635 nm 處的熒光發射強度變化。

考察探針的pH 穩定性。配制不同pH 值的EtOH/HEPES 緩沖溶液，將Cy-B 稀釋至5 μmol/L，測定在不同pH 值緩沖溶液中Cy-B 的熒光強度。

1.2.3 細胞毒性

采用CCK-8 法[27]考察探針的細胞毒性。將HeLa 細胞（湖南豐暉生物公司）接種于96 孔板中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM為培養基，37 °C 培養24 h；加入含不同濃度Cy-B 探針（0、5、10、15、20、25、30 μmol/L）的新鮮培養基繼續培養24 h；每孔再加入10 μL CCK-8 溶液繼續培養4 h。采用酶標儀測定體系在450 nm 處的吸光度，計算細胞存活率：細胞存活率=（加入Cy-B 組的平均吸光度/對照組的平均吸光度）×100%。

1.2.4 細胞共定位成像

將HeLa 細胞接種于直徑35 mm 的玻璃底培養皿中，每皿中加入1 mL DMEM 培養基，細胞接種密度為1×105個，于37 ℃培養箱中生長24 h。移去培養基，加入細胞膜定位染料DiOC18(3)，隨后加入含Cy-B 的培養基，培養30 min，用10 mmol/L PBS（pH 7.4）清洗細胞3 次去除培養基多余的Cy-B，使用激光共聚焦熒光顯微鏡（CLSM）進行細胞成像。

1.2.5 細胞內Cys 成像

細胞外源性Cys 成像：參考文獻方法[28]，將HeLa 細胞接種于直徑35 mm 的玻璃底培養皿中，每皿加入1 mL DMEM 培養基，細胞接種密度為1×105個，于37 ℃培養箱中生長24 h。移去培養基，加入含不同濃度Cys（100、200 μmol/L）的新鮮培養基培養30 min，再加入含Cy-B 的培養基，確保每皿Cy-B 終濃度為5 μmol/L，繼續培養30 min，用PBS緩沖溶液清洗細胞3 次，使用CLSM 進行細胞成像。

細胞內源性Cys 成像：將HeLa 細胞接種于直徑為35 mm 的玻璃底培養皿中，每皿加入1 mL DMEM 培養基，細胞接種密度為1×105個，于37 ℃培養箱中培養24 h，移去培養基?？瞻捉M：加入含Cy-B（5 μmol/L）的培養基。實驗組1：先加入1 mmol/L NEM（巰基清除劑，用于消耗細胞內源Cys），再加入5 μmol/L Cy-B，培養30 min。實驗組2：先加入1 mmol/L NEM，再加入1 mmol/L DTT（用于誘導細胞產生內源性Cys）培養30 min，最后加入5 μmol/L Cy-B。上述處理組用PBS 緩沖溶液清洗3 次，再使用CLSM 進行細胞成像。

1.2.6 活體內Cys 成像

所有動物實驗均按照《實驗動物飼養管理和使用指南》進行,并經湖北大學動物倫理與福利委員會批準。

Balb/c 小鼠（雌性，(20±2）g）由湖北貝恩特生物科技有限公司提供。實驗組：將小鼠麻醉后脫毛，在小鼠的左側皮下注射Cys（20 μL，1 mmol/L）和Cy-B（20 μL，1 mmol/L），在其右側相同位置注射等量Cy-B。對照組：在小鼠的左側皮下注射NMM（巰基清除劑，清除Cys）、Cys 和Cy-B（劑量均為20 μL，1 mmol/L），右側相同位置注射等量的Cy-B。30 min 后，對兩只小鼠進行活體成像（I635nm通道激 發 波 長λex=545 nm，發 射 波 長λem=(635±10）nm；I808nm通道λex=600 nm，λem=(810±10）nm）。

2 結果與討論

2.1 探針Cy-B 的設計原理

以近紅外花菁染料為母體，基于丙烯酸酯與Cys 的特異性識別反應構建了比率型Cys 近紅外熒光探針Cy-B。該探針與Cys 反應后游離出羥基，進而觸發分子內重排反應，使熒光團母體從花菁結構轉變為酮菁結構Cy-O（圖2）。Cy-B 分子中的疏水鏈十一酸正丁酯可嵌入細胞膜的磷脂雙分子層內，使其具有細胞膜定位功能。隨著Cys 含量升高，歸屬于花菁染料808 nm 左右的熒光發射峰強度（I808nm）減弱，歸屬于酮菁染料的635 nm 左右熒光發射峰強度（I635nm）增強，同時二者間比值（I635nm/I808nm）增大，由此可實現對Cys 的檢測。

圖2 探針Cy-B 響應Cys 的設計原理Fig.2 Design principle of the Cys probe Cy-B

2.2 探針Cy-B 對Cys 的響應性能

考察了探針Cy-B 在緩沖溶液中對Cys 的響應性能。首先優化了反應的時間。由Cy-B 與150 μmol/L Cys 的反應動力學實驗可知，比率熒光信號（I635nm/I808nm）隨著反應時間的延長而逐漸增加，并在25 min 左右趨于穩定。因此，在后續實驗中將Cy-B 與Cys 的孵育時間確定為30 min，以保證反應完全。

在含5 μmol/L Cy-B 的EtOH/HEPES（體積比1∶4）緩沖溶液中加入不同濃度（0～150 μmol/L）的Cys，孵育30 min 后，檢測體系的熒光發射光譜。如圖3(a)～(c)所示，在0～150 μmol/L 范圍內，隨著Cys濃度的增加，Cy-B 在808 nm 處的熒光強度逐漸降低，同時，在635 nm 處的熒光強度逐漸增強；比率熒光信號（I635nm/I808nm）在該范圍內與Cys 濃度呈良好的線性關系（R2=0.993），檢出限為0.76 μmol/L。此外，由圖3(d) Cy-B 的紫外-可見吸收光譜可知，Cy-B 與Cys 反應后，位于780 nm 左右的吸收峰強度減弱，550 nm 左右的吸收峰強度變強，與對應的熒光光譜變化結果相符。計算得到反應前Cy-B 的量子產率為0.5%，Cy-B 與Cys 反應后所得Cy-O的量子產率為0.2%。

圖3 CyB 與不同濃度Cys 反應后在808 nm 左右（a）及635 nm 左右（b）的熒光光譜；（c）比率熒光信號與Cys 濃度的線性關系；（d）Cy-B 的紫外-可見吸收光譜Fig.3 Fluorescence spectra of Cy-B around 808 nm (a)and 635 nm (b)after reaction with different concentrations of Cys;(c)the linear relationship between ratio signal and Cys concentration;(d)UV-visible absorption spectra of Cy-B

為了實現在生物體系中的應用，探針需具備良好的特異性和穩定性。在相同的條件下測試其他干擾物對探針熒光信號的影響,以考察Cy-B 對Cys響應的特異性。如圖4 所示，濃度為150 μmol/L 的活性氧、活性氮、活性硫、金屬離子以及生物分子等物質對探針的比率熒光信號干擾較小，由此說明探針識別Cys 的特異性較強。將探針及其與Cys 響應后的產物在pH 4.0～8.0 的EtOH/HEPES（體積比1∶4）緩沖溶液內孵育時，Cy-B 與Cys 反應前后的比率熒光信號（I635nm/I808nm）均無明顯變化（圖5）。這說明探針具有良好的pH 穩定性。上述結果表明探針Cy-B 對Cys 具有良好的響應性能以及優異的選擇性和穩定性，適合應用于復雜生物環境中特異性檢測Cys。

圖4 探針Cy-B（5 μmol/L）對Cys（150 μmol/L）響應的特異性Fig.4 Selectivity of Cy-B (5 μmol/L)to Cys (150 μmol/L)against other disruptors

圖5 不同pH 值緩沖溶液條件下探針Cy-B 的熒光強度以及Cy-B 與Cys 反應后產物的熒光強度Fig.5 Fluorescence intensity of Cy-B and the product of Cy-B reacted with Cys in buffer solution with different pH value

2.3 細胞內Cys 檢測

在將Cy-B 應用于細胞成像之前，先采用CCK-8 法對其細胞毒性進行了考察。將HeLa 細胞與不同濃度的探針溶液孵育24 h 后，細胞的存活率沒有明顯變化，表明探針的細胞毒性較低，適用于細胞成像。

進一步考察了探針定位細胞膜的能力。圖6 為染料Cy-B 和DiOC18(3)對HeLa 細胞的共定位成像。由圖6 可知，Cy-B 的熒光分布與商品化細胞膜定位染料DiOC18(3)在活細胞中的熒光分布一致，Pearson 系數為0.94，表明Cy-B 可成功定位于細胞膜。

圖6 Cy-B 和DiOC18(3)對HeLa 細胞的共定位成像（a）Cy-B 的紅色通道（λex=600 nm，λem=700～760 nm）；（b）DiOC18（3）的藍色通道（λex=488 nm，λem=490～540 nm）；（c）（a），（b）的疊加圖像；（d）兩個通道強度的散點圖；（e）紅色通道和藍色通道中細胞的ROI 強度分布圖。比例尺為20 μmFig.6 Co-localization imaging of HeLa cells incubated with Cy-B and DiOC18(3)(a)The red channel of Cy-B (λex=600 nm, λem=700-760 nm);(b)the blue channel of DiOC18(3)(λex=488 nm, λem=490-540 nm);(c)the merged image of (a)and (b);(d)fluorescence intensity scatter plots of the two channels;(e)ROI intensity distribution of both red channel and blue channel in cells.Scale bar:20 μm

接下來，考察了Cy-B 在細胞內對外源性Cys 的響應能力。如圖7 所示，隨著外加Cys 濃度的增加，細胞內紅色通道熒光信號（λex=600 nm，λem=700～760 nm）逐漸減弱。該結果與溶液中結果一致（見圖8）。而此時，綠色通道熒光信號（λex=543 nm，λem=610～680 nm）逐漸增強，比率熒光信號（Igreen/Ired）隨著加入Cys濃度的增加而逐漸增強。上述結果說明，探針Cy-B 可以檢測細胞外源性Cys 的濃度變化。

圖7 （a）HeLa 細胞內外源性Cys 的共聚焦熒光成像紅色通道（λex=600 nm，λem=700～760 nm）、綠色通道（λex=543 nm，λem=610～680 nm）;（b）（a）圖中綠色和紅色兩個通道的熒光信號平均強度的比值Igreen/IredFig.7 (a)Confocal fluorescence imaging of exogenous Cys in HeLa cells;red channel(λex=600 nm，λem=700-760 nm), green channel(λex=543 nm, λem=610-680 nm);(b)the ratio signal Igreen/Ired of the average fluorescence intensities for the green and red channels in the figure (a)

圖8 CyB 與不同濃度Cys 反應后，在700～760 nm 范圍內的熒光光譜（λex=600 nm）Fig.8 Fluorescence spectra of Cy-B in the range of 700-760 nm after reaction with different concentrations of Cys (λex=600 nm)

最后，利用Cy-B 對細胞內源性產生的Cys 進行檢測。從圖9 HeLa 細胞內源性Cys CLSM 成像結果可以看出，加入NEM 的細胞相較于空白組幾乎觀察不到綠色通道熒光信號（Igreen），說明細胞內的Cys 被NEM 消耗完全。而當進一步加入DTT 后，Igreen信號和比率信號Igreen/Ired信號均增加，這證實了Cy-B 可成功檢測細胞內源性Cys。

圖9 （a）HeLa 細胞內源性Cys 共聚焦成像;（b）（a）圖中兩個通道比率熒光信號Igreen/Ired強度Fig.9 (a)Confocal imaging of endogenous Cys in HeLa cells;(b)the ratio signal Igreen/Ired for the two channels in (a)

2.4 活體內檢測Cys

在活細胞中成功實現了對Cys 的檢測之后，將探針Cy-B 應用于活體內Cys 檢測。如圖10(a)所示，當小鼠在右側皮下注射Cy-B 時，可觀察到較強的808 nm 通道熒光和較弱的635 nm 通道熒光，說明小鼠體內含低濃度Cys；當向該小鼠左側相同位置注射Cys 后，635 nm 通道熒光顯著增強，808 nm通道熒光顯著減弱，同時比率熒光信號（I635nm/I808nm）升高了1.73 倍。為證實該信號變化源自Cy-B 與Cys 的特異性反應，我們設計了一個對照組。在小鼠注射Cys 前，在同一部位皮下注射NMM，觀察到較強的808 nm 通道熒光和較弱的635 nm 通道熒光，且比率熒光信號（I635nm/I808nm）與僅注射Cy-B 時相當（圖10(b)）。值得注意的是，兩組小鼠僅注射Cy-B 時比率熒光信號值相近，說明比率探針能夠有效克服由于探針分布不均、生理環境不同所帶來的干擾，提供更為準確的檢測結果。

圖10 Cy-B 檢測小鼠體內Cys 的比率熒光信號（a）實驗組；（b）對照組Fig.10 The ratiometric fluorescence signals of Cys detected by Cy-B in living mice(a)experimental group;(b)control group

3 結 語

本工作利用近紅外花菁染料為母體，修飾可特異性識別Cys 的丙烯酸酯及細胞膜定位基團，構建了檢測Cys 的比率型熒光探針Cy-B。該探針在808 nm 處有較強的熒光信號，當與Cys 反應后，808 nm 處熒光強度逐漸減弱，同時在635 nm 處產生熒光信號且隨Cys 濃度增加逐漸增強。兩個通道熒光信號的比值與Cys 濃度線性相關，從而可實現對Cys 的比率型檢測。該探針不僅可以成功定位于細胞膜并檢測細胞內外源性及內源性Cys 的濃度變化，而且能夠克服活體內由于探針分布及生物環境等因素對成像結果造成的干擾，實現對體內Cys 的檢測。本文的工作為研究Cys 在生物體系中的作用機制提供了一種可靠的方法。