菜籽多肽結構鑒定及其包封β-胡蘿卜素的機制

羅發莉，藍妙傳，付余，馬良,2，戴宏杰，馮鑫，張宇昊,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學 前沿交叉學科研究院，生物學研究中心，重慶，400715)

β-胡蘿卜素是最重要的類胡蘿卜素之一，具有抗氧化、抗腫瘤和增強免疫力等生物活性。然而，由于β-胡蘿卜素水溶性差、生物利用率較低以及對氧氣、光和溫度極其敏感而發生降解等缺點，在食品、醫藥和化妝品等領域的應用受到了限制[1]。近年研究表明，食品蛋白質來源的多肽具有兩親性、生物相容性、生物降解性、生物活性和環境友好性等優勢，現已經被廣泛應用于對生物活性物質的包封[2]。JIAO等[3]以玉米醇溶蛋白肽作載體對水溶性差、不穩定和生物利用度低的葉黃素進行包封，結果表明多肽可有效提高葉黃素的溶解度、穩定性和生物利用度。DU等[4]通過酶促水解α-乳清蛋白制備了α-乳清蛋白膠束，將其用于β-胡蘿卜素的自組裝包封，結果表明與游離的β-胡蘿卜素相比，經α-乳清蛋白膠束包封的β-胡蘿卜素在60 ℃加熱或紫外光照射下的水溶性和穩定性顯著提高。JIAO等[5]研究發現，聚-L-賴氨酸修飾的納米脂質體可用于葉黃素的新型遞送系統，與未被聚-L-賴氨酸修飾的納米脂質體遞送葉黃素相比，聚-L-賴氨酸可以保護納米脂質體中的葉黃素不被降解，并促進胃腸液條件下納米脂質體中葉黃素的釋放進而提高其生物利用度。綜上，多肽可作為疏水性生物活性物質的載體，具有提高其穩定性、水溶性和生物利用度的潛力。然而，當前研究側重于多肽包封生物活性物質的理化性質[粒徑、多分散指數、zeta電位、包封率(encapsulation efficiency，EE)、負載量(loading amount，LA)和體外穩定等]，并沒有從分子水平上闡明兩者的相互作用機制。因此，研究多肽包封生物活性物質的相互作用機制具有十分重要的意義。

本課題組先前發現以菜籽粕為原料，經酶解得到的菜籽多肽(rapeseed peptides，RPs)可自組裝包封疏水性生物活性物質β-胡蘿卜素，以不同水解時間、包封時間以及β-胡蘿卜素與菜籽多肽質量比為自組裝包封β-胡蘿卜素的影響因素進行條件優化后，測得包封率為80.03%，負載量為0.48 mg/mg[6]。此外，菜籽多肽經超濾(1～3 kDa)和乙腈先后處理，將其用于β-胡蘿卜素的包封，包封率顯著提高到95.79%，負載量提高到0.57 mg/mg。由此說明，菜籽多肽的分子質量和極性差異會影響與β-胡蘿卜素相互作用的位點進而導致包封出現差異[7]。因此，為進一步探究菜籽多肽與β-胡蘿卜素的相互作用機制，本研究以經超濾(1～3 kDa)和乙腈先后處理的菜籽多肽為研究對象，首先利用液質聯用對菜籽多肽的氨基酸序列進行鑒定，然后，以多肽的分子質量、親疏水性和氨基酸組成等影響包封效果的因素為依據，篩選多肽進行分子對接研究。最后，基于分子對接結果和親疏水氨基酸組成，從中篩選多肽固相合成后驗證包封實驗。本研究為闡明菜籽多肽包封β-胡蘿卜素相互作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽粕(蛋白質含量41.20%)，西南大學農學與生物科技學院；β-胡蘿卜素(純度98%)，北京索萊寶生物科技有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L，諾維信公司；多肽，生工生物工程(上海)股份有限公司；乙腈、甲酸(均為色譜純)，成都科隆化學品有限公司；氫氧化鈉、正己烷，成都科隆化學品有限公司試劑廠；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Easy-nLC 1200液相色譜儀、Orbitrap Fusion Lumos質譜儀和Heraeus Multifuge X3R，美國賽默飛世爾科技公司；BNGM2097有機膜分離實驗機，濟南博納生物技術有限公司；JA3003B電子天平，上海精天電子儀器有限公司；CJ-78-1磁力攪拌器，上海將任實驗設備有限公司；HH-4數顯恒溫攪拌水浴鍋，上海新諾儀器設備有限公司；PE20實驗室pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菜籽多肽的制備

將菜籽粕粉均勻分散在純水中，料液比為1∶25(g∶mL)，酶底物比為1∶100(mL∶g)，并在堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L的最適條件(溫度55 ℃、pH 8.5)下水解60 min以制備菜籽多肽，使用0.5 mol/L的NaOH溶液維持pH 8.5恒定。水解結束后，立即置于沸水中15 min滅酶。待冷卻至室溫后離心(5 000 r/min，10 min)，取上清液分別通過1 kDa和3 kDa分子質量超濾膜制備分子質量為1～3 kDa的多肽溶液，再通過180 Da納濾膜除鹽以避免多肽液中可能存有的少量鹽類對色譜柱造成損害。然后在磁力攪拌下加入乙腈溶液(肽溶液與乙腈溶液體積比為1∶3)，并在 4 ℃的冰箱中放置使其充分混合后離心(10 000 r/min，10 min)，取上清液旋轉蒸發去除乙腈，收集多肽溶液冷凍干燥后備用。

1.3.2 菜籽多肽的質譜測序與多肽的篩選

菜籽多肽的氨基酸序列通過液質聯用鑒定。

液相色譜條件參考FENG等[8]的方法并作適當的修改。色譜儀：Easy-nLC 1200系統；色譜柱：C18(3 μm，100 ?，75 μm×15 cm)，流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為含甲酸0.1%(體積分數)的乙腈水溶液(體積分數80%)。所應用的色譜梯度為：0～4 min(95%A，5%B)；4～40 min(90%A，10%B)；40～47 min(72%A，28%B)；47～48 min(62%A，38%B)；48～60 min(0%A，100%B)。進樣量：5 μL，流速：0.3 mL/min，柱溫：30 ℃。

質譜條件參考ZHANG等[9]的方法并作適當的修改。具體參數如下：噴霧電壓2.0 kV，毛細管溫度320 ℃，分辨率設置為1級120 000(m/z200)，2級30 000(m/z200)，離子掃描范圍m/z350～1 550，MS1自動增益控制(AGC)4e5，離子注入時間50 ms，MS2自動增益控制(AGC)1e5，離子注入時間50 ms，離子篩選窗口1.6m/z，動態排除時間為60 s(質量范圍±1 Da)。

對于所獲得的液質聯用數據使用PEAKS Studio X plus進行處理分析，利用菜籽蛋白數據庫Brassicanapus(Rape)匹配結果以鑒定肽序列[10]。進一步根據液質聯用所獲得的菜籽多肽鑒定結果，結合不同多肽序列的分子質量大小、親疏水氨基酸組成、含量來源等影響多肽自組裝包封的因素。同時參考ProtParam數據庫(https://web.expasy.org/protparam/)計算多肽的親水性總平均值(grand average of hydropathicity，GRAVY)，負值越大表示親水性越好，正值越大表示疏水性越強，接近0的時候表明其兩親性較好[11]，從中篩選具有良好包封潛力的多肽進行分子對接。

1.3.3 分子對接

小分子物質的準備：從Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取能量最低、最穩定的β-胡蘿卜素結構，下載文件格式為.Mol2，以保證后續分子對接實驗順利進行。

靶標多肽結構的準備：首先利用在線網站(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)對多肽結構進行預測，并遵循能量最低最穩定的原則選擇多肽結構。再利用SYBYL-X 2.1.1軟件中Surflex-Dock(SFIC)標準模式對多肽進行結構處理，把原配體分子從受體的口袋中分離，除去水分子和其他小分子，并對其末端進行修復，對多肽加氫原子、加電荷，以配體為中心5?的距離內設定對接口袋，由此生成靶標多肽的對接文件[12]。

分子對接：根據分子對接的步驟設定相關參數，采用一致性打分函數Concensus Score(C-Score)和總得分函數Total-Score(T-Score)相結合的方式來對分子對接結果進行評價[13]。C-Score通過構象預測函數、結合自由能函數、共同評價函數等多個方面一起綜合得到的評價對接結果可靠性進行打分的函數，主要根據D-SCORE、PMF-SCORE、G-SCORE、CHEM-SCORE這4個值的計算得到?？偟梅趾瘮礣-Score是SYBYL-X 2.1.1 軟件自帶的打分函數，主要由Crash(碰撞打分，越趨近于0越好)和Polar(極性打分，分值越小越好)組成?；谝陨显u判標準篩選出最佳結合構象，對獲得的最佳結合構象初步探討肽段與β-胡蘿卜素相互作用情況；進一步利用LigPlus軟件對最佳結合構象的相互作用力可視化，研究分析菜籽多肽與β-胡蘿卜素相互作用機制。根據分子對接結果和親疏水氨基酸組成選取多肽固相合成用于包封實驗驗證。

1.3.4 包封率及負載量的測定

參考LIU等[14]的方法稍作修改，對包封率和負載量進行測定。將合成多肽配制成5 mg/mL的溶液，調節pH為7，以多肽與β-胡蘿卜素質量比為3∶5加入β-胡蘿卜素粉末并在25 ℃下連續攪拌3 h后即得到包封溶液。將包封后的多肽溶液每次加入10 mL的正己烷，渦旋振蕩3 min，重復數次直至正己烷層變為無色使游離的未被包封的β-胡蘿卜素分離出來，進一步測定正己烷中未被包封的β-胡蘿卜素的含量(β-胡蘿卜素的標準曲線為y=0.843 5x-0.000 2，R2=0.998 7)。包封率和負載量計算如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：β-c(free)為游離β-胡蘿卜素的含量，mg；β-c(total)為添加的β-胡蘿卜素的總含量，mg；m(RPs)為添加的菜籽多肽的質量，mg。

1.4 數據統計分析

每個實驗重復3次，結果用平均值±標準差表示，使用SPSS Statistics 21.0對數據進行分析，并使用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 質譜測序及篩選結果的分析

2.1.1 質譜測序

菜籽多肽液的質譜測序總離子色譜圖如圖1所示。從菜籽多肽液中共鑒定出2 086條多肽序列。將得到的多肽測序結果與Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)中菜籽蛋白的序列進行BLAST同源性比對，發現水解液中多肽大多來源于P33525、P33522、P24565等幾種油菜籽中主要的儲藏蛋白Cruciferin和Napin，也有部分多肽來源于菜籽蛋白中的P29111、C3S7F1等油料蛋白Oleosins[15]。

圖1 菜籽蛋白肽的總離子色譜圖Fig.1 Total ionic chromatogram on rapeseed peptides

2.1.2 多肽的篩選

多肽的分子質量大小、親疏水性氨基酸分布和含量豐度等因素會影響包封效果[16-17]。本課題組先前研究證明，與小于1 kDa以及3～5 kDa的多肽組分相比，1～3 kDa的多肽具有最優的包封效果。此外，HAN等[18]研究表明，親疏水氨基酸規律性交替分布或者各分布在多肽鏈的1端的多肽可能更有利于多肽的自組裝，進而可提高其包封效果。此外，參考GRAVY值選擇接近于0的兩親性多肽[19]。再者，從多肽含量和原料來源的獨特性考慮，選擇酶解液中含量豐富且來源為菜籽蛋白中最主要蛋白的多肽。因此，篩選得到了5條多肽(GFRDMHQKVE、NSYDLPILRVL、GTCPFIAIPF、KGQQGQSQGQQ、NTGDQPLVII，表1)用于后續分子對接。由表1可知，這5條多肽均來源于最主要的菜籽蛋白且含量豐富，分子質量均為1 000～1 300 Da，并且這5條多肽按照親疏水性氨基酸規律性交替(RPs-1)和親疏水性氨基酸各在多肽鏈的一端(RPs-2～RPs-5)的特征分布。同時，這5條多肽的GRAVY值均接近于0，可能具有良好的兩親性有利于多肽自組裝包封，值得進一步通過分子對接實驗進行研究。

表1 所篩選菜籽多肽的基本信息Table 1 Basic information on the rapeseed peptides

2.2 分子對接結果分析

5條菜籽多肽的3D結構圖如圖2所示。不同多肽展現出不同構象，彎曲折疊形成了一定的空間結構。5條菜籽多肽分別與β-胡蘿卜素的分子對接模型如圖3所示。藍色的整片區域是多肽的“對接口袋”，線形形狀的小分子物質即為β-胡蘿卜素。由圖3可知，沒有出現β-胡蘿卜素分子遠離多肽的現象，說明多肽能夠與β-胡蘿卜素形成穩定的包封復合物。β-胡蘿卜素端鏈上的2,6,6-三甲基環己烯基與多肽的“對接口袋”可能產生了相互作用，但具體相互作用力后續將利用LigPlus軟件進一步分析。分子對接結果的打分評價結果如表2所示。從T-Score數據來看，上述幾種多肽的T-Score值都較低，說明菜籽多肽與β-胡蘿卜素的相互作用效果不太理想，但還需結合一致性打分函數C-Score的結果來進一步判斷。C-Score是應用最為廣泛的評價指標，所篩選的5種多肽的C-Score≥4，表示對接成功，說明對接結果與實驗的相似度較高，具有可靠性[20]。

表2 分子對接結果的打分結果Table 2 Scoring results of molecular docking

A-RPs-1；B-RPs-2；C-RPs-3；D-RPs-4；E-RPs-5圖2 所篩選菜籽多肽的3D結構圖Fig.2 Three dimensional structure diagram on the selected rapeseed peptides

A-RPs-1；B-RPs-2；C-RPs-3；D-RPs-4；E-RPs-5圖3 所篩選菜籽多肽與β-胡蘿卜素的分子對接模型Fig.3 The molecular docking model on the selected rapeseed peptides and β-carotene

5條多肽與β-胡蘿卜素2D相互作用力可視化結果如圖4所示。圖中“睫毛狀”標識表示所發生疏水相互作用的氨基酸，標識的數目也反映了疏水相互作用力的強弱。由圖4可知菜籽多肽與β-胡蘿卜素的非共價相互作用力主要為疏水相互作用，且參與疏水相互作用的氨基酸大多在多肽“C端”。這與ALLAHDAD等[21-22]利用分子對接揭示β-胡蘿卜素分別與酪蛋白和乳清蛋白主要通過疏水相互作用結合的結論類似。本課題組前期借助傅里葉變換紅外光譜的研究表明菜籽多肽與β-胡蘿卜素在包封過程中沒有氫鍵的形成，因此更可能是疏水相互作用的結果[6]。根據疏水相互作用標識的數目可知，RPs-1的2個氨基酸(谷氨酰胺和纈氨酸)分別與β-胡蘿卜素的2,6,6-三甲基環己烯基發生疏水相互作用，而RPs-2～RPs-5均只有1個氨基酸與β-胡蘿卜素產生疏水相互作用。與RPs-2～RPs-5相比，RPs-1與β-胡蘿卜素產生的疏水相互作用更強，可能具有更優的包封效果。此外，通過進一步歸納多肽與β-胡蘿卜素相互作用的氨基酸種類可知，纈氨酸和谷氨酰胺與β-胡蘿卜素的2,6,6-三甲基環己烯基產生的疏水相互作用可能在包封中發揮了重要的作用。因此，基于分子對接結果和親疏水氨基酸的組成，通過化學合成RPs-1和RPs-5，用于驗證包封實驗。

A-RPs-1；B-RPs-2；C-RPs-3；D-RPs-4；E-RPs-5圖4 2D相互作用可視化結果圖Fig.4 The image of 2D interaction visualization results

2.3 相互作用包封的結果分析

合成多肽RPs-1和RPs-5的包封率和負載量如圖5所示。RPs-1和RPs-5的包封率和負載量分別達到93.17%和0.56 mg/mg，95.70%和0.57 mg/mg。與利用食源性蛋白對類胡蘿卜素包封的類似研究對比，乳清分離蛋白對番茄紅素進行包封制備納米顆粒的包封率僅為64.7%[23]。以玉米醇溶蛋白作載體，對葉黃素進行包封制備納米顆粒，測得包封率為85.18%[24]。綜上，合成的2條菜籽多肽對β-胡蘿卜素的包封均表現出良好的效果，并且RPs-5較RPs-1具有更優的包封效果。這與分子對接結果略有差異，可能的原因是分子對接時所使用的是多肽與小分子物質(β-胡蘿卜素)是一對一的相互作用，但在實際體系中往往是多個菜籽多肽分子與多個β-胡蘿卜素分子之間的相互作用[25]。

圖5 RPs-1和RPs-5的包封率和負載量Fig.5 The encapsulation efficiency and loading amount on RPs-1 and RPs-5

3 結論

菜籽蛋白水解液中的多肽大部分來源于菜籽蛋白的儲藏蛋白Cruciferin和Napin，少部分來源于油料蛋白Oleosins。菜籽多肽與β-胡蘿卜素的相互作用力主要是疏水相互作用。此外，菜籽多肽中參與疏水相互作用的氨基酸主要為谷氨酰胺、纈氨酸、脯氨酸和異亮氨酸，并且大多在多肽鏈的“C端”。進一步篩選合成的2條多肽鏈(GFRDMHQKVE、NTGDQPLVII)均具有良好的包封效果。因此，本研究可為菜籽多肽包封β-胡蘿卜素等疏水性生物活性物質提供一定的理論參考。