蒸餾米酒蒸餾殘液中多糖的分離及其益生活性研究

孫武，徐靜靜，尹忠偉，朱莉，詹曉北*

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(A&F生物技術有限公司,加拿大 本拿比，V5A3P6)

中國傳統米酒是一種以糯米為原料，經半固態發酵而成的商品酒精飲料，其營養豐富，歷史悠久，一般可以分為釀造米酒和蒸餾米酒[1-2]，其中蒸餾米酒是在釀造米酒的基礎上經蒸餾工藝而得到的酒精含量較高的米白酒，如桂林三花米香型白酒等[3]。已有研究表明，米酒對人體健康有多種益處，包括抗氧化、提高免疫等。如鄧志輝[4]研究發現蔣巷米酒抗氧化性較好，還具有一定的抗疲勞能力。

近年來，關于米酒功能因子的研究多有報道。米酒發酵過程中，在酒曲中微生物以及各種酶的共同作用下，蛋白質、多糖類和脂肪等物質被降解成單糖、低聚糖和氨基酸等[5]。其中米酒中的多糖有兩個來源：在發酵過程中，糯米中的淀粉被微生物降解，轉化為低聚糖和多糖；除了原料外，也可由微生物產生，例如在酵母生長和裂解過程中，細胞壁中的β-葡聚糖被釋放到米酒中，其中β-葡聚糖具有降血糖和抗氧化作用[6]。CHO等[7]表明韓國傳統米酒中的多糖能增加正常小鼠免疫力，促進免疫抑制模型小鼠的免疫細胞增殖。因此米酒中的多糖可能具有多種生物活性功能。其中部分多糖類化合物由于可以調節腸道酸堿度、腸道微生物組成和豐度以及促進短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)等有益代謝物的形成[8-9]，有益于宿主的健康，越來越多的應用于益生元的研究。

蒸餾米酒在蒸餾過程中會產生大量的蒸餾殘液，而蒸餾工藝中酒精會與多糖類物質分離，導致大量多糖類物質溶解在殘液中。不僅會提高生產成本，同時也會對環境造成大量污染。因此本文旨在研究蒸餾米酒的蒸餾殘液中功能糖的提取及其益生功能，既可以獲得酒精度較高的蒸餾米酒，又可以將蒸餾殘液再利用，極大地降低了蒸餾米酒的生產成本和對環境的污染。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

糯米，五常市興旺米業有限公司；米酒曲，安琪酵母股份有限公司；3 500 Da透析袋，無錫恒康醫療科技有限公司；其他試劑均為分析純。

實驗菌種：短雙歧桿菌(FWX346)、動物雙歧桿菌(ZJTZ1M2)、鼠李糖乳桿菌(FFJLY7L1)、干酪乳桿菌(FJSSZ4L6)，均從健康人群糞便中分離，保藏單位為江南大學(中國無錫)食品微生物菌種保藏中心，保藏地址為江蘇省無錫市蠡湖大道1800號。

MRS培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，乙酸鈉2，檸檬酸氫二氨2，硫酸鎂0.58，硫酸錳0.25，碳源5，L-半胱氨酸0.5。

1.2 儀器與設備

K15型冷凍高速離心機，美國Sigma公司；LC-1200型高效液相色譜、7890A氣相色譜儀，美國Agilent公司；ICS5000離子色譜儀，美國戴安公司；MuLtimode 8原子力顯微鏡，德國布魯克公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蒸餾殘液中多糖的分離純化

取500 mL蒸餾米酒的蒸餾殘液，50 ℃減壓濃縮至原體積的1/3，添加95%乙醇至乙醇終體積分數為30%，4 ℃醇沉12 h，取上清液(6 000 r/min，離心15 min)添加95%乙醇至乙醇體積分數為80%，攪拌充分后，4 ℃繼續醇沉12 h，收集沉淀(6 000 r/min，離心15 min)，添加30%乙醇復溶后，4 ℃靜置12 h，收集上清液(6 000 r/min，離心15 min)，減壓濃縮、冷凍干燥得到粗多糖，取一定量的粗多糖溶解后，采用Sevag試劑[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]除蛋白，添加樣液1/5的Sevag試劑，放入搖床充分振蕩后取上清液，重復操作直至中間無蛋白層出現，收集上清液減壓濃縮除去樣品中的有機試劑，使用截留分子質量3 500 Da的透析袋在超純水中透析72 h后，減壓濃縮凍干得到多糖樣品并命名為CRWPs。

1.3.2 蒸餾殘液中多糖的總糖和蛋白質的測量

總糖含量利用硫酸苯酚法測定，蛋白質的測定利用紫外全光譜掃描。

1.3.3 蒸餾殘液中多糖的單糖組成的測定

采用ICS-5000離子色譜儀測定多糖的單糖組成，具體方法參照劉衛寶等[10]的研究報道，并略作修改。取5 mg 多糖樣品加入300 μL三氟乙酸(2 mol/L)溶液，混勻后于100 ℃下水解6 h；冷卻至室溫后用氮氣吹干，接著加入300 μL甲醇再次吹干，重復以上操作4～5次，以完全除去三氟乙酸。再加入25 mL超純水溶解，稀釋10倍后上樣測定。色譜條件如下：CarboPac PA20陰離子交換柱，包括250 mm×4 mm分析柱、50 mm×4 mm保護柱；色譜柱溫度為30 ℃；流動相由A(超純水)、B(0.25 mol/L NaOH)和C(1 mol/L NaAc)組成，其中流動相B的比例分別為體積分數2.6%(0～30.0 min)、2.6%～80.0%(30.0～50.0 min)；其中流動相C的比例分別為體積分數5.0%～80.0%(21.1～30.0 min)；流量為0.5 mL/min；進樣體積為20 μL。

1.3.4 蒸餾殘液中多糖的分子質量的測定

利用高效凝膠過濾色譜法(high performance gel filtration chromatography，HPGFC)[11]，以Superose 12(1.0 cm×30 cm)為色譜柱，進一步分析多糖的平均分子質量。由葡聚糖標準品得到標準曲線方程(y=-0.098 76x+6.782 9,R2=0.995)，將多糖溶于超純水(5 mg/mL)，過0.22 μm濾膜，色譜條件如下：流動相：0.01 mol/L NaOH；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.5 流變特性測定

稱取不同質量的多糖樣品溶于超純水得到不同質量濃度(5、10、20 mg/mL)的多糖溶液，待其充分溶解后，采用TA DHR-1型流變儀測量多糖溶液的流變特性。選取錐板C60夾具進行測量，在25 ℃、剪切速率0.1～1 000 s-1條件下進行掃描，并記錄相應的表觀黏度。

1.3.6 原子力顯微鏡分析

將多糖用超純水配制成10 μg/mL的溶液，渦旋使其完全溶解。取5 μL滴至硅片上，室溫條件下，置于干燥皿中過夜干燥。待完全干燥后，采用MuLtimode 8型原子力顯微鏡進行觀察，掃描條件為：空氣中非接觸模式，氮探針；曲率半徑10 nm；氮化硅懸臂，彈性系數2.80 N/m，掃描頻率1.001 Hz。

1.3.7 發酵益生菌研究

選擇短雙歧桿菌(FWX346)、動物雙歧桿菌(ZJTZ1M2)、鼠李糖乳桿菌(FFJLY7L1)、干酪乳桿菌(FJSSZ4L6)4株菌作為目標菌種進行培養，進行益生活性評價，以MRS培養基為基礎培養基，并稍作修改，添加0.5 g/LL-半胱氨酸。以無碳源的MRS作為空白對照，以菊粉(5 g/L)為碳源作為益生參照物，以蒸餾殘液中提取的多糖(5 g/L)為碳源作為實驗組。首先制備益生菌種子液，取5 mL種子液加入30 mL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)中制成菌懸液，將菌懸液接種于厭氧管中，于37 ℃下厭氧培養48 h，分別在0、24、48 h取樣，測定OD600值、pH、SCFAs和乳酸的變化。

1.3.8 SCFAs含量的測定

采用氣相色譜法對發酵樣品進行SCFAs含量分析[12]。發酵液5 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液依次加入20 μL二乙基丁酸、500 μL鹽酸、2 mL乙醚渦旋3～5 min，靜置至液面分層，分離有機相，加入無水硫酸鈉渦旋30 s，靜置2 min取上清液過0.22 μm有機相膜，樣品(0.5 μL)注入Agilent 7890A GC系統，采用HP-INOWAX色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm,Agilent,USA)和火焰離子化檢測器(flame ionization detector，FID)。色譜條件：流速為1.5 mL/min，分流比為1∶20，加熱過程為60～190 ℃，4 min，進樣口溫度為220 ℃，FID溫度為250 ℃。

1.4 數據分析

所有實驗均重復3次，結果表示為平均值±標準偏差。采用SPSS軟件進行Duncan檢驗，進行統計分析，P<0.05時表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 多糖和蛋白質含量測定

從蒸餾米酒蒸餾殘液中分離得到的粗多糖得率為4.23 g/L，通過硫酸苯酚法(y= 9.741 4x-0.003 2,R2=0.999)測得雜多糖(CRWPs)中的總糖含量為(84.30±0.23)%，CRWPs的紫外全光譜掃描結果如圖1所示，在260 nm和280 nm處均無明顯吸收峰，結果表明CRWPs溶液不含有核酸和蛋白質。

圖1 波長為190～400 nm的紫外全光譜掃描曲線Fig.1 Ultraviolet full spectrum scan in the wavelength range of 190-400 nm

2.2 多糖分子質量測定

HPGFC在多糖分子質量測定上應用廣泛，具有高效、準確等特點，本研究通過HPGFC測定CRWPs的分子質量，結果如圖2所示，根據分子質量葡聚糖標準曲線得到CRWPs的重均分子質量為8 554 Da，分子均一度為1.236，表明該多糖分子質量分布較窄。

圖2 CRWPs的HPGFC色譜圖Fig.2 HPGPC chromatography of CRWPs

2.3 單糖組成分析

CRWPs的單糖組成結果如圖3所示，CRWPs主要由葡萄糖(91.56%)、半乳糖(2.13%)、甘露糖(1.61%)、葡萄糖醛酸(1.84%)、半乳糖醛酸(1.34%)、巖藻糖(0.67%)和少量阿拉伯糖(0.12%)組成。CHO等[7]從韓國傳統米酒中分離出的多糖主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，其中甘露糖含量高達24.5%，不含糖醛酸。與韓國米酒多糖相比，CRWPs具有不同的單糖組成，這可能與原料、提取方法的不同有關。以上結果表明CRWPs是一種雜多糖。

a-單糖標準曲線；b-CRWPs的單糖組成圖3 單糖標準曲線和CRWPs的單糖組成Fig.3 Standard curve of the monosaccharide and the monosaccharide composition of CRWPs

2.4 流變學特性分析

多糖的流變學特性是其應用到功能性食品的研究基礎，具有重要的研究意義，如圖4所示，當剪切速率為0.1～10 s-1時，不同濃度的多糖溶液的表觀黏度逐漸降低，在10～100 s-1時趨于穩定，且都表現出典型的剪切變稀行為[13]。然后經牛頓冪律方程N=Krn-1擬合后，得到相應的稠度系數K值和流動特性指數n值，結果見表1。CRWPs流動特性指數n值均<1，且n值隨多糖溶液濃度的增加而減小，稠度系數K隨著多糖溶液濃度增加而上升，這表明CRWPs溶液具有假塑性流體的特征，且多糖溶液濃度越高，越能呈現更好的假塑性。

圖4 不同濃度的CRWPs溶液的表觀黏度隨剪切速率變化的穩態流動曲線Fig.4 Steady shear flow curves of CRWPs solutions with different concentrations as a function of shear rate

表1 不同濃度CRWPs溶液下穩態流變的冪率方程擬合參數Table 1 Power law equation fitting parameters of different concentrations of CRWPs static rheological curve

2.5 原子力顯微鏡實驗結果

原子力顯微鏡近幾年來廣泛應用于研究多糖的表面形貌與結構，圖5為10 μg/mL的CRWPs溶液在原子力顯微鏡下的平面圖和立體圖像。其中圓環的直徑為0～149.34 nm，推測該多糖具有多分支的結構，在支鏈和直鏈的共同作用下，分子發生了聚集。多糖鏈的平均高度為0～23 nm，一般來說，多糖分子的單鏈高度為0.1～1.0 nm[14]，說明觀測到的不是多糖單鏈，可能是多條單鏈聯結在一起。該結果可能是樣品干燥時由于水分降低造成局部樣品凝聚結塊，由于多糖質量濃度大，羥基數目多，使得分子間氫鍵締合作用增強。其中多糖鏈間聚合而形成點狀或棒狀結構，從而能夠在AFM圖像上看到接近23 nm的多糖鏈聚集結構，因此推測立體中細鏈條是由單條或多條糖鏈通過分子間的相互作用力形成的螺旋結構[15]。

a、b-掃描范圍為400.0 nm×400.0 nm的平面圖、立體圖；c、d-掃描范圍為4.0 μm×4.0 μm的平面圖、立體圖圖5 CRWPs原子力顯微鏡圖Fig.5 AFM image of CRWPs

2.6 發酵益生菌結果分析

2.6.1 OD600值的變化

CRWPs對2株雙歧桿菌和2株乳桿菌增殖的影響如圖6所示，與空白組相比，CRWPs和菊粉均能顯著提高這4株菌的生物量(P<0.05)，說明CRWPs能被這4株細菌利用，進而促進這4株菌的生長。其中短雙歧桿菌的促生長效果最好，在48 h時OD600值達到了0.697±0.012，此外，CRWPs對短雙歧桿菌和動物雙歧桿菌的促生長效果比菊粉好，表明了CRWPs具有一定的益生活性。

a-短雙歧桿菌(FWX346)；b-動物雙歧桿菌(ZJTZ1M2)；c-鼠李糖乳桿菌(FFJLY7L1)；d-干酪乳桿菌(FJSSZ4L6)圖6 不同碳源發酵益生菌后OD600值的變化Fig.6 Changes in OD600 after prebiotics fermentation with different carbon sources注：數據以平均值±標準差表示；不同小寫字母表示不同碳源間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.6.2 pH變化、SCFAs和乳酸的產量變化

產酸能力是評價益生元功能的一個重要指標，培養基的pH下降程度可以反映發酵過程中的產酸量[16]。由圖7可知，與空白組相比較，菊粉和CRWPs的pH都有所下降，而發酵48 h后，菊粉和CRWPs的pH都有明顯降低(P<0.05)，結果表明，這4株菌可以利用CRWPs產生有機酸，導致pH值下降。在益生元代謝過程中，SCFAs是主要的最終產物，它不僅反映了被評價的益生菌的增殖活性，還能反映細菌對碳源的利用程度。其中乙酸、丙酸、丁酸是主要的脂肪酸，也是評價益生效應的重要指標[17]。短雙歧桿菌的下降幅度最大(P<0.01)，由5.850±0.001降到4.780±0.025，且短雙歧桿菌的生物量增加幅度最大，這與圖8中，CRWPs和菊粉組發酵48 h后的乙酸的含量明顯高于空白組(P<0.05)的結果對應，說明CRWPs能促進乙酸的產生從而降低培養基的pH，因此表明在CRWPs為碳源的發酵過程中，短雙歧桿菌的產酸能力最強，其中干酪乳桿菌下降幅度較小，表明干酪乳桿菌產酸能力要弱于雙歧桿菌。

a-短雙歧桿菌(FWX346)；b-動物雙歧桿菌(ZJTZ1M2)；c-鼠李糖乳桿菌(FFJLY7L1)；d-干酪乳桿菌(FJSSZ4L6)圖7 不同碳源發酵益生菌后pH的變化Fig.7 Changes in pH after prebiotics fermentation with different carbon sources

由圖8可知，發酵48 h后，CRWPs發酵中動物雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌產生的丙酸顯著高于其他組(P<0.05)。此外，CRWPs發酵中短雙歧桿菌產生的乙酸和丁酸濃度顯著高于其他組(P<0.05)。乙酸可被腸壁吸收并通過循環系統轉運至靶器官，為腦、肝及周圍組織提供能量[18]。丙酸能調節免疫細胞，促進抗菌因子的產生[19]。由圖8-c可知，CRWPs為碳源的發酵過程中，鼠李糖乳桿菌有較好的產丁酸能力，丁酸鹽作為一種新型分子，具有廣泛的與腸道微生物和生理相關的生物學功能，有利于腸道上皮屏障的功能發揮[20-21]。由圖8-d可知，CRWPs和菊粉產乳酸量均高于空白組，說明CRWPs可以被這4種益生菌利用產生乳酸，同時乳酸在乳桿菌與病原菌的競爭和排斥中扮演著重要作用[22]，其中短雙歧桿菌的產乳酸量最多，動物雙歧桿菌產乳酸量最低。以上結果表明，CRWPs可以被這4株菌利用，引起細菌生物量的增加，同時顯著增加主要代謝產物如SCFAs(乙酸、丙酸和丁酸)和乳酸的產量，并降低培養基的pH。綜上所述，CRWPs可以作為益生元改善雙歧桿菌和乳桿菌的生長，可能具有良好的益生活性。

a-乙酸含量變化；b-丙酸含量變化；c-丁酸含量變化；d-乳酸含量變化圖8 不同碳源發酵益生菌后SCFAs和乳酸的變化Fig.8 Changes in SCFAs and lactic acid after prebiotics fermentation with different carbon sources

3 結論

本研究從蒸餾米酒的蒸餾殘液中分離純化出一種分子質量為8 554 Da的多糖CRWPs，其主要是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸等組成。流變學分析表明CRWPs溶液具有假塑性流體的特征，通過原子力顯微鏡觀察推測該多糖具有多分支的結構。發酵益生菌結果表明CRWPs能夠促進短雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌這4株菌的生長，降低培養基的pH以及增加短鏈脂肪酸的產生。因此，CRWPs具有成為益生元的潛力，這極大地提高了蒸餾米酒蒸餾殘液的利用率，為其在經濟型、環境友好型食品行業中的應用奠定了基礎。