基于石墨烯-殼聚糖復合膜修飾電極的麻保沙星電化學免疫傳感器的構建

仇彩霞，陳秀金,2*，付祖耀，李兆周,2*，王耀,2，董藝帆，孫鳳霞，高棟

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471000)2(食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽，471000)3(石河子大學 食品學院，新疆 石河子，832003)

麻保沙星(marbofloxacin，Mab)作為一種用于治療動物皮膚感染、尿路感染和呼吸道感染的專用新型氟喹諾酮類抗菌藥，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、毒性低且對其他抗菌藥無交叉耐藥性的優點[1-2]。然而，Mab在養殖業中的長期濫用，導致其在動物性食品中的殘留超標，通過食物鏈進入機體，可能會傷害中樞神經系統，引起心血管疾病等[3]。為了更好地監管動物性食品中Mab殘留，歐盟規定了Mab在牛奶和食用動物組織中的最大殘留限量為30和150 μg/kg[4]，我國食品質量管理標準GB/T 22985—2008 《牛奶和奶粉中恩諾沙星、達氟沙星、環丙沙星、沙拉沙星、奧比沙星、二氟沙星和麻保沙星殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》中規定牛奶和奶粉中Mab限量為1 μg/kg。

目前檢測Mab殘留的方法有液相色譜法[5-6]、高效液相色譜-質譜法[7]、毛細管電泳法[8]、微生物法[9]、酶聯免疫分析法[10-12]和膠體金試紙條法[13]。其中這些儀器分析方法大都存在樣品前處理復雜、檢測成本高、依賴專業的操作人員的缺點，酶聯免疫分析方法和微生物法存在檢測時間相對長的不足，膠體金免疫層析法的靈敏度低。而電化學免疫傳感器具有靈敏、簡便和快速的優勢，能更好地滿足Mab的快速檢測需求。

氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是一種二維碳納米材料，其表面含有大量的羥基、羰基、羧基等含氧基團，這些官能團為固定抗體提供了大量的活性位點[14]。同時，GO還具有良好的生物相容性和巨大的比表面積，這些優良特性使其能夠廣泛用于電化學傳感器[15-16]。殼聚糖(chitosan，CS)作為一種天然多糖，具有良好的成膜能力和生物相容性[17]，其表面的氨基可與GO表面的羧基反應形成GO-CS復合膜，大大增加了抗體的結合面。該復合膜經電化學還原后，可大大提高電極的導電性能，從而提高Mab電化學免疫傳感器的靈敏度。因此，本研究建立基于GO-CS復合膜修飾電極的Mab電化學免疫傳感器。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GO，上海源葉生物有限公司；CS、Mab標準品、氧氟沙星標準品、諾氟沙星標準品、環丙沙星標準品，阿拉??；Mab抗體，實驗室自制；鐵氰化鉀，天津市德華化學試劑有限公司；亞鐵氰化鉀、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、氧化鋁粉末，天津市德恩化學試劑有限公司。試驗中所用試劑均為分析純，實驗用水為二次去離子水。

1.2 儀器與設備

CHI610E電化學工作站、三電極體系CHI104型玻碳電極(工作電極)、R0302型AgCl電極(參比電極)、CHI115型鉑絲電極(輔助電極)，上海辰華儀器有限公司；KQ-50超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；TM 3030 plus臺式掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 GO-CS復合膜的制備

稱取5.0 mg CS溶于5.0 mL 0.05 mol/L的HCl溶液中，攪拌溶解后，用0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH值至7.0，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的CS溶液，4 ℃保存，備用。

稱取2.0 mg GO加入到l.0 mL l.0 mg/mL CS溶液中，超聲分散1 h，得到均勻分散的GO-CS混合體系，GO質量濃度為2.0 mg/mL，4 ℃保存，備用。

采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)表征GO和GO-CS復合膜的表面形貌。

1.3.2 免疫傳感器的制備和Mab檢測

(1)免疫傳感器的制備

將直徑為3 mm的裸玻碳電極(glassy carbon electrode，GCE)表面依次用1.0、0.3和0.05 μm的氧化鋁粉末拋光，再分別用硝酸水溶液(1∶1，體積比)、無水乙醇和超純水超聲清洗，氮氣吹干。隨后進行循環伏安法(cyclic voltammetry，CV)掃描，出現穩定的氧化還原峰，且電位差在90 mV左右時，準確量取10 μL GO-CS復合膜溶液，垂直滴涂于GCE表面，室溫下自然晾干。然后將電極置于pH 7.0 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，在(+0.2)～(-1.7) V的電位范圍內利用CV法將GO-CS復合膜還原，得到還原氧化石墨烯-殼聚糖(reduced graphene oxide-chitosan，rGO-CS)復合膜。量取10 μL稀釋好的Mab抗體，垂直滴涂于rGO-CS/GCE表面，置于生化培養箱中，37 ℃下溫育1 h。再移取10 μL 5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，垂直滴涂于電極表面，37 ℃下溫育l h，得到BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE，用CV法對修飾電極進行表征。

(2)Mab檢測

量取10 μL Mab標準品溶液(或樣品溶液)垂直滴涂在BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE表面，37 ℃溫育1 h。然后在0.1 mol/L KCl+10 mmol/L K3Fe(CN)6+0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液測試底液中用CV法和差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)掃描電極，并記錄峰值電流。

1.3.3 電化學檢測

采用CV和DPV方法進行電化學檢測。在電化學工作站中，采用三電極體系，以BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，AgCl電極為參比電極。在電化學測試時，測試底液為0.1 mol/L KCl+10 mmol/L K3Fe(CN)6+0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)，GO-CS復合膜還原時CV測試電位范圍為(+0.2)～(-1.7) V，其余測試電位范圍為(-0.2)～(+0.6) V，掃描速率為50 mV/s，DPV檢測的電位范圍為0～(+0.6) V，脈沖振幅為50 mV。

1.3.4 樣品預處理

豬肉樣品預處理：將豬肉樣品切碎，準確稱取2.0 g樣品轉移至50 mL離心管中，然后向該離心管中加入pH 7.0 0.5 mol/L乙二胺四乙酸和15.0 mL二氯甲烷，避光振蕩10 min，離心(4 000 r/min，10 min)，取上清液，重復提取2次，合并有機相，減壓蒸發至近干，將殘余物復溶在含10%甲醇的磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH=7.2)中，4 ℃保存，備用。

牛奶樣品前處理：準確量取2.0 mL的牛奶轉移至50 mL離心管中，加入4.0 mL乙腈，充分渦旋混勻，振蕩10 min，離心(13 000 r/min，5 min)，取上清液，加入5.0 mL的正己烷脫脂，渦旋1.0 min，靜置，保留下層液體于圓底燒瓶中，重復2次，合并有機相，減壓蒸發濃縮至近干，用1.0 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)復溶，4 ℃保存，備用。

2 結果與分析

2.1 GO-CS復合物的表征

分別取1.0 mL的GO溶液和GO-CS溶液至玻璃皿表面，揮發至干，得到GO粉末和GO-CS復合膜，取少量粉末置于載物臺上，放到SEM中，調節放大倍數和焦距，結果見圖1。

a-GO；b-GO-CS圖1 GO和GO-CS的掃描電鏡圖(×1 000)Fig.1 The SEM of GO and GO-CS (×1 000)

GO為均勻的片狀結構，由于溶液干燥成粉末時發生了皺褶，故在SEM下觀察的結果如圖1-a所示。CS具有良好的分散性和成膜性，將GO和CS結合，形成一層均勻的導電薄膜(圖1-b)，提高了GO的分散性，增大了抗體的固定表面積。

2.2 電化學rGO-CS復合膜

在pH 7.0 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，以50 mV/s的掃描速率，在(+0.2)～(-1.7) V的電位范圍內用電化學還原法對GCE上的GO-CS復合膜進行還原，結果見圖2。

圖2 GO-CS/GCE修飾電極在0.1 mol/L 磷酸鹽溶液中的CV圖Fig.2 Cyclic voltammograms of GO-CS/GCE modified electrodes in 0.1 mol/L PBS

由圖2可知，第1圈CV掃描時在-1.6 V處出現了一個較寬的還原峰，這是由GO上含氧官能團的還原所導致。隨著電化學還原過程的發生，GO上的含氧官能團數量會越來越少，故在隨后的掃描圖中，還原電流變化越來越小，還原結果與文獻中的報道一致[18-19]。經過12圈掃描后，滴涂在玻碳電極上的GO被不可逆地還原成rGO，得到rGO-CS復合膜。據文獻報道[20]，GO上含氧官能團的存在，會導致GO的導電性變差，所以，當GO被還原后，含氧官能團數量會大大減少，rGO的導電性增強，因此rGO-CS復合膜的導電性隨之提高，進而提高免疫傳感器的靈敏度。

2.3 不同修飾過程電極的表征

采用CV法對不同修飾過程電極表面的電化學行為進行表征，結果見圖3。

a-GCE；b-GO-CS/GCE；c-rGO-CS/GCE；d-anti-Mab/rGO-CS/GCE；e-BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE圖3 不同修飾電極的CV圖Fig.3 Cyclic voltammograms of different modified electrodes in detection solution

由圖3可知，GCE裸電極(圖3中的a)經過拋光打磨處理后，出現了一對可逆的氧化還原峰，這是由六氰合鐵(III)配離子的可逆的氧化還原行為形成的。當GCE表面修飾GO-CS后，峰值電流會減小(圖3中的b)，這是因為GO導電性不高，所以用GO-CS修飾GCE后會引起峰值電流減??；而將GO還原后，GCE的導電性會明顯增強，故峰值電流顯著增大(圖3中的c)，說明rGO的導電性較強。在電極上修飾anti-Mab后，峰值電流降低(圖3中的d)，這是因為蛋白質具有絕緣性，滴加在電極上，會阻礙電極表面的電子傳遞，所以當anti-Mab成功修飾在電極上，會引起峰值電流減小。用5%BSA溶液封閉1 h后，峰值電流會進一步減小(圖3中的e)，因為BSA會阻礙電極表面的電子傳遞，使得峰值電流進一步減小。

2.4 掃描速率的影響

在保持其他條件不變的情況下，考察掃描速率(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130 mV/s)對免疫傳感器的影響，結果見圖4。

如圖4所示，在掃描速率為10～130 mV/s時，隨著掃描速率的增加，氧化峰的電流值在增大，還原峰的電流值在逐漸減小，峰值電流與掃描速率平方根呈現出良好的線性關系，回歸方程為：Ipa=1.756 64-1.591 74x，相關系數r=0.997 5和Ipc=-1.853 96+1.609 3x，相關系數r=0.997 3，說明電極反應受擴散過程控制。

2.5 檢測條件的優化

本研究分別對抗體質量濃度(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL)、測試底液中K3Fe(CN)6濃度(0、5、10、15、20 mmol/L)、測試底液pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)進行優化，結果見圖5。

由圖5-a可知，在質量濃度為0～50 μg/mL時，隨著抗體濃度的增加，固定到免疫傳感器上的anti-Mab量會增多，使電極表面的阻抗增加，從而使峰值電流減??；當抗體質量濃度高于50 μg/mL時，隨著抗體濃度的增大，峰值電流的減小變緩，說明此時抗體在電極表面的固定量接近飽和，因此，選擇50 μg/mL為Mab抗體的最佳修飾質量濃度。由圖5-b可知，隨著測試底液中K3Fe(CN)6濃度的增大，免疫傳感器的電流響應值迅速增大，當K3Fe(CN)6濃度達到10 mmol/L時，電化學免疫傳感器電流響應值達到最大值2.81×10-4A，此后，隨著K3Fe(CN)6濃度進一步增大，電流響應值增加明顯變慢，因此，選擇K3Fe(CN)6濃度為10 mmol/L。測試底液的pH值對免疫傳感器的性能也有重要影響，如圖5-c所示，峰值電流隨測試底液pH的升高先增大后減小，當pH為7.0時，峰值電流達到最大值3.31×10-4A。這是因為酸性(或堿性)環境對抗體蛋白的活性和抗體在電極表面固定量有影響。因此，選用測試底液的pH為7.0。

2.6 Mab標準曲線的建立

電化學傳感器的有效響應范圍是傳感器在實際應用中最重要的參數。按照1.3.2的方法測定Mab一系列不同質量濃度(2、5、10、15、20、25、30、35、40 ng/mL)的峰值電流，以Mab質量濃度為橫坐標，以峰值電流為縱坐標，用Origin軟件進行線性擬合，結果見圖6。

圖6 DPV的峰值電流對不同質量濃度Mab的線性擬合圖Fig.6 Linear fitting graph of peak currents of DPV towards different Mab concentrations注：插圖為免疫傳感器對不同質量濃度Mab的DPV圖

由圖6可知，在2.0～40.0 ng/mL，DPV峰值電流隨著Mab質量濃度增大而減小，呈現良好的線性關系，回歸方程為y=2.863-0.032x，相關系數r=-0.98，檢測限為0.08 ng/mL，遠低于國家規定Mab最大殘留限量。結果表明，該電化學免疫傳感器在Mab質量濃度在2.0～40.0 ng/mL范圍內的測定結果較準確。

2.7 特異性和穩定性

在Mab標品溶液中分別添加100倍質量濃度的氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星，相同條件孵育后，只含Mab標品和加入干擾物后，DPV檢測峰值電流分別為2.53×10-4、2.58×10-4、2.61×10-4、2.64×10-4A，表明在加入干擾物后，電流分別增加1.98%、3.16%、4.35%，這說明所構建的Mab電化學免疫傳感器具有良好特異性。

將電化學免疫傳感器置于4 ℃陰涼干燥處，保存25 d，每隔5 d測定1次相同電極的DPV峰值電流。結果表明，隨著保藏時間的延長，傳感器的峰值電流在緩慢下降，25 d后傳感器的峰值電流相較第1天降低約16.9%，由此得出傳感器具有較好的穩定性。

2.8 添加回收試驗

2.8.1 校正曲線

分別用豬肉樣和牛奶樣陰性樣品處理液將Mab標品稀釋成一系列質量濃度(5、10、15、20、25、30、35、40 ng/mL)，用DPV檢測，分別以Mab質量濃度為橫坐標，以峰值電流為縱坐標，用Origin軟件進行線性擬合得到樣品中Mab檢測的校正曲線。結果表明，Mab在5.0～40.0 ng/mL的質量濃度與峰值電流呈現良好的線性關系，豬肉樣回歸方程為y=2.475-0.026x，相關系數r=-0.989，檢測限為0.11 ng/mL，牛奶樣回歸方程為y=2.839-0.035x，相關系數r=-0.992，檢測限為0.097 ng/mL。

2.8.2 添加回收試驗

按照1.3.4方法處理豬肉樣和牛奶樣，在豬肉樣中Mab加標量為5、20、40 ng/g，在牛奶樣中Mab加標量為5、20、40 ng/mL，每種樣品重復處理3次，用DPV檢測，用校正曲線的回歸方程計算Mab濃度，結果見表1。

表1 添加回收試驗結果(n=3)Table 1 The results of spiked test (n=3)

由表1可知，豬肉樣添加回收率為84.40%～93.56%，相對標準偏差為0.60%～6.17%，牛奶樣添加回收率為86.40%～96.36%，相對標準偏差為0.79%～5.86%。說明本方法構建的電化學免疫傳感器可用于豬肉和牛奶中Mab殘留檢測。

3 結論

本研究基于GO-CS復合膜構建了檢測Mab的電化學免疫傳感器。為了證實電化學免疫傳感器的實用性，選擇豬肉和牛奶的陰性樣品進行添加回收試驗，結果表明，制備的Mab/BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE電化學免疫傳感器，在Mab質量濃度為2.0～40.0 ng/mL與電極峰值電流呈良好的線性關系，檢測限為0.08 ng/mL，特異性和穩定性良好。添加回收試驗表明，回收率為84.40%～96.36%，相對標準偏差為0.60%～6.17%。本研究所構建的基于GO-CS復合膜的電化學免疫傳感器可用于動物性食品中Mab的檢測。