外源性硫化氫對家兔內毒素休克誘發肺動脈高壓的干預作用*

郭 贊，劉宜先，齊 杰，羨曉輝，黃新莉△

（1.河北醫科大學生理教研室，2.病理生理教研室，石家莊 050017）

內毒素休克（endotoxic shock，ES）是常見的臨床危重病癥，血管反應性改變是其重要的病理生理特征，其中早期肺循環壓力的升高，甚至發生肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PAH）是ES時急性肺損傷的早期表現，也是導致休克難以治療的重要因素之一［1］。目前對ES誘發PAH發病機制的研究已深入到細胞、亞顯微結構和分子水平，但其具體機制仍未充分闡明。因此，探討如何防治ES時PAH的形成及其機制已成為該領域重要的研究課題。

繼一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化碳（carbon monoxide，CO）之后，硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）作為第三種內源性氣體信號分子引起了人們的關注。研究證實，H2S也具有舒張血管的作用［2］。以往本室在離體水平上的研究結果表明，H2S可能參與內毒素血癥大鼠主動脈反應性改變的調節，并發現內源性H2S生成減少可能導致內毒素血癥大鼠PAH的發生，但其具體機制尚未完全闡明［3］。其他學者的研究顯示［4-6］，內源性H2S在慢性阻塞性肺疾病患者PAH、缺氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）及休克大鼠的血管張力調節中均發揮重要作用。以往相關文獻報道就H2S對肺動脈高壓的影響及其機制多為探討內源性的H2S的作用，有關外源性的H2S對肺動脈高壓的影響及其機制多為離體實驗，在整體水平，外源性H2S對ES時PAH有何影響及其機制尚不十分清楚。本研究旨在通過頸靜脈注射大劑量細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）建立家兔ES模型，在整體水平上探討預先給予外源性H2S供體是否能夠緩解LPS誘發肺循環的紊亂，逆轉PAH的發生。并通過觀察上述過程中家兔肺動脈反應性，以及肺動脈壁結構的改變，以期為進一步闡述外源性H2S對LPS誘發ES家兔血流動力學紊亂的治療作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

大腸桿菌LPS（E.coli，0111：B4）、硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS，H2S供體）、苯腎上腺素（phenylephrine，PE，α1腎上腺素受體激動劑）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）及消炎痛（indomethacin，Indo）均購自美國Sigma公司。其它試劑均為國產分析純。

1.2 復制ES家兔模型及分組設計

成年雄性新西蘭大耳白家兔32只，體重（2.1±0.1）kg，購自河北省實驗動物中心。經耳緣靜脈緩慢注射25%烏拉坦（1 g/kg）實施全身麻醉后，立即將家兔仰臥位固定于實驗操作臺上。常規消毒后，行頸部正中切口，氣管插管，鈍性分離左側頸總動脈后插入導管（PE-50，Intramedic，New York，NY，內充滿肝素），連接多導生理信號記錄儀MP150（美國Biopac公司）用以記錄平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）；鈍性分離右側頸外靜脈，經耳緣靜脈注射肝素（1 250 U/kg，i.v.）抗凝后，經右心室插入導管至肺動脈入口處（根據顯示屏上壓力波形可判斷肺動脈導管的位置），連接多導生理信號記錄儀MP150用以監測平均肺動脈壓（mean pulmonary arterial pressure，MPAP）。動物穩定15 min后，經頸靜脈導管彈丸式注射藥物并實時連續監測MAP和MPAP，直至給藥后5 h。家兔按數字表法隨機分為4組（n=8）：（1）溶劑對照組：注入生理鹽水（0.8 ml/kg，i.v.）；（2）LPS組：緩慢（10 min）經頸靜脈注射LPS（8 mg/0.8 ml/kg）；（3）LPS+NaHS組：腹腔注射NaHS（28μmol/kg）后15 min再注入LPS；（4）NaHS組：腹腔注射NaHS（28μmol/kg）。每次靜脈給藥后再緩慢注入2 ml生理鹽水沖管。各組于給藥后5 h進行下列觀察。

1.3 離體兔肺動脈環（PARs）的制備

上述各組實驗動物放血處死后，參照文獻［7，8］報道的方法制備PARs：快速聯合取出心肺置于4℃并通有混合氣（95%O2+5%CO2）的改良Krebs液中。仔細分離肺動脈，將血管周圍組織去除干凈，剪成3 mm寬的肺動脈環，注意避免損傷肺動脈內皮。

1.4 離體PARs的張力檢測

參照文獻［8］報道的方法，將血管環垂直懸掛于盛有6 ml Krebs液（含10μmol/L的Indo以消除環氧酶產物作用）的恒溫浴槽中（37℃），并持續通入混合氣（95%O2+5%CO2）。血管環一端固定于浴槽底部，另一端連接張力換能器（T-1型）。從0 g開始，每隔5 min使PARs張力增加0.5 g，直至最適張力2 g。PARs在2 g基礎張力下平衡1 h，每隔15 min換1次液。然后用1×10-6mol/L PE和1×10-6mol/L ACh檢測PARs的反應性及內皮細胞的完整性，確認其反應性穩定及內皮細胞完整后，每組選用8個PARs用于實驗（1個環/家兔）。首先用1×10-6mol/L PE預收縮PARs，記錄預收縮值PEAX，收縮達平臺后觀察PARs對1×10-6mol/L ACh的內皮依賴性舒張反應。實驗結束后，將肺動脈環烘烤（溫度為60～70℃）至恒重，稱量每個肺動脈環的干重。收縮反應用克張力/毫克干重（g tension/mg dw）表示，舒張反應結果用占1×10-6mol/L PE收縮值的百分比表示。

1.5 肺動脈組織形態學觀察

實驗結束時，迅速留取家兔肺動脈，立刻置于事先已經準備好的4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成5μm厚切片，常規HE染色，進行光鏡觀察。另取家兔肺動脈，采用2.5%戊二醛固定，常規制備掃描電鏡標本，進行掃描電鏡觀察。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 NaHS對ES發生過程中PAH的影響

與對照組家兔MAP比較，LPS組家兔MAP呈持續性降低，0.5 h時顯著低于對照組（P＜0.01）；1 h時為（80.10±2.93）mmHg，2 h時降到更低水平（61.80±3.60）mmHg，一直維持到5 h，均顯著低于對照組（P均＜0.01，表1）。在5 h的實驗中，對照組家兔MPAP維持在（25.65±2.03～21.38±1.57）mmHg的范圍內。與對照組相比，LPS組家兔MPAP迅速升高，0.5 h達高峰，顯著高于同時間點對照組（P＜0.01）；1 h后MPAP（（34.43±1.58）mmHg，P＜0.01）和1.5 h后MPAP（（30.90±1.80）mmHg，P＜0.05）稍下降，但均顯著高于對照組；2 h后MPAP仍高于對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組相比，LPS+NaHS組雖然在最初的1 h內MPAP仍表現為升高，但1 h后開始下降且在1.5 h時間點下降接近對照組。與LPS組相比，LPS+NaHS組家兔MPAP在各個時間點均顯著降低（P均＜0.05）。與對照組相比NaHS組家兔各時間點的MPAP無明顯變化（表2）。

Tab.1 Effects of NaHSon changes in mean arterial pressure（MAP）induced by LPSin rabbits（mmHg，±s，n=8）

Tab.1 Effects of NaHSon changes in mean arterial pressure（MAP）induced by LPSin rabbits（mmHg，±s，n=8）

LPS：Lipopolysaccharides；NaHS：Sodium hydrosulfide **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPSgroup

Group 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 3 h 4 h 5 h Control 102.11±4.88 102.38±4.23 95.48±5.63 90.53±4.73 90.98±4.23 94.50±3.91 93.52±3.98 89.63±3.89 LPS 99.53±2.62 80.93±3.23**80.10±2.93**66.52±3.01**61.80±3.60**60.07±3.61**59.11±3.12**60.75±3.67**LPS+NaHS 100.50±3.75 85.81±5.93#85.73±3.98#81.35±4.95#81.60±4.72##84.02±6.15##80.02±5.36*##77.63±5.04##NaHS 98.78±4.58 96.54±3.90 91.88±3.92 90.00±3.98 91.28±3.56 97.51±4.13 96.35±3.68 97.50±3.57

Tab.2 NaHSreverses pulmonary arterial hypertension induced by LPSin rabbits（mmHg，±s，n=8）

Tab.2 NaHSreverses pulmonary arterial hypertension induced by LPSin rabbits（mmHg，±s，n=8）

LPS：Lipopolysaccharides；NaHS：Sodium hydrosulfide *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPSgroup

Group 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 3 h 4 h 5 h Control 25.65±2.03 26.40±2.70 25.43±2.40 24.64±2.33 23.03±1.88 23.18±1.87 21.38±1.57 21.68±2.48 LPS 27.23±1.20 37.88±2.55**34.43±1.58**30.90±1.80*27.91±1.73 37.68±1.74 28.21±2.58 27.60±2.10 LPS+NaHS 28.43±2.19 30.83±1.56 28.28±2.17 23.48±1.88#21.64±1.83#22.21±1.81#21.56±2.03#21.38±1.96#NaHS 27.90±3.06 25.50±3.57 26.10±2.70 21.38±1.80 21.98±1.57 20.77±1.42 20.03±1.85 20.40±1.72

2.2 NaHS對ES時PARs張力變化的影響

與對照組相比，LPS組家兔PARs對α1腎上腺素受體激動劑PE的收縮反應張力顯著增高（P＜0.01）；與LPS組相比，LPS+NaHS組家兔PARs對PE的收縮反應顯著降低（P＜0.05），并接近對照組水平；與對照組相比，NaHS組家兔PARs對PE的收縮反應無顯著差異（表3）。

與對照組家兔相比，LPS組家兔PARs對Ach的內皮依賴性舒張反應顯著降低（P＜0.01）；與LPS組相比，LPS+NaHS組家兔PARs對ACh內皮依賴性舒張反應顯著增高（P＜0.05）；與對照組相比，NaHS組家兔PARs對ACh內皮依賴性舒張反應無顯著差異（表3）。

Tab.3 Comparison of contraction response to PE and endothelium-dependent relaxation response to ACh in rat pulmonary artery（±s，n=8）

Tab.3 Comparison of contraction response to PE and endothelium-dependent relaxation response to ACh in rat pulmonary artery（±s，n=8）

LPS：Lipopolysaccharides；NaHS：Sodium hydrosulfide **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group

Group Contraction（g tension/mg·d·w） Relaxation（%）Control 2.62±0.56 86.19±7.28 LPS 4.07±0.63** 67.41±3.45**LPS+NaHS 3.09±0.41# 81.36±5.57#NaHS 2.55±0.47 85.26±8.04

2.3 NaHS對ES時肺動脈組織形態學的影響

2.3.1 光鏡觀察 HE染色后在光鏡下觀察，正常對照組家兔肺動脈內皮細胞結構連續，內皮下彈力纖維完整，平滑肌層排列整齊；LPS組家兔部分肺動脈內皮細胞脫落，內皮下彈力纖維斷裂，平滑肌層結構紊亂；與LPS組相比，LPS+NaHS組家兔肺動脈壁各層的損傷明顯減輕；NaSH組家兔各層肺動脈壁結構未見顯著變化（圖1）。

Fig.1 Microphotographs showing structural changes in pulmonary artery of rabbits（HE ×400）

2.3.2 掃描電鏡觀察 LPS組家兔肺動脈組織在掃描電鏡下的病理改變表現為部分內皮細胞缺失；LPS+NaHS組肺動脈內皮細胞形態接近對照組，僅可見細胞間隙稍增寬，未見細胞脫落。NaSH組家兔肺動脈內皮細胞結構未見顯著變化（圖2）。

Fig.2 Microphotographs showing structural changes in pulmonary artery of rabbits（HE ×400）

3 討論

ES是由于感染所導致的以機體血流動力學紊亂為特征的臨床危重癥，本實驗結合文獻，靜脈注射大劑量LPS后，家兔出現MAP呈持續性降低，標志成功建立家兔ES模型。而ES家兔MPAP迅速升高，0.5 h達高峰，顯著高于同時間點對照組；1 h和1.5 h后MPAP稍下降，但均顯著高于對照組；2 h后MPAP仍高于對照組。在LPS誘導MAP顯著降低的同時，MPAP出現早期增高而晚期下降的改變，MPAP顯著增高可引發肺水腫乃至呼吸衰竭。合并與不合并MPAP升高的呼吸障礙患者相比，前者的死亡率明顯高于后者［9，10］，因此及時有效地糾正ES早期肺循環紊亂對于防治ES具有重要意義。

以往的研究［11-13］顯示，H2S是繼NO、CO之后的第三種內源性的氣體信號分子，近些年越來越引人關注。由于其高脂溶性，故能夠自由穿過生物膜，可有效舒張血管，調節心血管系統氧化應激或抑制內質網應激，以及具有抗炎作用等。內源性H2S的供體硫氨基酸主要通過酶促反應產生H2S，而NaHS是外源性H2S供體，因為NaHS的穩定性比較好，因此NaHS溶液常作為外源性H2S供體用于動物試驗。雖然H2S被認為是第三種內源性氣體信號分子已有近二十年的時間，近年來關于H2S通過調節氧化應激或抑制內質網應激調控PAH及其它疾病的研究越來越多［14，15］，并已經證實其在調節血管張力和血管結構重建方面發揮著重要作用［16］，但目前關于H2S在ES時PAH中的確切作用及機制仍尚不明確。

本實驗發現，MPAP在大劑量LPS入血0.5 h后（早期）出現升高，且預先注射NaHS后，1 h內MPAP亦表現為升高。但隨著病程的進展和連續監測時間的延長，MPAP呈現出下降的趨勢。與對照組相比，NaHS組家兔各時間點的PAP無顯著變化。以上結果提示，NaHS能夠逆轉大劑量LPS入血后誘發的肺循環紊亂，表現為有效逆轉ES家兔MPAP的早期升高，但對正常家兔MPAP沒有顯著影響，這與本室以往有關內源性H2S可拮抗內毒素血癥大鼠引起血管的反應性張力異常變化的研究結果是一致的［3］。與以往研究不同的是，本實驗采用的動物是比大鼠體型大的家兔，且LPS的劑量較大（8 mg/kg vs5 mg/kg），動物MAP顯著降低，處于ES狀態，更接近臨床實際。

進一步研究其機制發現，預先給予外源性H2S可改善肺動脈對縮血管劑的高反應性，逆轉肺動脈血管內皮依賴性舒張反應性的降低，這與我們以往在復制的大鼠內毒素血癥模型上觀察到的結果相一致［3］。與以往研究中肺血管張力測定時先制備正常家兔的肺動脈環，然后再在體外加入不同藥物的培養基中孵育不同的是，本實驗中肺血管張力測定所用的肺動脈環是在整體用藥情況下檢測完家兔MAP和MPAP后進行取材的，屬于在整體水平探討LPS導致家兔PAH的機制；另外本實驗在檢測肺血管張力變化的同時，對肺動脈內皮細胞結構也進行形態學觀察，結果在光鏡和掃描電鏡下均觀察到肺動脈內皮細胞結構的損傷，且上述變化均可被NaHS所逆轉。以上結果提示，ES時由于內皮細胞損傷導致的肺動脈收縮反應增強、內皮依賴性舒張反應降低可以引起PAH的發生，NaHS通過保護內皮細胞改善ES時肺動脈的反應性張力變化可能是其緩解PAH的重要機制之一。

本室以往在盲腸結扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）法制備的大鼠肺損傷模型上發現，CLP大鼠肺組織中內源性H2S的含量明顯增多導致肺損傷的發生［17］。也有其它在大鼠CLP導致的休克或ES大鼠模型上的研究發現，休克時大鼠肺動脈、主動脈等血管組織中內源性H2S的含量均較對照組明顯升高［18-20］。因此H2S在ES時的確切作用及其對主動脈和肺動脈作用差異性產生的具體機制仍需進一步的實驗研究。