聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶幾種病原體的消毒效果

劉惠芬，劉文光，王安皆，王照紅，李云芝

(山東省蠶業研究所，山東 煙臺 264002)

我國是世界上最大的蠶繭、蠶絲生產及出口國，繭絲產量和出口量分別占世界總額的70%和80%[1-2]。2019年我國生產的蠶繭量為72.08萬t，農民收入292.35億元，真絲綢商品出口22.31億美元[3]。以家蠶為基礎的蠶絲業是我國許多地區農民增收的支柱型產業，然而致病病毒、真菌和細菌等微生物的危害直接導致10%左右的蠶業生產損失[4-5]。目前針對家蠶病原菌，生產上消毒多用氯制劑和醛制劑，2種藥物對環境影響較大，對人體也存在各種危害[6-7]。篩選消毒效果好、用量少、對環境和人體安全的新型蠶用消毒藥劑，是建立規?；B蠶安全模式的關鍵技術措施之一[8]。

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽(polyhexamethylene biguanide hydrochloride，PHMB)是一種環保型高分子聚合物殺菌消毒劑，為無色、無嗅、不燃、不爆的液體，具有殺菌譜廣、有效濃度低、作用速度快、性質穩定、易溶于水等優良性能，可在常溫下使用，長期抑菌，無腐蝕性[9-11]，殺菌過程中不發生強氧化反應，通過在細胞內產生沉淀作用及細胞內磷的數量上升，阻礙細胞壁與核酸的合成[12-13]，其對蝙蝠蛾幼蟲的經口急性毒性，半數致死量大于10 g·L-1，在正常消毒范圍內基本沒有影響，屬于實際無毒級消毒液[14]。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽是一種環保型殺菌消毒劑，具有高效的殺菌效果[15-17]，目前未見其用于家蠶病原體消毒，因此，本研究將探討聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶主要病原體(病毒、細菌、真菌)的消毒效果及其對蠶繭質量的影響，為開發新型綠色高效蠶用消毒劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽為山東優索化工科技有限公司分裝的佳和晟世樣品，檔案編號：079410002090；碳酸鈉(Na2CO3)購自天津市標準科技有限公司。

供試家蠶品種為菁松×皓月，由山東廣通蠶種集團有限公司提供。蠶卵正常環境下催青孵化，幼蟲在24～28 ℃、相對濕度70%左右的條件下桑葉飼育。

供試病原由本所家蠶病理實驗室保存。家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)、質型多角體病毒(Bombyxmoricytoplasmic polyhedrosis viruses，BmCPV)以家蠶繼代制取，精制后配成濃度為5.0×107mL-1的懸液，放置4 ℃冰箱中保存備用。家蠶病原白僵菌(Beauveriabassiana)自5齡幼蟲接種白僵菌發病死亡的蠶體中分離獲??；黃曲霉(Aspergillusflavus)自5齡幼蟲接種黃曲霉菌發病死亡的蠶體中分離獲取，對以上2種病原真菌取分生孢子加適量吐溫-80使其懸浮于滅菌蒸餾水中，經2層紗布過濾，分別稀釋至1.0×108mL-1、5.0×107mL-1于4 ℃冰箱中保存備用。取蘇蕓金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、沙雷鐵氏菌(又稱靈菌，Serratiamarcescens)的營養瓊脂斜面培養物，用少量滅菌水及少量吐溫-80洗下，分別稀釋至1×108mL-1置于冰箱中4 ℃保存備用。

試驗于2020、2021年在山東省蠶業研究所家蠶病理實驗室進行。

1.2 對家蠶多角體病毒的消毒試驗

將聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽配制成質量濃度為400、200、100、50 mg·L-1的復配藥液，各取200 μL分別與5.0×107mL-1的BmNPV、BmCPV多角體病毒懸液200 μL混合，混合后聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽濃度分別為200、100、50、25 mg·L-1，碳酸鈉濃度為5.0 g·L-1，病毒濃度為2.5×107mL-1，30 min后將混合液涂于2 cm×2 cm桑葉正反面，給蟻蠶添食24 h，BmNPV處理組飼養2個齡期、BmCPV處理組飼養3個齡期，調查死亡率。以自來水替代藥液處理為毒對照，并設空白對照。

1.3 對家蠶病原白僵菌、黃曲霉菌的消毒試驗

將聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽配制成質量濃度為800、400、200、100、50 mg·L-1的復配藥液，各取200 μL，分別與1.0×108、5.0×107mL-1的白僵菌、黃曲霉菌孢子懸液200 μL混合，混合后聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽濃度分別為400、200、100、50、25 mg·L-1，碳酸鈉濃度為5.0 g·L-1，白僵菌、黃曲霉孢子懸液濃度分別為5.0×107、2.5×107mL-1，30 min后將混合液涂于蠶體(白僵菌涂于2齡起蠶蠶體、黃曲霉菌涂于蟻蠶蠶體)，保濕飼育24 h后改正常飼育，飼養2個齡期調查死亡率。以自來水替代藥液處理為毒對照，并設空白對照。

1.4 對家蠶病原細菌的消毒試驗

將配制的1.0×108mL-1蘇蕓金芽孢桿菌懸液與質量濃度為4 000 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液等量混合，混合后藥物濃度為聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽2 000 mg·L-1、碳酸鈉5.0 g·L-1；沙雷鐵氏菌懸液分別與質量濃度為800、400、200、100、50 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配溶液等量混合，混合后藥物濃度分別為聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽400、200、100、50、25 mg·L-1，碳酸鈉5.0 g·L-1，混合30 min后，用處理的病原菌菌懸液對5齡起蠶進行皮下穿刺接種，飼養24 h，調查發病率。另設皮下穿刺未處理菌懸液作毒對照和不接菌穿刺作空白對照。

1.5 藥液的穩定性試驗

不同時間(2、1、0 d)配制含聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽400、200、100、50 mg·L-1的復配藥液(均含碳酸鈉10.0 g·L-1)，將此藥液敞口放置于室內，同一時間與5.0×107mL-1的BmNPV、BmCPV等量混合進行消毒，30 min后將混合液涂于2 cm×2 cm桑葉正反面，給蟻蠶添食24 h，BmNPV處理組飼養2個齡期、BmCPV處理組飼養3個齡期調查死亡率。以自來水替代藥液處理為毒對照，并設空白對照。

1.6 對繭質影響試驗

配制質量濃度為200.0、100.0 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽消毒液(均含5.0 g·L-1碳酸鈉)，4齡1、3 d，5齡1、3、5、7 d添食24 h藥液，其余時間飼喂普通桑葉，空白對照組用自來水代替消毒液，上蔟后10 d采繭。每區60頭家蠶，每個處理重復3區，在24～25 ℃條件下飼養。調查各區全繭量、繭層量及繭層率等。

1.7 數據統計處理

數據采用SPSS 20.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶病毒的消毒效果

不同濃度聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶病毒的消毒效果表明，50 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽藥液對BmNPV、BmCPV處理組家蠶死亡率分別為12%和4%，100 mg·L-1及以上質量濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽藥液對BmNPV、BmCPV處理組家蠶死亡率均為0(表1)，說明含有100 mg·L-1及以上質量濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶BmNPV、BmCPV 2種病毒具有好的消毒效果。

表1 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶病毒的消毒效果

2.2 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶病原真菌的消毒效果

200 mg·L-1及以上質量濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽藥液對家蠶白僵菌、黃曲霉菌處理后家蠶死亡率為0(表2)，結果表明聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽藥液對家蠶白僵菌、曲霉菌2種真菌均具有良好的消毒效果。

表2 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶病原真菌的消毒效果

2.3 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶病原細菌的消毒效果

從表3中可以看出，2 000 mg·L-1聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液處理蘇蕓金芽孢桿菌30 min無消毒效果。用400、200 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液處理沙雷鐵氏菌30 min，皮下穿刺的家蠶死亡率為0，消毒效果較好。

2.4 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液的穩定性

將配制2、1、0 d的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液同一時間分別與BmNPV、BmCPV等量混合進行消毒，30 min后將混合液涂于桑葉飼蠶，結果表明,復配藥液的穩定性較好(表4)，生產上配制100 mg·L-1及以上質量濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液可以2 d使用。

2.5 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對繭質的影響

處理家蠶后調查單粒重、繭層量、繭層率等指標。結果顯示，4～5齡飼喂200.0、100.0 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶全繭量、繭層量、繭層率等指標未見顯著影響(表5)。

表3 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽溶液對家蠶病原細菌的消毒效果

表4 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液的穩定性消毒試驗

表5 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對繭質的影響

3 小結與討論

家蠶核型多角體病毒(BmNPV)和質型多角體病毒(BmCPV)2種病毒多角體外殼均為一層堿溶性蛋白，需堿性環境才能破壞多角體外殼并釋放出病毒粒子[18-19]。前期我們研究發現含有碳酸鈉的復配藥液對家蠶病毒病消毒效果較好[8,20]，因此，本研究配制的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液在與病原混合后均含5.0 g·L-1碳酸鈉。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液100 mg·L-1對家蠶BmNPV、BmCPV的消毒效果達到100%，200 mg·L-1對家蠶白僵菌、黃曲霉菌的消毒效果為100%，200 mg·L-1對沙雷鐵氏菌消毒效果較好。4～5齡隔天添食24 h聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液對家蠶全繭量、繭層量、繭層率未見不良影響，因此，該復配藥液不僅可用于蠶室蠶具消毒，還可用于桑葉葉面消毒。由于外界環境影響因素較多，用于蠶室蠶具消毒時，濃度可適當提高，僅用于桑葉葉面消毒時，200 mg·L-1的濃度即可。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復配藥液敞口存放2 d對家蠶多角體病毒仍具有較好的消毒效果，在蠶桑生產中可以放到第二天繼續使用，減少浪費。

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽屬于環保型高分子聚合物殺菌消毒劑[6]，配合碳酸鈉使用，對家蠶繭質無不良影響，且對家蠶主要病原菌的有效消毒濃度可低至200 mg·L-1，用量很少，具有顯著的環保優勢，對于蠶桑生產中的消毒環節具有重要的意義。