人源內皮抑素在大腸桿菌中的可溶性表達

張吉，吳志勇，朱玲玉，辛瑜，顧正華，石貴陽，張梁*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

內皮抑素(endostatin,EDN)是一種抑制血管生成和腫瘤生長的內源性抑制劑，最初在小鼠內皮瘤細胞系的上清液中分離得到[1]。研究表明，EDN具有廣泛的抗實體瘤活性的作用，具有抑制內皮細胞增殖、遷移、血管生成等功能，因此在血管增生性疾病的治療中具有廣闊的應用前景[2-4]。人源內皮抑素(human endostatin,hEDN)是人源膠原蛋白XVⅢ型C-端的184個氨基酸片段，分子質量約為22 kDa，其中酸性氨基酸16個，堿性氨基酸29個，半胱氨酸4個，疏水氨基酸占42%，等電點為9.3，與鼠源內皮抑素具有很高的同源性，兩者約具有86%的相同氨基酸殘基[5]。研究表明，hEDN 中的N末端的1，3，11三個組氨酸殘基和76位的天門冬氨酸是4個Zn2+結合位點[6]，hEDN與Zn2+結合對其抗血管生成活性具有很重要的作用[7]。

EDN作為一種功能性多肽，國內外對其進行了大量的研究。1999—2002年，由畢赤酵母表達的重組EDN在美國進行了Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，其中Ⅱ期驗證了其安全性，但是這兩期研究的藥效學結果不太理想。在I期臨床試驗中用EDN治療皮膚傷口和腫瘤后無法檢測到其血管的變化[8]；并且在Ⅱ期臨床試驗中用EDN治療腫瘤患者后發現并沒有抑制腫瘤細胞的生長[9]。2001—2005年，國內對重組EDN進行了總共三期的臨床試驗，并通過在hEDN的N端增加氨基酸的方法來提高其可溶性和活性[10]。目前，EDN臨床應用面臨著溶解性低、穩定性差、價格昂貴、需要大劑量等問題[11]。因而，探索EDN的高效制備方法對拓展其在醫藥領域的應用具有重要意義。隨著基因工程技術的發展，生物表達系統已被廣泛應用于重組蛋白或多肽的表達和制備。目前，已有多種表達系統應用于EDN的表達，如哺乳動物細胞[12]、畢赤酵母[13]和大腸桿菌系統[14-15]。盡管哺乳動物細胞和酵母表達系統作為真核系統對真核細胞來源的蛋白或多肽的適用性更好，但成本較高且耗時長。大腸桿菌表達系統具有生長速度快、遺傳背景好、表達水平高和價格低廉等優點，是生產重組蛋白較合適的系統之一[16]。喬路等[17]通過大腸桿菌(Escherichiacoli)實現了hEDN的原核表達，但是產物為包涵體。目前，雖然已經實現了hEDN在大腸桿菌中的表達，但是其產物多為蛋白質錯誤折疊而形成的不溶性包涵體，并且包涵體處理步驟復雜且復性成功率不高。因此，在大腸桿菌中探究hEDN的可溶性表達對實現其大量制備具有重要的意義。

融合標簽在蛋白或多肽的表達過程中具有重要作用，如促進目的蛋白可溶表達，緩解異源蛋白毒副作用等。常用的融合標簽包括谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase,GST)標簽[18]、硫氧還蛋白A (thioredoxin A,Trx A)標簽[19]、麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein,MBP)標簽[20]和小分子泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)標簽[21]等。值得注意的是，GST融合標簽不僅是一種促溶標簽，同時也是一種親和蛋白純化系統，通過在大腸桿菌中誘導表達GST融合蛋白，并通過將GST結合特性應用于谷胱甘肽來純化融合蛋白[22]。研究表明，這些促溶標簽能大大提高重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達率[23]。因此，通過利用融合標簽來促進異源蛋白的表達和生產是一種可行的策略。

本研究利用分子生物學技術分別構建了hedn單基因表達質粒、融合標簽共表達質粒和融合表達質粒并轉入到大腸桿菌中，搖瓶發酵并通過SDS-PAGE和串聯飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight/ ionization time of flight，MALDI-TOF/TOF)鑒定hEDN的表達情況，進而探究hEDN的可溶性表達條件。進一步地，在優選的GST融合表達基礎上，對搖瓶發酵的誘導溫度、誘導時間、誘導劑濃度和添加誘導劑的時間等條件進行了優化，確定了hEDN融合蛋白的最佳發酵條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒

本研究所用菌株和質粒見表1。

表1 本研究所用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 引物

本研究引物序列信息詳見表2。

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 試劑與培養基

LB培養基(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10，115 ℃滅菌20 min。

TB培養基(g/L)：酵母粉24，胰蛋白胨12，甘油 5，KH2PO42.31，K2HPO412.54，115 ℃滅菌20 min。

主要試劑:限制性內切酶，美國Thermo公司；GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker，上海Yeasen公司；T4DNA連接酶，大連Takara公司；重組PreScission Protease，上海源葉公司；2×TaqMaster Mix、2×PfuMaster Mix，杭州寶賽生物科技有限公司；質粒DNA提取、片段純化、凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；PrePack GSH Purose 4 Fast Flow預裝柱，江蘇千純公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.4 儀器與設備

S100D型PCR儀、Chemi Doc凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司;DYY-6C核酸電泳儀，北京六一儀器廠;Pico17高速離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司;HYL-C型組合式搖床，太倉市實驗設備廠;Sonic VCX-750型超聲波細胞破碎儀，南京新辰生物科技有限公司;SCG蛋白純化系統，蘇州賽譜儀器有限公司;MALDI-TOF/TOF串聯飛行時間質譜儀，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人源內皮抑素表達質粒的構建

1.2.1.1 單基因表達質粒的構建

UniProt (www.uniprot.org)中查詢得到人源內皮抑素氨基酸序列(Identifier:P39060)，基于大腸桿菌密碼子偏好性對其進行密碼子優化，交由上海生工生物工程有限公司合成基因并將人源內皮抑素基因humanendostatin(hedn)序列克隆在pUC57質粒上，記為pUC57-hedn。以質粒pUC57-hedn為模板，利用PCR擴增片段，通過酶切、連接、轉化、菌落PCR、測序等分子生物學手段，最終得到E.coliBL21(DE3)/ pET28a-hedn重組菌株。

1.2.1.2 融合標簽共表達表達質粒的構建

構建方法同1.2.1.1,最終得到E.coliBL21(DE3)/pTIG-hedn重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-TrxA-hedn重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-hedn-TrxA重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-mbp-hedn重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-hedn-mbp重組菌株。

1.2.1.3 融合表達質粒的構建

構建方法同1.2.1.1,最終得到E.coliBL21(DE3)/ pET-32a-hedn重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn重組菌株。

1.2.2 人源內皮抑素的誘導表達及質譜鑒定

將上述重組大腸桿菌分別劃線于卡那霉素、氨芐青霉素抗性平板上37 ℃倒置培養12 h，挑取單菌落，接種于15 mL LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min培養12 h，以1∶50體積比接種于50 mL LB培養基中，37 ℃，200 r/min培養至OD600=1.4～1.6時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)至終濃度為0.2 mmol/L，在16 ℃，200 r/min條件下，誘導發酵24 h，12 000 r/min，5 min離心棄上清液收集菌體，用pH 8.0 PBS緩沖液(140 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,1.8 mmol/L KH2PO4)洗滌3次，將重懸后的菌體用超聲破碎儀破碎，破碎條件:破1 s，停2 s，總時間24 min，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，取上清液和沉淀，通過SDS-PAGE分析其表達情況。

將成功表達的SDS-PAGE凝膠條帶切割后置于1.5 mL EP管中，然后對凝膠進行脫色、溶化、消化等預處理，利用MALDI-TOF/TOF分析。

1.2.3 人源內皮抑素誘導條件的優化

確定能成功表達hEDN的重組菌株后，使用TB培養基37 ℃，200 r/min條件搖瓶發酵24 h，每2 h取樣，測OD600值，描繪該重組菌株的生長曲線。根據菌株生長曲線改變其搖瓶發酵的誘導溫度、誘導時間、誘導劑IPTG的濃度及加入誘導劑IPTG的時間，通過SDS-PAGE分析hEDN表達情況，篩選最佳發酵條件。

1.2.3.1 誘導溫度

挑取重組菌株的單菌落，接種于15 mL LB培養基中，37 ℃，200 r/min培養12 h，以1∶50體積比接種于TB培養基中，37 ℃，200 r/min培養至OD600=1.4～1.6時加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，分成3組，分別于16、20、25 ℃繼續培養36 h，其他條件保持一致，12 000 r/min，5 min收集菌體。

1.2.3.2 誘導時間

挑取重組菌株的單菌落，接種于15 mL LB培養基，37 ℃，200 r/min培養12 h，以1∶50體積比接種于TB培養基，37 ℃，200 r/min培養至OD600=1.4～1.6時加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L，分成3組，分別于20 ℃繼續培養12、24、36 h，其他條件保持一致，12 000 r/min，5 min收集菌體。

1.2.3.3 誘導劑IPTG的濃度

挑取重組菌株的單菌落，接種于15 mL LB培養基，37 ℃，200 r/min培養12 h，以1∶50體積比接種于TB培養基，37 ℃，200 r/min培養至OD600=1.4～1.6時加入IPTG，分成5組，每組加入IPTG分別至終濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L，20 ℃繼續培養36 h，其他條件保持一致。

1.2.3.4 加入誘導劑IPTG的時間

挑取重組菌株的單菌落，接種于15 mL LB培養基中，37 ℃，200 r/min培養12 h，以1∶50體積比接種于TB培養基，37 ℃，200 r/min培養，分成6組，每組加入誘導劑IPTG的時間分別為2、4、6、8、10、12 h，加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L，20 ℃繼續培養36 h，其他條件保持一致。

1.2.4 人源內皮抑素蛋白的純化

1.2.4.1 人源內皮抑素融合蛋白的純化

用2 mL/min去離子水清洗PrePack GSH Purose 4 Fast Flow預裝柱約20 min，去除乙醇；以2 mL/min流速、pH 8.0 PBS (140 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,1.8 mmol/L KH2PO4)平衡柱料約20 min；將過膜的hEDN融合蛋白上清液以1 mL/min的流速進樣，以2 mL/min的流速用pH 8.0 PBS再次平衡柱料約20 min；然后以1 mL/min的流速用洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L還原型谷胱甘肽,pH 8.0)進行洗脫約20 min，分別收集洗脫峰進行SDS-PAGE分析。另將得到的上述洗脫液進行超濾濃縮并且置換溶液，置換成50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.0)，便于后期PreScission 蛋白酶(PreScission protease，PPase)酶切處理。

1.2.4.2 重組PPase切割融合蛋白及質譜鑒定

重組PPase是由human rhinovirus type 14 3C protease和GST組成的融合蛋白，該蛋白酶可在低溫下特異識別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進行酶切。

PPase酶活力定義(U):在5 ℃條件下反應16 h，能夠切割10 μg的GST標簽的融合蛋白達90%以上所需的酶量定義為1個活性單位。

將PPase以20 U酶活力的量加入到含有200 μg的hEDN融合蛋白中，反應體系包含50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.0,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA和1 mmol/L DTT的緩沖液，在5 ℃條件下進行酶切，16 h 和24 h后取樣，SDS-PAGE檢測酶切效果。

回收SDS-PAGE凝膠GST標簽及hEDN條帶置于1.5 mL EP管中，然后對凝膠進行脫色、孵育、凍干、消化、點樣等預處理，用MALDI-TOF/TOF分析。

2 結果與分析

2.1 人源內皮抑素表達質粒的構建及驗證

2.1.1 單基因表達質粒的構建及驗證

按照1.2.1.1的方法成功構建了單基因表達質粒pET28a-hedn。酶切結果如圖1-a所示。

2.1.2 融合標簽共表達質粒的構建及驗證

按照1.2.1.2的方法成功構建了融合標簽共表達質粒pTIG-hedn、pETDuet-1-TrxA-hedn、pETDuet-1-hedn-TrxA、pETDuet-1-mbp-hedn、pETDuet-1-hedn-mbp。酶切結果如圖1-b～圖1-f所示。

2.1.3 融合表達質粒的構建及驗證

按照1.2.1.3的方法成功構建了融合表達質粒pET32a-hedn、pGEX-6p-1-hedn。酶切結果如圖1-g和圖1-h所示。

M-Marker,DL-10 000(Takara);1-重組質粒酶切結果a-pET28a-hedn；b-pTIG-hedn；c-pETDuet-1-Trx A-hedn；d-pETDuet-1-hedn-Trx A；e-pETDuet-1-mbp-hedn；f-pETDuet-1-hedn-mbp；g-pET32a-hedn；h-pGEX-6p-1-hedn圖1 重組質粒酶切驗證Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmids

2.2 人源內皮抑素的誘導表達及質譜鑒定

將上述含有hedn表達質粒的菌株及對應空載菌株進行搖瓶發酵，16 ℃，200 r/min，0.2 mmol/L IPTG誘導24 h，將破碎后的上清液及沉淀進行SDS-PAGE分析，結果如圖2所示。本文構建的所有單基因表達菌株及融合標簽共表達菌株發酵培養獲得的重組蛋白經SDS-PAGE分析均未得到與hEDN分子質量理論值22 kDa相一致的條帶，結果如圖2-a～圖2-f所示。融合表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET32a-hedn理論上表達的融合蛋白大小應約為44 kDa，但是并未檢測到相應大小的條帶，如圖2-g所示。融合表達菌株E.coliBL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn得到了與理論值相一致的融合蛋白，大小約為47 kDa，且對照組未檢測到相應條帶，如圖2-h所示。根據上述結果，初步確定僅有E.coliBL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn能成功表達hEDN。進一步通過MALDI-TOF/TOF鑒定，結果如圖3所示，破碎后上清液蛋白得分為128，破碎后沉淀蛋白得分為161，并且得分在質譜結果中排名靠前，表明結果可信，進一步確認hEDN的成功表達。

M-Marker；1-空載破碎后上清液；2-空載破碎后沉淀；3-重組菌株破碎后上清液；4-重組菌株破碎后沉淀a-E.coli BL21/pET28a-hedn;b-E.coli BL21/pTIG-hedn;c-E.coli BL21/pETDuet-1-Trx A-hedn;d-E.coli BL21/pETDuet-1-hedn-Trx A;e-E.coli BL21/pETDuet-1-mbp-hedn;f-E.coli BL21/pETDuet-1-hedn-mbp;g-E.coli BL21/pET32a-hedn;h-E.coli BL21/pGEX-6p-1-hedn圖2 不同重組菌株的蛋白表達情況Fig.2 Protein expression of different recombinant strains

a-hEDN融合蛋白破碎后上清液;b-hEDN融合蛋白破碎后沉淀圖3 hEDN融合蛋白的MALDI-TOF/TOF結果分析Fig.3 MALDI-TOF/TOF analysis of hEDN fusion protein

2.3 人源內皮抑素融合蛋白誘導條件的優化

E.coliBL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn菌株生長曲線如圖4所示，該菌株在16 h左右基本進入穩定期。依據該菌株的生長曲線，分別對誘導溫度、誘導時間、誘導劑IPTG濃度及加入誘導劑IPTG濃度條件進行發酵優化。

圖4 重組菌株的生長曲線Fig.4 Growth curve of the recombinant strain

2.3.1 誘導溫度

按照1.2.3.1方法，結果如圖5-a和圖5-b所示，細胞破碎上清液中明顯16 ℃表達量最少，20 ℃和25 ℃無明顯差別；但是這3個溫度中25 ℃表達的包涵體明顯是最多的，所以選擇20 ℃作為最佳誘導溫度。

2.3.2 誘導時間

按照1.2.3.2方法，結果如圖5-c和圖5-d所示，細胞破碎上清液中誘導12 h表達量最少，誘導36 h表達最多；并且誘導12 h包涵體最多，誘導36 h包涵體最少，因此選擇誘導36 h 最為合適。

2.3.3 誘導劑IPTG濃度

按照1.2.3.3方法，結果如圖5-e和圖5-f所示，從不同濃度IPTG誘導的效果來看，hEDN融合蛋白包涵體的表達無明顯差別，但細胞破碎上清液是有細微區別的，0.3 mmol/L的IPTG誘導效果稍好一些，因此選擇0.3 mmol/L IPTG作為最佳誘導劑濃度。

M-Marker;a,b-1-16 ℃,2-20 ℃,3-25 ℃,c,d-1-12 h,2-24 h,3-36 h,e,f-1-0.1 mmol/L,2-0.2 mmol/L,3-0.3 mmol/L,4-0.4 mmol/L,5-0.5 mmol/L,g,h-1-2 h,2-4 h,3-6 h,4-8 h,5-10 h,6-12 ha-誘導溫度-破碎后上清液;b-誘導溫度-破碎后沉淀;c-誘導時間-破碎后上清液;d-誘導時間-破碎后沉淀;e-誘導劑濃度-破碎后上清液;f-誘導劑濃度-破碎后沉淀;g-加入誘導劑時間-破碎后上清液;h-加入誘導劑時間-破碎后沉淀圖5 發酵優化SDS-PAGE分析結果Fig.5 SDS-PAGE analysis results of fermentation optimization

2.3.4 加入誘導劑IPTG時間

按照1.2.3.4方法，結果如圖5-g和圖5-h所示，在2～12 h添加誘導劑時，hEDN融合蛋白包涵體的表達無明顯差別，而8、10、12 h添加誘導劑時細胞破碎上清液中hEDN融合蛋白的表達效果優于2、4、6 h添加誘導劑，且在8、10、12 h添加誘導劑時上清液中hEDN融合蛋白的表達無明顯差異。

2.4 人源內皮抑素蛋白純化

2.4.1 人源內皮抑素融合蛋白純化

因hEDN和GST標簽融合表達，所以可溶性部分先過1次PrePack GSH Purose 4 Fast Flow預裝柱初步純化，SDS-PAGE分析顯示在47 kDa處得到相應的理論值條帶，表明初步純化得到hEDN融合蛋白，但同時SDS-PAGE結果顯示在約25 kDa處出現1條明顯條帶，飛行時間質譜鑒定為GST標簽蛋白條帶(圖6-a、圖6-c、圖6-d)。

M-Marker；a-1-空載破碎后上清液;2-hEDN融合蛋白破碎后上清液;3-穿透液;4～9-收集液;b-1-收集液濃縮；2-酶切16 h；3-酶切24 ha-純化后的hEDN融合蛋白的SDS-PAGE分析;b-hEDN融合蛋白酶切后的SDS-PAGE分析;c-鑒定GST標簽結果;d-鑒定GST標簽氨基酸序列結果圖6 hEDN融合蛋白純化及酶切后結果分析Fig.6 The results of the purified hEDN fusion protein and its enzymatic hydrolysate by the PPase

將純化收集得到的樣品進行超濾濃縮且置換成50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.0)，為下一步切除GST標簽做準備。

2.4.2 重組PPase切割融合蛋白

初步得到的純化樣品是包含hEDN和GST標簽的融合蛋白，需要將GST標簽切掉通過再次純化得到hEDN。PPase是能夠切割GST標簽的蛋白酶，酶切16 h后經SDS-PAGE分析在25 kDa以下檢測到兩條條帶(hEDN-1和hEDN-2)，如圖6-b所示，這兩條帶從上到下的質譜結果依次如圖7所示，結果顯示這兩條帶都是hEDN。

a-鑒定GST標簽結果;b-鑒定GST標簽氨基酸序列結果;c-鑒定hEDN-1結果;d-鑒定hEDN-1氨基酸序列結果;e-鑒定hEDN-2結果;f-鑒定hEDN-2氨基酸序列結果圖7 hEDN融合蛋白酶切后的MALDI-TOF/TOF結果分析Fig.7 MALDI-TOF/TOF results of hEDN fusion protein after digestion by the PPase

3 討論

大腸桿菌表達系統具有良好的遺傳背景、低成本培養和高生產等優點，因而大腸桿菌表達系統是重組蛋白表達的首選[16]。然而，重組hEDN在大腸桿菌中容易形成包涵體。為了探究hEDN可溶性表達條件，本研究嘗試在大腸桿菌中建立不同的表達體系，最終在所構建的重組菌株中僅有GST融合標簽成功實現了hEDN的可溶性表達。值得注意的是，E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-mbp-hedn菌株轉接至發酵培養基誘導表達后，發現培養基較澄清，表明該菌株并沒有生長。hEDN較難在大腸桿菌中異源表達，可能是由于hEDN對細胞具有毒副作用，此外hEDN的表達依賴于胞內細胞器，而大腸桿菌中缺乏能促進蛋白成功表達的細胞器[24]。本文GST標簽實現了hEDN的可溶性表達，并通過優化hEDN融合蛋白的發酵條件可知，重組菌處于對數生長后期時再加入誘導劑會增加hEDN融合蛋白的表達量。將細胞破碎上清液經過GST親和層析初步得到hEDN融合蛋白，同時也得到了較濃的GST標簽蛋白，可能是因為融合蛋白不穩定斷裂或胞內蛋白酶切割造成的[25]。此外，hEDN融合蛋白經PPase酶切后理論上應得到hEDN，GST標簽和PPase 3個部分，但是在SDS-PAGE分析中在15～25 kDa中得到兩條條帶，經過MALDI-TOF/TOF鑒定這兩條帶均為hEDN，這可能是由于PPase不正確切割所致，因為PPase對切割位點識別的敏感性受到核心區域兩端氨基酸殘基的影響[26]，或者是由于不適宜的酶切條件引起二次切割所導致的[27]，后續可對酶切條件進一步探索。

4 結論

本文利用GST融合標簽表達策略實現了hEDN的可溶性表達，并通過發酵優化進一步確定了hEDN融合蛋白的最佳表達條件(8～12 h添加終濃度0.3 mmol/L IPTG,20 ℃誘導36 h)。該研究為人源多肽的可溶性表達與純化提供了研究思路，同時對微生物發酵制備功能性多肽具有一定的借鑒意義。下一步，將通過細胞實驗對hEDN功能進行驗證。