萜烯類化合物基于細胞自噬的初步探究

李一澍，姚逸萍，黃和強，陳杉彬，趙文梅，楊海存，王德良*，郝飛克*

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015)3(酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京，100015)4(青?；ブ篼溇茦I有限公司，海寧，810500)

青稞酒作為承接古老傳統生產工藝的清香型白酒之一，是以青稞為主要原料釀造而成[1-2]。目前研究發現，青稞酒中含有豐富的醇、醛、酸、酯等成分[3-4]。劉志鵬等[5]通過全二維飛行質譜鑒定出青稞酒中含有的448種揮發性化合物，其中包括呋喃類、內酯類和萜烯類。萜烯類化合物是最大的天然產物之一，現已知3 000多種[6]，萜烯類化合物是以異戊二烯為結構單位倍數的烴類及其含氧衍生物，其中包括單萜烯類、倍半萜烯類以及二萜烯類化合物等[7]。近幾年相關研究顯示，青稞酒中含有α-蒎烯、香茅醇、β-石竹烯、月桂烯、羅勒烯、檸檬烯、β-紫羅酮等多種萜烯類成分[5,8-9]。據報道，α-蒎烯具有神經保護性、抗氧化性、抗癌及抗炎的功能[10-12]；香茅醇具有抗凋亡、抗炎的功能[13-15]；β-石竹烯具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、鎮痛及促進創傷修復的功效[16-19]；月桂烯具有抗氧化、抗炎、抗衰老的功效[20-22]；而羅勒烯的功效尚未清楚；檸檬烯具有抗炎、抗氧化、抗病毒及抗糖尿病等功效[23-24]；β-紫羅酮是一種抗癌活性劑，并具有抗氧化及抗炎的功效[25-28]。但目前青稞酒中獨特風味成分的功能性尚未清楚。

細胞自噬是一種細胞內的“自我吞噬”的機制，主要借助膜結構對錯誤折疊的蛋白和受損的細胞器進行降解再利用[29]。酒精的過量攝入會導致過量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的堆積，ROS會氧化和破壞線粒體所產的脂質、核酸和氨基酸前體等，導致線粒體功能障礙，從而誘導細胞自噬[30]。氧化應激和細胞自噬相互調控，作用關系復雜。據報道，α-蒎烯可提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione,GSH)的功能，并降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮和白介素-6(interleukin-6，IL-6)的含量，實現抗氧化和抗炎的作用[10]。同時香茅醇、β-石竹烯、月桂烯、羅勒烯、檸檬烯、β-紫羅酮等均具有一定的抗氧化性，但包括α-蒎烯在內的物質對細胞自噬的影響尚未明確，并且有關的報道較少。因此，本研究選取上述7種萜烯類成分開展對細胞自噬影響作用研究及功能評價。

通過用不同濃度萜烯類化合物處理人源正常肝細胞，采用蛋白免疫印跡法(Western blotting)、實時熒光定量(real time quantitative PCR，RT-qPCR)和免疫熒光等方法，分析了α-蒎烯、香茅醇、β-石竹烯、月桂烯、羅勒烯、檸檬烯、β-紫羅酮對細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-蒎烯、羅勒烯、β-紫羅酮,美國Thermo公司；香茅醇，美國Acros organics公司；檸檬烯，江西環球天然香料有限公司；β-石竹烯、月桂烯，上海麥克林公司；RPMI-1640培養基，美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、鏈霉素、青霉素，美國Hyclone公司；兔抗微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3，LC3)、P62/SQSTM1，日本Medical &Biological Laboratories公司；GAPDH、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、594抗兔lgG二抗,美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SpectraMax?iD3多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司；Micro 21R小型臺式離心機，美國Thermo公司；2-16N高速微量離心機，湖南恒諾儀器設備有限公司；ChenmiScope 6200 Touch化學發光成像系統，上海勤翔科學儀器有限公司；THUNDER Imager 3顯微成像系統，德國Leica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

L02細胞采用高糖 RPMI-1640培養基培養,并添加質量分數10%的胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素，培養條件為 37 ℃、5% CO2。當細胞生長至85%左右融合度時，使用質量分數0.25%胰蛋白酶消化細胞,進行傳代處理，試驗所用細胞均為3～15代。

1.3.2 細胞存活率試驗

以2.0×104/孔接種LO2細胞于96孔微孔板中，放置細胞培養箱中培養24 h后，用不同的萜烯類化合物處理24 h。使用細胞增殖檢測試劑盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法檢測細胞增殖能力：在培養板的每孔細胞中滴加CCK-8溶液10 μL，放置細胞培養箱中孵育2 h。使用酶標儀測定細胞在450 nm處吸光度值，各組細胞的存活率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1為不同萜烯類化合物測定的吸光度；A2為正常培養基測定的吸光度。

1.3.3 RT-qPCR法

使用Invitrogen試劑盒提取LO2細胞總RNA，并根據LC3、P62基因mRNA序列設計 PCR引物。LC3引物(上游5′-TGCTGTCCCGAATGTCTCCTG-3′、下游5′-GCTAACCAAGCCTTCTTCCTCC-3′)；P62引物(上游5′-TGCCCAGACTACGACTTGTG-3′、下游 5′-AGTGTCCGTGTTTCACCTTCC-3′)；內參采用GAPDH，引物為 (上游5′-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3′、下游5′-TCACACACCAGCAGGTTATCATC-3′。引物合成由上海生工生物技術公司完成。RT-qPCR 反應體系嚴格按照Vazyme試劑盒說明書進行?？偡磻w系為20 μL，反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。反應結束儀器自動生成循環閾 (cycle threshold,Ct) 值,用各組mRNA與內參基因的Ct值的差值 (ΔCt)，最后用 (2-ΔΔCt)表示各組mRNA的相對表達量。

1.3.4 Western blotting試驗

以1.6×105/孔接種LO2細胞于6孔板中，藥物處理24 h后，PBS洗3次，用含有蛋白酶抑制劑混合物的蛋白質提取液A裂解LO2細胞，并在4 ℃下以12 000 ×g離心15 min，吸出細胞上清液。用BCA蛋白質測定試劑盒測定上清液中的總蛋白質濃度。取100 μL細胞上清液加入25 μL的5×樣品緩沖液混勻。樣品在98 ℃下加熱10 min，然后以13 800×g離心1 min。將10 μL上清液加到10%SDS-PAGE凝膠上。電泳后，將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上，并在封閉緩沖液(5%脫脂奶，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20)中室溫封閉1 h，在4 ℃下分別與抗兔LC3和P62一抗孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次5 min，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育40 min后，進行顯色和拍照。用ImageJ軟件進行定量分析和比較。

1.3.5 免疫熒光法

LO2細胞計數，以1.6×105/孔接種于6孔板中，分組處理24 h后，PBS洗2次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次，用含有0.3% Triton X-100和1% BSA的PBS室溫封閉1 h，分別加兔抗LC3和P62抗體(1∶1 000)，避光孵育1 h，PBS洗3次，加入594抗兔lgG二抗(1∶1 000)室溫孵育40 min，PBS洗3次，用含有4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察LC3和P62的表達強度及定位。

1.3.6 數據統計與分析

用SPSS 23.0分析處理數據，所有實驗數據均為3次平行試驗的平均值，用平均值±標準誤(SE± Mean)表示；圖表由Origin 2018繪制。

2 結果與分析

2.1 萜烯類化合物對LO2細胞存活率的影響

利用CCK-8方法觀察萜烯類化合物對LO2細胞存活率的影響,如圖1所示。與對照組相比，α-蒎烯處理組的細胞在0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL 4個不同質量濃度下，細胞存活率均明顯增加(P<0.001)；香茅醇處理組的細胞，在質量濃度為0.05 mg/mL時，細胞存活率增加(P<0.001)，當質量濃度>0.4 mg/mL時，細胞存活率明顯降低；β-石竹烯處理組的細胞，在質量濃度<0.2 mg/mL時，細胞存活率明顯增加(P<0.001)，但高于此質量濃度范圍，細胞存活率則低于對照組；月桂烯處理組的細胞，在質量濃度<0.2 mg/mL時能夠正常存活，在質量濃度為0.05 mg/mL時細胞存活率顯著升高(P<0.001)；檸檬烯處理組的細胞在5種不同質量濃度中的存活率無明顯差異；羅勒烯處理組的細胞，在質量濃度>0.1 mg/mL時，細胞存活率就開始呈下降趨勢；β-紫羅酮處理組的細胞，在質量濃度為0.4 mg/mL時就開始大量死亡。結合上述實驗結果，在保證細胞存活率無顯著性差異的情況下，針對α-蒎烯選取質量濃度為0.1、0.2、0.4 mg/mL；香茅醇選取0.05、0.1、0.2 mg/mL；β-石竹烯選取0、0.1、0.2 mg/mL；月桂烯選取0、0.05、0.1、0.2 mg/mL；檸檬烯選取0、0.05、0.1、0.2 mg/mL；羅勒烯選取0、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL；β-紫羅酮選取0、0.05、0.1、0.2 mg/mL進行后續實驗。

a-α-蒎烯；b-β-石竹烯；c-香茅醇；d-月桂烯；e-羅勒烯；f-檸檬烯；g-β-紫羅酮圖1 七種萜烯類化合物對LO2細胞存活率的影響Fig.1 Effects of terpenes on the survival rate of LO2 cells注：圖中*代表有顯著差異，*表示(P<0.05)，**表示(P<0.01),***表示(P<0.001)(下同)

2.2 萜烯類化合物對細胞自噬的影響

能量調節因子腺苷酸活化蛋白激酶(AMP- activated protein kinase，AMPK)與自噬相關蛋白哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)在細胞自噬中起著重要的調節作用。在營養條件下，自噬相關蛋白mTORC1被激活，自噬處于低活性狀態。當細胞處于饑餓條件下，AMPK蛋白被激活，從而抑制mTORC1蛋白，導致自噬被激活[31]。本研究用7種萜烯類化合物分別處理細胞24 h后，在營養與饑餓的條件下，觀察其對于細胞自噬的影響作用。如圖2所示，經α-蒎烯處理后的細胞，在營養條件下，LC3蛋白表達水平以濃度依賴的形式增加，并與饑餓條件下表達水平一致；香茅醇處理后的細胞，在營養和饑餓條件下的蛋白表達水平無明顯差異；羅勒烯處理后，在0.4 mg/mL時，LC3蛋白表達水平增加；經β-石竹烯、月桂烯、檸檬烯和β-紫羅酮處理后的細胞，兩種條件下的LC3蛋白表達水平也均無明顯差異。實驗結果顯示，α-蒎烯處理后，自噬相關蛋白LC3的表達水平呈濃度依賴性增加，可能對細胞自噬具有促進作用；而羅勒烯在0.2 mg/mL時呈現抑制自噬的作用，當質量濃度在0.4 mg/mL時，LC3表達量增加，此結果提示羅勒烯對自噬可能存在抑制作用，所以不在后續實驗中展開研究；而其他5種萜烯類化合物在細胞自噬方面無顯著性作用。終上所述，根據實驗結果提示α-蒎烯對自噬的影響較顯著，所以選取α-蒎烯進行后續的試驗。

a～c-α-蒎烯;d～f-香茅醇;g～i-β-石竹烯;j～l-月桂烯;m～o-檸檬烯;p～r-羅勒烯;s～u-β-紫羅酮圖2 七種萜烯類化合物對LC3蛋白表達的影響Fig.2 The effect of terpenes on the expression of LC3 protein

2.3 α-蒎烯對細胞自噬mRNA水平的影響

為了進一步證明α-蒎烯對細胞自噬的影響，檢測了α-蒎烯對自噬相關蛋白LC3和P62 mRNA相對表達水平的影響。如圖3所示，經α-蒎烯處理后，營養條件和饑餓條件下的LC3蛋白表達水平都以濃度依賴的形式增加，而P62的表達水平有所降低。在典型情況下，P62是一種泛素化蛋白，會隨著自噬流量的上調而減少[32]。LC3蛋白的mRNA表達水平與Western blotting的結果相一致。結合實驗結果提示，α-蒎烯可能對細胞自噬具有促進作用。

a-LC3 mRNA表達水平;b-P62 mRNA表達水平圖3 α-蒎烯對LC3和P62 mRNA表達水平的影響Fig.3 The effect of α-pinene on the mRNA expression level of LC3 and P62

2.4 α-蒎烯加入自噬阻斷劑對細胞自噬的影響

巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1，BafA1)是一種自噬末期阻斷劑，通過阻斷自噬體與溶酶體的融合，并抑制溶酶體中pH值和蛋白質降解阻斷自噬[33]。由于在圖2-a、圖2-b中，在營養條件下α-蒎烯處理后LC3的蛋白表達強度較弱，這可能是由于自噬流量過大導致的。為了更確切地觀察α-蒎烯對細胞自噬的影響，在接下來的實驗中，加入自噬末期阻斷劑BafA1。BafA1可以阻斷自噬末期，抑制LC3在自噬溶酶體中的重利用或降解。結果如圖4所示，經對照組和α-蒎烯處理后的細胞中LC3蛋白表達水平均有所增加。使用BafA1處理2 h后，α-蒎烯處理組的LC3表達水平顯著上調，這是由于BafA1通過抑制自噬末期，阻斷LC3的降解[34]。因此，可以進一步判定α-蒎烯可能對細胞自噬具有促進作用。

a-α-蒎烯Western blotting結果;b-α-蒎烯灰度值分析圖4 加入bafA1觀察α-蒎烯對細胞自噬的影響Fig.4 Observe the effect of α-pinene on autophagy through adding bafA1

YIN等[35]通過免疫熒光方法分析了血管生成素2(angiopoietin 2，Ang2)對LC3和P62對細胞自噬的影響。研究表明，Ang2能提高LC3蛋白的熒光點數并減弱P62的熒光點數，誘導自噬。為了進一步驗證α-蒎烯對細胞自噬的影響，通過免疫熒光法分析了α-蒎烯對 LC3和P62蛋白表達水平的影響。2.1中的實驗結果顯示，α-蒎烯在質量濃度為0.4 mg/mL時，對細胞自噬的影響最大，差異顯著，因此選取0.4 mg/mL的質量濃度進行免疫熒光分析。結果如圖5所示，使用α-蒎烯處理24 h后，細胞內形成大量自噬體，LC3蛋白被招募至自噬體表面。紅色LC3蛋白多于綠色熒光蛋白，顯示自噬被充分誘導，且完成了自噬體成熟并與溶酶體融合成為自噬溶酶體的整個過程[36]，且P62蛋白表達水平隨著自噬流量的增加而降低，這與以前的研究結果相一致。該結果進一步顯示，α-蒎烯在營養及饑餓條件下，均可明顯誘導細胞自噬發生、發展并成熟。

a-LC3熒光強度;b-P62熒光強度圖5 免疫熒光分析α-蒎烯對LC3蛋白表達水平的影響Fig.5 Immunofluorescence analysis of the effect of α-pinene on the expression of LC3 protein

3 結論

本研究通過用不同濃度的萜烯類化合物處理細胞，利用 Western blot分析觀察了7種萜烯類化合物對細胞自噬的影響，結果表明，經香茅醇、β-石竹烯、月桂烯、羅勒烯、檸檬烯、β-紫羅酮處理后，細胞的LC3蛋白表達水平均無明顯變化，而α-蒎烯處理后的LC3蛋白表達水平以濃度依賴性的水平上調。為了進一步探究α-蒎烯對細胞自噬的影響作用，通過 RT-qPCR檢測了α-蒎烯處理組在營養及饑餓條件下LC3和P62 mRNA表達水平變化，結果顯示，α-蒎烯處理后，LC3 mRNA表達水平上調，P62 mRNA表達水平降低。此外，免疫熒光分析結果也顯示了α-蒎烯對細胞自噬的促進作用。

綜合所有實驗結果表明，相較于青稞酒中的其他6種萜烯類化合物，α-蒎烯在一定濃度內可能對LO2細胞具有一定的促進細胞自噬的作用。這為接下來的自噬相關研究提供了參考，也為減弱肝損傷治療方案提供了有效參考。