益生乳酸菌Weissella hellenica L-1的篩選鑒定及其海帶發酵特性研究

茍中軍，黃巧，屈明成，張宇昊，李潔，肖琳

1(聚慧食品科技(重慶)有限公司，重慶，401147)2(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)3(重慶食品工業研究所，重慶，400000)

海帶含有豐富的化學成分和生物活性物質，已被用于食品、飼料和藥物前體等許多工業領域[1-2]。研究表明，海帶中含有十分豐富的褐藻多糖，褐藻多糖又分為褐藻膠、褐藻淀粉與褐藻糖膠3種物質[3]，其中褐藻膠占比為15%～25%，在功能性食品與部分藥品的再加工過程中的應用價值非常高[4-5]。此外海帶還含有豐富的褐藻酸、維生素、礦物質和多種微量元素，并因含有游離的谷氨酸而帶有十分豐富的鮮味[6]。目前我國海帶的培育技術已十分成熟，但海帶加工利用卻仍處于初級階段，產品主要是鹽漬海帶、淡干海帶和即食調味海帶[7]，創新性發展海帶深加工產業、研發健康營養的海帶加工制品，符合我國2030健康中國戰略需求，同時可增加海帶附加值，促進海帶產業鏈可持續發展。

西南地區素有食用發酵食品的傳統，蘊含著豐富的益生菌資源[8]，但西南地區目前益生菌資源家底不清，挖掘與基礎特性研究不足，已經成為制約西南地區發酵食品產業發展瓶頸。發酵食品的風味是影響產品感官品質和消費者接受度的重要因素，西南地區傳統泡菜的愉悅風味來自于異型乳酸菌發酵和同型乳酸菌發酵[9]，在發酵初期，異型乳酸菌迅速產生大量的乙酸、乙醇、甘露醇等風味物質，隨著發酵進行，同型乳酸菌會取代異型乳酸菌大量產酸，使得最終產品具有十分酸爽的感覺，兩者協同發酵形成了其獨特的風味[10]。

針對以上問題，本研究以西南地區典型農家泡菜為原料，從中分離優勢乳酸菌菌株，進行純化、鑒定，并對其生理生化特征進行研究；在此基礎上將其用于海帶蔬菜汁發酵，研究了發酵過程中益生菌保留量及產品理化特性變化規律。旨在挖掘西南地區特色益生菌資源，并本著海帶中益生元組分利用的理念，為益生菌發酵類健康食品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

酸菜采自西南地區農家；海帶和卷心菜購自重慶永輝超市；植物乳桿菌購自湖北省工業微生物菌種保藏與研究中心；MRS培養基(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5、牛肉膏10、葡萄糖20、磷酸氫二鉀2、檸檬酸三銨2、乙酸鈉5、吐溫80 1 mL、七水硫酸鎂0.58、四水硫酸錳0.25，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。固體培養基加入15 g瓊脂。種子培養基(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏10、酵母提取物5、葡萄糖20，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。蛋白胨、瓊脂，山東拓普生物工程有限公司；牛肉膏，上海麥克林生化科技有限公司；磷酸氫二鉀、檸檬酸銨、乙酸鈉、葡萄糖、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉 (均為分析純)，重慶川東化工集團有限公司；吐溫80 (分析純)、酵母提取物，成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

SJ-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；MAS-II plus微波合成萃取反應工作站，上海新儀微波化學科技有限公司；GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱、SPX-250B-Z生化培養箱，上海博訊實業有限公司；ATY224電子天平，Shimadzu Corporation；DW-HL100超低溫冷凍冰箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；LDZH-100L立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的采集與制備

使用冰盒將采集的樣品運回實驗室。在無菌超凈工作臺中，稱取1.0 g農家自制酸菜樣品，置入含9 mL 無菌去離子水試管中，通過渦旋充分振蕩，制備成母懸浮液。利用去離子水，將母懸浮液制備成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀釋液，備用。

1.3.2 樣品中菌株篩選與分離

吸取100 μL上述各稀釋液涂布于MRS固體培養基上，35 ℃培養48 h，分離菌株，每個稀釋液濃度重復3次。

單菌落培養。根據菌落形態、顏色、大小等用滅菌的牙簽將MRS固體培養基上的不同類單菌落轉接到對應培養基上劃線純化，最后將菌種用50%(體積分數)甘油貯藏于-80 ℃冰箱中。

1.3.3 菌株鑒定

菌株的形態學和生理生化特征參照《常見細菌系統鑒定手冊》[11]。使用試劑盒提取菌體總DNA，以菌體DNA為模版，乳酸菌采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TAGG GTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增，將擴增后的PCR產物送往上海生工生物公司測序，將測得的基因序列使用Blast與NCBI數據庫上的序列進行比對，選擇同源性較高的相關序列使用MEGAX軟件來構建菌株的系統進化樹。

1.3.4 菌株L-1產酸能力檢測

對菌株L-1產酸能力的評價方法分為pH值檢測法和產酸速率檢測法[12]。

1.3.5 菌株L-1的耐鹽與耐酸能力檢測

1.3.5.1 耐鹽能力

將菌株L-1在種子培養基中活化12 h后，菌液的OD600值達到0.8。分別按1%(體積分數)的接種量接種于含有不同NaCl質量濃度(0、10、20、30、40、50、60 g/L)的100 mL種子液體培養基的250 mL三角瓶中，以不接菌的種子培養基作為空白對照，每組設3個重復，35 ℃，80 r/min搖床培養48 h后，用分光光度計在600 nm處測定培養液的吸光值。

1.3.5.2 耐酸能力

將菌株在種子培養基中活化12 h后，菌液的OD600值達到0.8。分別按1%(體積分數)的接種量接種至不同pH(1、2、3、4、5、6、7)的含有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，以不接菌的種子培養基作為空白對照，每組設置3個重復，35 ℃，80 r/min培養48 h后，測定培養液在600 nm處OD值。

1.3.6 細菌菌懸液的制備

將本研究篩選到的菌株L-1和購買的植物乳桿菌接種于MRS固體培養基上35 ℃培養1 d，用牙簽取菌體接種于含有100 mL種子液體培養基的250 mL 三角瓶中，35 ℃恒溫下，80 r/min搖床培養18 h，直至菌液濃度達到1×108CFU/mL，備用。

1.3.7 海帶蔬菜汁制備

將海帶與卷心菜去掉有病斑、腐爛點的樣品，用自來水洗凈后，將海帶與水以質量比1∶3打漿，卷心菜與水以質量比1∶2打漿，備用。

實驗設計：本研究在3個重復實驗中進行了有因子排列的完全隨機設計(3×4因子設計)。實驗處理包括：(1) 3水平的配方因子(質量分數)：25%海帶+75%卷心菜；50%海帶+50%卷心菜；75%海帶+25%卷心菜。(2) 2水平的菌種因子(體積分數)：接種2%植物乳桿菌的海帶液；接種1%植物乳桿菌和1%希臘魏斯氏菌L-1的海帶液。結合以上不同因素的設計，我們共得到了6個不同的處理(3×2)，使用了18瓶(6×3)。對18個三角瓶進行無菌接種后，搖勻，置于恒溫培養箱中21 ℃下發酵。從第3天開始定期取樣，一直取樣至第6天。

1.3.8 微生物分析和pH值測定

參照GB 4789.2—2016進行菌落總數測定。用pH計測定pH值。

1.3.9 總糖和還原糖測定

將每天取出的樣品8 000 r/min離心15 min。吸取上清液備用，總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[13]，還原糖含量的測定采用DNS法[14]。

1.3.10 感官評價

對發酵結束后的海帶蔬菜汁樣品進行了消費者可接受性測試，采取10分制(表1)進行感官評定。

表1 感官評分標準Table 1 Standards of sensory evaluation

1.4 數據處理

每個樣本均進行3次平行，應用Origin 8.6和DPS數據軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 菌株L-1的形態、生理生化反應和種類鑒定

顯微鏡觀測菌體呈不規則短棒狀，成對或短鏈排列(圖1-b)，最適生長溫度為35 ℃，其他生理特征見表2。測序結果顯示菌株L-1的16S rDNA基因序列長度為1 480 bp；在BLAST數據庫進行相似性比對，并使用MEGAX構建系統發育樹(圖1-c)。結果顯示，菌株L-1與菌株希臘魏斯氏菌(Weissellahellenica)(Genbank登錄號：EU7947360)的相似性達100%，并且在系統發育樹上親緣關系最近。根據L-1的形態特征、生理生化以及其16S rDNA序列分析，初步鑒定該菌株L-1為希臘魏斯氏菌(Weissellahellenica)。

a-菌落形態;b-鏡檢圖片;c-系統發育樹圖1 菌株L-1菌種鑒定Fig.1 Identification of strain L-1 used in the study

表2 菌株L-1的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical charactersitics of strain L-1

2.2 菌株L-1的產酸能力

菌株L-1的產酸能力見圖2，隨著發酵時間的增加，菌株的產酸能力不斷增強，當培養9 h時，發酵液pH已達到4.40，產酸速率達到1.99，據文獻報道大多數乳酸菌在培養9 h后的產酸速率在0.43～1.29[15]，本實驗篩選到的希臘魏斯氏菌L-1在1.99，明顯高于這個數值，具有較大的優勢，說明菌株L-1的產酸速度非?？?，這一特性將對后續發酵起到重要的作用。

圖2 菌株L-1的產酸能力Fig.2 Acid production capacity of strain L-1

2.3 脅迫下菌株L-1的耐受性

由圖3可知，菌株L-1具有較廣泛的耐鹽能力，最高可耐受50 g/L NaCl，最適生長的鹽質量濃度為0 g/L；在0 g/L鹽濃度條件下，菌株L-1酸性pH的耐受范圍為2～7，說明菌株L-1對較寬范圍的酸性條件有良好的適應性。

a-NaCl質量濃度；b-pH圖3 菌株L-1的耐鹽與耐酸性能Fig.3 Acid-resistent and halotolerant performance of strain L-1

2.4 海帶蔬菜汁發酵過程中菌落總數和pH值變化

海帶蔬菜汁發酵過程中菌落總數變化見圖4-a。結果顯示，海帶的添加量影響了微生物的生長和發酵水平，菌落總數隨著海帶的增加而不斷降低。在發酵第3天時，植物乳桿菌和希臘魏斯氏菌L-1都能夠很好的代謝海帶卷心菜中的有機質，所有樣品中的菌落總數迅速增加，表現了較強的生長能力。在發酵初期，不管何種海帶添加量，單獨接種植物乳桿菌的菌落總數都要高于協同發酵的菌落總數。

在發酵過程中，2種接種方式的3種海帶液的pH值在發酵前3 d呈快速下降趨勢，然后緩慢下降，直至穩定。25%海帶液中接種植物乳桿菌的海帶液pH值穩定在3.33～3.35，而接種2種發酵菌劑的海帶液pH值穩定在3.35～3.37；50%海帶液中接種植物乳桿菌的海帶液pH值穩定在3.51～3.55，而接種2種發酵菌劑的海帶液pH值穩定在3.66～3.68；75%海帶液中接種植物乳桿菌的海帶液pH值穩定在3.72～3.75，而接種2種發酵菌劑的海帶液pH值穩定在3.93～3.97(圖4-b)。說明植物乳桿菌和希臘魏斯氏菌L-1可以利用海帶卷心菜液中的營養物質生長，同時產生酸性代謝物質，促使環境pH值隨著發酵的進行不斷降低。

a-海帶蔬菜汁發酵過程中菌落總數變化;b-海帶蔬菜汁發酵過程中pH值變化圖4 海帶蔬菜汁發酵過程中菌落總數和pH值變化Fig.4 Changes in bacterial count and pH in kelp vegetable juice during fermentation

2.5 發酵過程中總糖和還原糖變化

如圖5所示，在25%海帶液中，接種植物乳桿菌后，總糖和還原糖含量分別降低了38.81%和26.58%，接種2種菌劑后，總糖和還原糖含量分別降低了43.28%和41.72%；在50%海帶液中，接種植物乳桿菌后，總糖和還原糖含量分別降低了30.84%和28.39%，接種2種菌劑后，總糖和還原糖含量分別降低了35.98%和31.63%；在75%海帶液中，接種植物乳桿菌后，總糖和還原糖含量分別降低了12.67%和10.32%，接種2種菌劑后，總糖和還原糖含量分別降低了15.77%和12.60%。海帶中游離糖含量很少，高含量的海帶降低了可用于發酵的糖類，降低了發酵速度?？偺呛康臏p少主要是來自于還原糖的減少。不管何種海帶添加量，協同發酵組的總糖與還原糖消耗量都要高于單獨接種植物乳桿菌，先前研究表明，卷心菜中主要的糖類為葡萄糖，其次是果糖和蔗糖[16]，海帶中還含有葡聚糖海帶素和糖醇甘露醇[17]，這些現成的碳來源可能更有利于希臘魏斯氏菌的定殖，并被其發酵利用。

2.6 感官品質評價

圖6表明，海帶添加量對海帶卷心菜發酵液的感官品質有較大的影響，其中對色澤影響最大，50%和75%的海帶液中顏色較25%的海帶液深，據報道，消費者認為顏色較淺是一種新型發酵海藻產品可以接受的外觀[18]。希臘魏斯氏菌L-1協同植物乳桿菌發酵海帶卷心菜液，盡管色澤、酸度描述分數低于單獨接種植物乳桿菌實驗組，但其具有明顯的的酸鮮口感，同時，協同發酵實驗組比單獨接種植物乳桿菌發酵組的發酵液更具有愉悅香氣和和諧口感。此外，在25%海帶添加量下，協同發酵組在海帶香味(7.5)和復合香味(8.9)方面也優于單菌種發酵組。希臘魏斯氏菌是異型發酵乳酸菌，其經過磷酸戊糖途徑發酵后除主要產乳酸外還可以產生大量乙酸、乙醇與甘露醇等風味物質，具有產物多樣性的特點[10]，賦予產品更好的風味。其協同同型乳酸發酵菌植物乳桿菌可以明顯改善植物乳桿菌發酵海帶調味汁風味貧乏的缺點。

3 結論

以西南地區典型農家泡菜為原料分離篩選了1株優勢乳酸菌，經過16S rDNA序列分析，菌株L-1鑒定為希臘魏斯氏菌 (Weissellahellenica)，具有優秀的產酸能力，最高可耐受pH為2、NaCl質量濃度為50 g/L。

將這一菌株協同植物乳桿菌(同型乳酸發酵菌)發酵海帶蔬菜汁，結果表明25%(質量分數)海帶配制的發酵產品更快達到較低的最終pH值，協同發酵組在海帶香味(7.5)和復合香味(8.9)方面顯著優于單菌種發酵組，而且具有更愉悅的香氣與和諧口感。