市售四川臘肉中微生物群落結構及生物胺的相關性研究

劉雨萱，任冠潔，魯家璇，陳玙玲，臧名洋，湯小玲，楊柳青，李建龍，劉書亮，何利，陳淑娟，李琴，楊勇

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)

腌臘肉制品是指以鮮(凍)畜、禽肉或可食副產品為原料，添加或不添加輔料，經腌制、烘干(或曬干，風干)等工藝加工而成的非即食肉制品，包括臘肉、火腿、咸肉、香(臘)腸等，市場消費量大，特別是在川渝地區[1]。據不完全統計腌臘肉制品消費量約占四川肉制品消費總量的60%左右，四川臘肉是其中很重要的一個產品。傳統四川臘肉屬自然發酵肉制品，通常是以豬肉為原料，經過預處理、碼味、腌制、煙熏、成熟等步驟制成，因其顏色鮮明、香味濃郁、臘味濃而無煙味等特點，深受消費者喜愛，馳名中外[2]。傳統四川臘肉的發酵過程主要依賴原料肉及環境中的微生物作用，將原料肉中的蛋白質、脂質等氧化、分解，生成具有特殊風味的小分子化合物。但是，在這個過程中某些微生物會利用原輔料產生對人體健康有害的成分，如生物胺。

生物胺是一種小分子有機堿性物質，由醛、酮通過轉氨基作用生成脂肪族的生物胺或是由氨基酸在微生物產生的氨基酸脫羧酶的作用下生成相應的生物胺。少量的生物胺是人體必需物質，它能參與腦活動、胃酸分泌、免疫反應等[3]，但高濃度的生物胺則會引起惡心、頭痛、血壓變化等不良反應，嚴重中毒還會對心臟和中樞神經系統造成不可逆的損害[4]。部分生物胺還會與內源性、外源性的亞硝酸鹽反應，生成強致癌物N-亞硝胺，故而發酵食品中的生物胺水平已被用作衡量食品安全的指標之一。LI等[5]、王新惠等[6]混合取樣測定了市售中國傳統香腸樣品、臘腸等，發現部分樣品中生物胺含量超過了美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)規定標準。但是未見文獻報道與香腸類似的市售四川臘肉中生物胺含量，且目前檢測生物胺均為混合取樣，對肥、瘦肉中生物胺含量分布并不清楚。

目前，有學者對四川臘肉中微生物多樣性進行了研究。文開勇等[7]利用高通量測序技術發現四川臘肉中細菌多樣性指數高于真菌，優勢屬為葡萄球菌屬。趙睿等[8]通過比較得到川渝地區煙熏臘肉優勢菌門為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門等。全拓等[9]通過平板計數法得出四川臘肉貨架期內優勢菌群為葡萄球菌和微球菌，其次是乳酸菌。DABADé等[10]調查了比利時市售食品中生物胺與微生物之間的相關性發現：尸胺濃度與乳酸菌、腐胺濃度與總需氧菌計數、β-苯乙胺濃度與腸球菌呈顯著正相關。但是關于微生物群落結構及四川臘肉中生物胺含量的相關性未見文獻報道。

故而本研究將通過測定市售四川臘肉中微生物群落結構及肥、瘦肉的生物胺含量，分析四川臘肉中微生物與生物胺的相關性，為四川臘肉的質量及安全性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

56種四川臘肉均購于各區域的農貿市場或超市，按照地理位置分別是川北(廣元、綿陽、阿壩)，川西(雅安、成都、甘孜、眉山)，川南(宜賓、自貢、樂山)，川東(南充、巴中、遂寧)。樣品采樣后立即置于無菌取樣袋中封存，低溫運回實驗室，立即取樣用于微生物分析。其余樣品保存在-80 ℃，用于生物胺檢測及備用。

組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、苯乙胺、亞精胺、丹磺酰氯等標準品，美國Sigma公司；乙腈、丙酮、甲醇均為色譜級，成都浩搏優科技有限公司；PCA培養基、MRS瓊脂、MSA培養基、VRBA培養基，杭州微生物試劑公司；PDA培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司；超純水等為實驗室自制。

ST16R高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；YQ-DSX-280B高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；BMS602均質機，德國BRT；DHP-9272B型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；JA1203型電子天平，上海越平科學儀器有限公司；LC-2010CHT高效液相色譜儀，美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物檢測方法

取25 g樣品，加入225 mL無菌生理鹽水后，高速均質3 min，吸取1 mL上清液進行梯度稀釋。參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》的方法對樣品中菌落總數進行測定。參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》方法對樣品中乳桿菌進行測定。參照GB 4789.41—2016《食品微生物學檢驗 腸桿菌科檢驗》的方法對樣品中腸桿菌科進行測定。參照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》的方法對樣品中霉菌和酵母進行測定。參照劉洋[11]的方法對樣品中葡萄球菌和微球菌進行測定。

1.2.2 生物胺的檢測

1.2.2.1 生物胺標準溶液的配制

參照LU等[12]的方法，準確稱取10 mg組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、亞精胺、苯乙胺，用0.4 mol/L高氯酸定容至10 mL，為各單標標準儲備液，貯存于4 ℃冰箱備用。分別吸取10、20、25、50、100、250、500、1 000 μL的各單標標準儲備液定容至10 mL，為混合標準溶液，取1 mL混合標準溶液進行柱前衍生，其余于4 ℃冰箱備用。

1.2.2.2 樣品處理

參照SUN等[13]的方法，略作修改。分別取5 g 瘦肉、5 g肥肉加入20 mL 0.4 mol/L高氯酸，高速勻漿3 min，過濾上清液，沉淀部分如上述步驟再提取1次。合并2次上清液定容至50 mL，取1 mL進行柱前衍生。

1.2.2.3 柱前衍生

參照LU等[12]的方法，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH、300 μL飽和NaHCO3、2 mol/L丹磺酰氯丙酮溶液，最后用乙腈定容至5 mL，過0.22 μm濾膜，上機檢測。

1.2.2.4 柱前衍生

參照孫霞[14]的方法，色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，流動相A為超純水，流動相B為色譜級乙腈，采用梯度洗脫程序進行分離，如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

1.3 數據處理

本研究所有數據均為3次重復下的平均值，所有生物胺含量數據均通過水分含量換算成干基物質含量。數據采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，計算各指標的平均值和標準差；采用R語言Corrplot包進行Spearman相關性分析，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著；繪圖使用R語言、Origin 2020、Microsoft office Excel 2007 軟件。

2 結果與分析

2.1 四川臘肉中微生物群落結構

四川臘肉中群落結構如圖1所示，可以看出川南地區臘肉中微生物數量最多，其次是川西地區，川北和川東地區差距不大，川東地區最低。張佳敏等[15]檢測了四川傳統臘腸中微生物含量，川南地區臘腸中微生物含量最高，川北地區、川西地區和川東地區呈現不顯著差異，與本實驗結果一致?？赡苁且驗榇系貐^濕度較高、風速較低，川南地區臘肉中水分散失較慢，有利于微生物生長；而川東地區氣候比較干燥，相對濕度較低，水分散失較快，限制了微生物的生長[16]。

從圖1可以看出，川北地區霉菌和酵母是臘肉貨架期中主要的優勢菌群，其次是乳桿菌及葡萄球菌和微球菌，川西地區優勢菌群是霉菌和酵母以及乳桿菌，川南地區優勢菌群為霉菌和酵母菌，乳桿菌、葡萄球菌和微球菌次之，川東地區優勢菌群為乳桿菌，葡萄球菌和微球菌次之?？偟膩碚f，四地區含量最高的為霉菌、酵母菌或乳酸菌，葡萄球菌和微球菌次之，最低的是大腸桿菌。這與文開勇等[7]的研究不一致，文開勇等通過高通量測序技術獲得四川臘肉中優勢細菌門為厚壁菌門，優勢細菌屬為為葡萄菌屬，趙睿等[8]利用高通量測序分析市售工業臘肉細菌多樣性時也發現川渝地區厚壁菌門是絕對優勢菌門，這可能一方面是因為文開勇等僅測了四川達州地區6份臘肉樣品,趙睿等檢測的是市售工業臘肉，不包括農家自制臘肉，與本實驗所選樣本不同；另一方面可能是因為本實驗所采用的方法僅能檢測可培養微生物，部分不可培養微生物無法檢測。陳美春等[17]研究表明四川臘肉中優勢菌為乳酸菌和葡萄球菌，貯藏后期霉菌大量增長，甚至超過乳酸菌，與本研究結果一致。

圖1 四川各地區臘肉中群落結構Fig.1 The structure of microbial community in Sichuan bacon from various regions

2.2 四川臘肉中生物胺含量

2.2.1 生物胺標品色譜圖及標準曲線

生物胺混合標準品色譜圖如圖2所示，雜質峰及溶劑峰在6 min前全部洗脫，標準品峰能夠較好分離。標準品標準曲線如表2所示，7種生物胺標準品線性關系良好，相關系數較高，說明該方法能較為準確的測出生物胺含量。

1-色胺；2-苯乙胺；3-腐胺；4-尸胺；5-組胺；6-酪胺；7-亞精胺圖2 生物胺標品色譜圖Fig.2 Chromatograms of biogenic amine standards

表2 生物胺回歸方程及相關系數Table 2 Biogenic amine regression equation and correlation coefficient

2.2.2 市售四川臘肉中生物胺含量

市售四川臘肉中生物胺含量相應結果見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.ts.20220124.2034.010.html)。

組胺是毒性最強的生物胺，歐盟規定食品中組胺含量不得超過100 mg/kg。由圖3可知組胺主要集中在瘦肉中，瘦肉中組胺含量超過100 mg/kg的樣品有27個，肥肉中13個，說明四川臘肉中組胺含量偏高，需要進行控制。而川北地區肥肉中平均含量超過瘦肉，這可能是因為川北地區臘肉的脂質氧化產物更能促進組氨酸化學脫羧形成組胺[18]。從地區來看，川南地區臘肉中組胺含量最高，瘦肉中組胺平均值為144.59 mg/kg，肥肉中組胺平均值為65.17 mg/kg；川東地區臘肉組胺含量最低，瘦肉中組胺平均值為78.49 mg/kg，肥肉中組胺平均值為21.66 mg/kg，整體趨勢與微生物結構類似。

酪胺的毒性僅次于組胺，但也有研究證明在作用于人腸上皮細胞的體外模型上時,酪胺比組胺的毒性更大[19]。LATORRE-MORATALLA等[20]報道酪胺是西班牙市售發酵干香腸中最常見、含量最豐富的生物胺。在四川臘肉中，酪胺并非含量最多的生物胺，在瘦肉中平均值為67.92 mg/kg，肥肉中平均值為0.66 mg/kg，這可能是因為酪氨酸主要集中在瘦肉中，并且脂質氧化產物等無法促進酪胺形成。從地區來看，川南地區臘肉中酪胺含量最高，川北地區、川西地區臘肉次之，川東地區臘肉中酪胺含量最低。

尸胺和腐胺本身毒性較小，但他們能夠抑制單胺氧化酶和其他代謝組胺的酶，從而增強組胺毒性，同時在加熱過程中，腐胺和酪胺還會與亞硝酸鹽形成N-亞硝胺等致癌物，故而有必要對四川臘肉中尸胺和腐胺含量進行檢測[21]。尸胺在肥、瘦肉中均有檢出，瘦肉中平均值為128.23 mg/kg，肥肉中平均值為91.43 mg/kg，是四川臘肉中含量第二高的生物胺。WANG等[22]研究表明尸胺是干腌培根中主要的生物胺，這與本實驗結果不一致，這可能是因為所檢測樣品種類及地區不一致。腐胺肥瘦肉中均有，且腐胺在肥肉中含量較高，這可能是因為腐胺的原料之一——谷氨酰胺可以存在于脂肪中[23]。從地區來看，尸胺在川南地區臘肉中含量最高，川東地區臘肉中含量最低；腐胺在四地區臘肉中含量都較高，川西地區臘肉中最高，川南地區最低。

攝入過量的苯乙胺、色胺會引發高血壓、嘔吐、出汗、頭疼等反應，甚至還會引起腸細胞的壞死和凋亡[24]。歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)報道發酵肉制品中苯乙胺高達182 mg/kg，色胺達194 mg/kg[25]。四川臘肉瘦肉中苯乙胺平均值達68.95 mg/kg，色胺平均值達171.49 mg/kg；肥肉中苯乙胺含量達33.55 mg/kg，色胺為15.62 mg/kg，與EFSA報道結果接近。從地區來看，苯乙胺含量在四地區臘肉中相差不大；色胺在川南地區臘肉瘦肉中檢出最高。

亞精胺會引起腸細胞壞死，但是通常情況下食品中亞精胺濃度不具有細胞毒性。四川臘肉中亞精胺主要來源于原料肉，其會根據原料肉來源及部位不同而有所區別，含量差異較大[24]。川西地區臘肉中亞精胺最高，瘦肉達161.61 mg/kg，肥肉達133.50 mg/kg；川東臘肉中亞精胺含量最低，瘦肉為62.35 mg/kg，肥肉為37.60 mg/kg。

從總生物胺含量來看，市售四川臘肉瘦肉中含量高于肥肉中，瘦肉中總生物胺含量在162.8～2 161.58 mg/kg，平均值為574.15 mg/kg；肥肉中總生物胺含量在NA(未檢出)～1 158.52 mg/kg，平均值為338.44 mg/kg，與孫霞[14]檢測結果接近。如圖3所示，市售四川臘肉中，川南地區臘肉中生物胺總量最高，其次是川西地區和川北地區，川東地區臘肉最低，與微生物結果一致，這可能也與該地區溫度、濕度等環境因素有關。與孫霞[14]結果不一致，這可能是樣品種類不同所導致。

圖3 市售四川臘肉肥肉及瘦肉中總生物胺的含量Fig.3 The content of total biogenic amines in commercial Sichuan bacon

2.3 市售四川臘肉中微生物群落結構與生物胺的相關性分析

通過Spearman進行相關性分析，評估市售四川臘肉中群落結構與肥肉、瘦肉中生物胺含量之間的相關性，結果如圖4所示。

SH-瘦肉組胺；SL-瘦肉酪胺；SS-瘦肉尸胺；SF-瘦肉腐胺；SSE-瘦肉色胺；SY-瘦肉亞精胺；SB-瘦肉苯乙胺；SZ-瘦肉總生物胺；FH-肥肉組胺；FL-肥肉酪胺；FS-肥肉尸胺；FF-肥肉腐胺；FSE-肥肉色胺；FY-肥肉亞精胺；FB-肥肉苯乙胺；FZ-肥肉總生物胺；VRBA-大腸桿菌；PCA-菌落總數；MSA-葡萄球菌和微球菌；MRS-乳桿菌數；PDA-霉菌和酵母；ZM-總微生物數圖4 四川臘肉微生物群落結構與肥肉、瘦肉中生物胺的相關性Fig.4 Correlation between the microbial community structure and the biogenic amines in fatty and lean meat of Sichuan bacon注：*表示顯著相關(P<0.05)，**表示極顯著相關(P<0.01)，***表示極顯著相關(P<0.001)

大腸桿菌與肥肉、瘦肉中各種生物胺均沒有顯著相關性。菌落總數與瘦肉中總生物胺含量呈顯著正相關，相關系數為0.28，與肥肉中組胺、腐胺含量呈極顯著負相關，相關系數-0.36、-0.52。葡萄球菌、微球菌數與肥肉中組胺、腐胺含量呈極顯著負相關，相關系數為-0.35、-0.52。乳酸桿菌與肥肉中腐胺含量呈極顯著負相關，相關系數為-0.38。霉菌、酵母與瘦肉中總生物胺含量呈極顯著正相關，相關系數為0.36，與肥肉中組胺含量呈顯著負相關，與肥肉中腐胺含量呈極顯著負相關。GARDINI等[26]報道總生物胺與菌落總數呈顯著正相關，腸桿菌與發酵香腸中生物胺呈正相關，乳酸菌與組胺、酪胺、尸胺、腐胺形成都有關。這可能一方面是因為樣品的原料、加工方式、生產環境等不同，而這些因素都對生物胺的形成有影響；另一方面是因為本實驗只檢測了可培養微生物，而不可培養微生物可能很大程度影響了一些生物胺的形成，這需要進一步研究。

3 結論

本文通過傳統培養法測定可培養微生物，高效液相色譜法測定生物胺含量，探明了四川區臘肉中微生物群落結構、生物胺含量及其相關性。結果表明，市售四川臘肉中最主要的微生物是霉菌、酵母及乳酸菌，川南地區臘肉中微生物數量最多，川東地區最低。四川臘肉中總生物胺含量與微生物趨勢一致。色胺和尸胺是四川臘肉中含量最多的生物胺，都主要存在于瘦肉中(P<0.05)；組胺在肥、瘦肉中均含有(P>0.05)，川北地區臘肉肥肉中組胺含量高于瘦肉；酪胺主要存在于瘦肉中(P<0.05)；腐胺在肥、瘦肉中分布較為均勻(P>0.05)。56種四川臘肉樣品中有27個樣品瘦肉中組胺含量超過100 mg/kg，肥肉中有14個樣品，存在一定的安全隱患。通過Spearman分析得到，菌落總數與瘦肉總生物胺呈顯著正相關(P<0.05)，相關系數為0.28；霉菌和酵母數與瘦肉總胺呈極顯著正相關(P<0.01)，相關系數為0.36。綜上，市售四川臘肉中微生物群落結構與生物胺含量存在一定的相關性，且市售四川臘肉中生物胺含量普遍較高，需要對其進行控制。