丁香醛對釀酒酵母乙醇發酵過程和理化特性的影響

趙雪梅，伍時華，龍秀鋒*，易弋，曾令杰，袁瑞祥

1(廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州，545006)2(廣西糖資源綠色加工重點試驗室，廣西 柳州，545006)

燃料乙醇是以生物質為原料通過微生物發酵產生的，具有環保、清潔、可再生等諸多優點，被認為是最具發展前景的石油替代能源[1]。釀酒酵母(Saccharomycescerevissiae)是生產乙醇最常使用的菌株，在工業上已經形成完整的發酵體系，但在實際發酵過程中，釀酒酵母因受到高溫、高滲、有害物質等多重脅迫的影響，其生長、繁殖與代謝能力會下降，導致糖利用率和乙醇終產量很難達到理論水平[2]。甘蔗糖蜜來源廣泛、價格低廉，含有酵母細胞生長所必須的碳源、氮源、無機鹽等諸多營養物質，是生產乙醇較為理想的經濟類原料[3]。但甘蔗糖蜜中含有大量膠體、灰分、金屬離子、酚類等多種抑制物，其中的酚類化合物丁香醛、阿魏酸、香草醛、丁香酸等[4-5]，會對多種細菌、真菌及酵母產生明顯的抑制作用[6]。

研究表明，酚類化合物可在糖制品如糖漿或糖蜜中存在，有學者運用LC-UV-ESI-MS技術對紅糖提取物中的酚類化合物進行檢測，顯示含有豐富的香草酸、香草醛和丁香醛等多酚化合物[7]。酚類化合物對細胞的毒性作用與其分子質量、疏水性和甲氧基的數目及位置有關，它們可破壞細胞膜的完整性，通過抑制中心碳代謝的關鍵酶、干擾蛋白質合成速率或增加用于修復細胞結構損傷的ATP和NAD(P)H來影響酵母細胞的生長和代謝能力[8]，但這種毒性機制并不適用于所有微生物，其毒性強弱還與微生物自身的結構及代謝有著密切的聯系[9]。

本文選取具有代表性的丁香醛作為實驗對象，通過外源添加不同質量濃度的丁香醛，測定其對釀酒酵母細胞生長的抑制情況；以蔗糖代替甘蔗糖蜜中的可發酵性糖進行乙醇發酵實驗，探究丁香醛對釀酒酵母細胞生長、糖代謝和乙醇代謝的影響，并進一步通過測定丁香醛處理前后酵母細胞膜通透性和胞內丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的變化，結合掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察酵母細胞形態變化、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，FTIR)分析細胞壁和細胞膜結構成分變化，探究丁香醛對釀酒酵母細胞的毒性機理，為實現甘蔗糖蜜高濃度乙醇發酵的生產水平提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種：釀酒酵母(S.cerevisiae)GJ2008由廣西科技大學發酵工程研究所保藏。

培養基：一(二)級種子培養基(g/L)：葡萄糖20(50)，蛋白胨20，酵母浸粉10，pH自然，115 ℃蒸汽滅菌20 min；蔗糖發酵培養基(g/L)：蔗糖250，蛋白胨20，酵母浸粉10，pH自然，121 ℃蒸汽滅菌20 min。

試劑：丁香醛(純度98%)，上海麥克林生化科技有限公司；蔗糖(AR)，南寧糖業股份有限公司；葡萄糖、果糖、戊二醛(AR)，天津市科密歐化學試劑有限公司；二甲基亞砜(AR)，天津市大茂化學試劑廠；三氯乙酸、硫酸(AR)，西隴科學股份有限公司；乙腈、乙醇(GR)，安徽時聯特種溶劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；ZWYR-C2402C疊式恒溫調速搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；HIMAC大容量冷凍離心機，日本株式會社日立制作所；HH系列數顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；賽里安456-GC氣相色譜儀，荷蘭賽里安儀器有限公司；HITACHI高效液相色譜分析儀，日立科學儀器(北京)有限公司；UV-8000S紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Alpha1-2LDplus真空冷凍干燥機，德國CHRIST公司；phenom(飛納)臺式掃描電鏡，復納科學儀器(上海)有限公司；Frontier傅里葉紅外光譜儀，興和儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液制備

將保藏菌株釀酒酵母GJ2008接入一級種子培養基中活化，于搖床150 r/min、30 ℃培養12～14 h；以10%的接種量轉至新鮮一級種子培養基中，培養6～8 h，調整菌懸液濃度為108CFU/mL，備用。

1.3.2 丁香醛對釀酒酵母細胞生長的影響

將種子液以10%接種量接入二級種子培養基中，分別添加不同質量濃度丁香醛(0、0.5、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L)和1 mL的二甲基亞砜作為助溶劑[10]，30 ℃、150 r/min培養，定時取樣，測定菌體在560 nm下的吸光度，以發酵時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.3 蔗糖乙醇發酵過程中糖與乙醇含量的測定

將種子液以10%接種量接至蔗糖發酵培養基中，根據1.3.2中的結果，于發酵培養基中添加1.4 g/L丁香醛，以未添加丁香醛的菌液為對照組，30 ℃、150 r/min 培養36 h，定時取樣，保留上清液，使用高效液相色譜儀和氣相色譜儀檢測糖和乙醇質量濃度。按公式(1)～公式(8)計算糖變化速率、乙醇生成速率等。

高效液相色譜儀測糖條件：色譜柱Alltima 5 μm Amino(250 mm×4.6 mm)，配示差檢測器；流動相為V(純乙腈)∶V(超純水)=75∶25，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL。

氣相色譜儀測乙醇條件：TM-930色譜柱(25 m×0.53 mm×1 μm)，配FID檢測器和液體自動進樣系統；柱溫初始溫度40 ℃，以5 ℃/min的速率升至80 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至150 ℃，總運行15 min，檢測器溫度230 ℃；進樣量0.5 μL；分流比20∶1。

(1)

式中：m為發酵過程中糖減少量，g/L；t為取樣間隔時間，h。

(殘)總糖/(g·L-1)=(殘)果糖+(殘)葡萄糖+(殘)蔗糖×1.05

(2)

式中：1.05為1分子蔗糖(相對分子質量為342)水解為1分子果糖(相對分子質量180)和1分子葡萄糖(相對分子質量180)，1.05=(180+180)/342。

(3)

式中：m為取樣間隔時間內總糖消耗量，g/L；t為取樣間隔時間，h。

(4)

式中：m為取樣間隔時間內乙醇生成量，g/L；t為取樣間隔時間，h。

(5)

式中：m1為蔗糖水解生成的葡萄糖或果糖量，g/L；m2為殘葡萄糖或果糖量，g/L；0.511為糖轉化為醇的最大理論值。

(6)

式中：m1為初總糖量，g/L；m2為殘總糖量，g/L。

(7)

式中：m1為初總糖量，g/L；m2為最終乙醇質量濃度，g/L；0.511為糖轉化為醇的最大理論值。

(8)

式中：m1為初總糖量，g/L；m2為殘總糖量，g/L；m3最終乙醇質量濃度，g/L；0.511為糖轉化為醇的最大理論值。

1.3.4 釀酒酵母細胞形態觀察

將種子液以10%接種量接種到蔗糖發酵培養基中，培養9 h，添加丁香醛使其終質量濃度為1.4 g/L，以未添加丁香醛作為對照組，繼續培養3 h，6 000 r/min、10 min收集菌體，加入2.5%(體積分數)的戊二醛于4 ℃冰箱固定過夜；再以20%、50%、70%、80%、90%、100%(體積分數)的乙醇梯度洗脫，收集菌體進行真空冷凍干燥，噴金，于掃描電子顯微鏡下觀察酵母細胞形態。

1.3.5 核酸和蛋白質的測定

按照1.3.4的細胞培養方法，分別取經丁香醛(0、1.4 g/L)處理0、3、6 h的發酵液，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，于260、280 nm下分別測定核酸和蛋白質的含量。

1.3.6 釀酒酵母胞內MDA含量測定

按照1.3.4的細胞培養方法，分別取經丁香醛處理0、3、6 h的菌體，加入適量10%(質量分數)三氯乙酸提取液和0.6%(質量分數)硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)試劑混勻，于100 ℃水浴煮沸15 min，迅速冷卻后8 000 r/min離心5 min，取上清液測定450、532、600 nm下的吸光度值，以0.6% TBA為空白對照；菌體烘干測定質量，根據公式(9)、公式(10)計算MDA濃度。

MDA濃度/(μmol·L-1)=6.45(A532-A600)-0.56×A450

(9)

(10)

式中：V為提取液量，L；m為樣品質量，g。

1.3.7 FTIR測定

按照1.3.4的細胞培養方法，收集丁香醛處理3 h的菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體3次，進行真空冷凍干燥，將凍干的酵母菌體2 mg與溴化鉀200 mg充分研磨混合均勻，壓片，于FTIR下測定丁香醛處理前后釀酒酵母紅外吸附光譜圖[11]。

1.4 數據統計與分析

以上每個指標都采取3個平行實驗。實驗數據采用單因素方差分析(GraphPad Prism 8.1軟件)進行顯著性分析(P<0.05)，數據圖表由Origin 9.5軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 丁香醛對釀酒酵母細胞生長的影響

通過在二級培養基中外源添加不同濃度的丁香醛，測定釀酒酵母GJ2008生長曲線，探究其對酵母細胞生長的影響，結果見圖1。

圖1 不同質量濃度丁香醛脅迫下釀酒酵母GJ2008生長曲線Fig.1 Growth curves of S.cerevisiae GJ2008 under different concentrations of syringaldehyde

由圖1可知，對照組無明顯延滯期，細胞能快速適應環境進入生長期，在8 h達到穩定期；添加0.5 g/L丁香醛時，酵母細胞生長趨勢與對照組相似，最終OD值略低于對照組；添加1.0、1.2 g/L的丁香醛時，酵母細胞達到穩定期的時間延長2 h；而當丁香醛質量濃度在1.4～2.0 g/L時，細胞生長出現延滯期，到達穩定期時間也由8 h延至10～16 h，最終OD值遠低于對照組。以上結果表明丁香醛會抑制釀酒酵母細胞的生長，且隨著丁香醛濃度的增加，細胞生長受抑制程度逐漸增強。因此，為進一步研究丁香醛對釀酒酵母細胞發酵和理化特性的影響，選取1.4 g/L丁香醛作為酵母細胞的脅迫質量濃度。

2.2 丁香醛對蔗糖乙醇發酵過程中糖代謝和乙醇代謝的影響

2.2.1 丁香醛對蔗糖乙醇發酵過程中糖代謝的影響

探究在丁香醛脅迫下，殘蔗糖、殘葡萄糖與殘果糖的質量濃度和蔗糖水解速率、葡萄糖與果糖消耗速率的變化對了解蔗糖發酵過程的糖代謝規律具有重要意義，結果見圖2。

由圖2可知，SYD與CK相比，發酵過程中殘蔗糖、殘葡萄糖與殘果糖濃度變化趨勢相似，其中殘葡萄糖和殘果糖濃度曲線出現先上升后下降的情況，這跟蔗糖水解生成葡萄糖和果糖的量和同期的消耗量有關。在0～12 h，CK的葡萄糖和果糖消耗速率高于丁香醛處理組，而12～36 h則相反，發酵結束時最終殘葡萄糖和殘果糖濃度相差無幾，但SYD殘葡萄糖和殘果糖達到最高點的時間都比對照組延后了3 h，說明丁香醛影響了糖代謝的中間過程。值得注意的是，CK和SYD有一共同點，最終殘葡萄糖濃度都低于殘果糖濃度，且在0～21 h葡萄糖消耗速率大于果糖消耗速率，21～36 h由于葡萄糖基本消耗完全，果糖消耗速率開始大于葡萄糖消耗速率，產生此現象的原因與發酵過程中酵母細胞己糖跨膜轉運對葡萄糖親和力優于果糖有關[12]。由上述結果可知，在蔗糖乙醇發酵過程中添加1.4 g/L丁香醛雖然對總糖消耗影響不大，但卻會影響糖代謝的中間過程。

a-250 g/L蔗糖乙醇發酵過程中殘蔗糖、殘果糖和殘葡萄糖質量濃度曲線；b-250 g/L蔗糖乙醇發酵過程中蔗糖水解速率、葡萄糖和果糖消耗速率圖2 丁香醛對蔗糖乙醇發酵過程中糖代謝的影響Fig.2 Effects of syringaldehyde on sugar metabolism during ethanol fermentation with sucrose注：CK表示對照組；SYD表示1.4 g/L丁香醛處理組(下同)

2.2.2 丁香醛對蔗糖乙醇發酵過程中細胞生物量、殘總糖和乙醇濃度的影響

在乙醇發酵過程中，細胞生長、總糖消耗和乙醇生成這3個指標是衡量發酵過程好壞的重要因素。根據氣、液相測定的實驗數據以及通過1.3.3公式計算糖和醇的變化速率，繪制曲線如圖3所示。

由圖3可知，SYD與CK相比，最終殘總糖濃度無明顯差異，但OD值和最終乙醇濃度均減少18.65%，說明丁香醛影響了酵母細胞生長和發酵產乙醇的性能。從總糖消耗速率與乙醇生成速率的角度分析，SYD在0～12 h總糖消耗速率低于CK，而12～36 h卻又高于CK，使得最終糖消耗基本相同。SYD乙醇生成速率在0～15 h處于劣勢，雖在15～27 h以微小的優勢略高于CK，但最終乙醇質量濃度(99.81 g/L)遠低于對照組(122.69 g/L)，分析原因是丁香醛滲透到細胞膜內，抑制細胞的生長，減緩了總糖消耗速率，影響了細胞膜作為選擇性屏障及酶基質的功能，使得產乙醇性能顯著降低[13]。以上結果說明，丁香醛抑制了細胞的生長，降低了乙醇生成速率和最終乙醇濃度，使得酵母細胞產乙醇性能下降。

a-250 g/L蔗糖乙醇發酵過程中生物量、殘總糖和乙醇生成曲線；b-250 g/L蔗糖乙醇發酵過程中總糖消耗速率與乙醇生成速率圖3 丁香醛對蔗糖乙醇發酵過程中細胞生物量、殘總糖和乙醇的影響Fig.3 Effects of syringaldehyde on biomass,total residual sugar and ethanol production during ethanol fermentation with sucrose

2.2.3 丁香醛對蔗糖乙醇發酵效果的影響

將氣相色譜儀、高效液相色譜儀測出的乙醇與葡萄糖、果糖、蔗糖數據根據1.3.3的公式計算得到表1。

表1 250 g/L蔗糖乙醇發酵結果Table 1 The results of ethanol fermentation with 250 g/L sucrose

由表1可知，添加1.4 g/L SYD與CK相比，最終乙醇濃度、總糖發酵效率、耗糖發酵效率和糖醇轉化率分別降低了18.65%、17.64%、17.26%、17.26%。酵母細胞消耗的總糖可用于菌體生長、繁殖、代謝產乙醇及其他高級醇等副產物，而本文SYD糖醇轉化率和耗糖發酵效率較低，其原因可能是酵母細胞為應對脅迫環境，發酵產物轉向雜醇油等其他副產物[14]。綜上可知，在蔗糖乙醇發酵過程中外源添加1.4 g/L丁香醛會使最終乙醇生成濃度與糖醇轉化率降低。

2.3 丁香醛對釀酒酵母細胞形態的影響

為探究丁香醛是否會對釀酒酵母的形態造成損傷，本文通過SEM觀察了1.4 g/L丁香醛脅迫下釀酒酵母細胞形態的變化，結果如圖4所示。對照組酵母細胞表面光滑、飽滿，平整、緊湊，沒有出現破裂或孔現象；而丁香醛處理組酵母細胞出現些許空洞、胞間粘連、部分細胞內容物外泄的情況，使得部分細胞受到損傷甚至死亡。

a-對照組；b-丁香醛處理組(3 h)圖4 對照組和丁香醛處理組中釀酒酵母GJ2008的SEM(×8 000)Fig.4 SEM (×8 000) images of S.cerevisiae GJ2008 in control group and syringaldehydes treatment group

2.4 丁香醛對釀酒酵母細胞膜通透性的影響

測定發酵上清液中的OD260值和OD280值不僅可反映核酸和蛋白質的泄漏情況，且可間接反映細胞膜損傷的程度[15]。由圖5可知，酵母細胞經1.4 g/L丁香醛脅迫處理后，其胞內核酸和蛋白質外泄量顯著性增加(P<0.05)，且隨著處理時間的增加，其外泄量就越多；與CK相比，SYD在處理6 h后，核酸和蛋白質外泄量分別增加了56.39%、58.29%。以上結果說明，丁香醛破壞了部分酵母細胞膜的完整性，增大了細胞膜通透性，使得胞內物外泄，影響細胞正常的生理功能。

2.5 丁香醛對釀酒酵母細胞內MDA含量的影響

測定丁香醛脅迫下酵母胞內MDA含量的變化不僅可反映機體內脂質過氧化的程度，還可間接反映細胞受到活性氧(reactive oxygen species,ROS)攻擊后的損傷程度[16]，結果如圖6所示。

圖6 丁香醛脅迫下釀酒酵母GJ2008胞內MDA含量的變化Fig.6 Changes of intracellular MDA content of S.cerevisiae GJ2008 under syringaldehydes stress

由圖6可知，與CK相比，SYD胞內MDA含量顯著性增加(P<0.05)，且隨著處理時間的延長而逐漸增加，結果與2.4中核酸與蛋白質外泄量隨著時間增加而增加呈高度相似性；胞內MDA值在經丁香醛處理3 h和6 h后分別增加了3.47和4.13倍。酵母在正常的生理狀態下，菌體生長迅速，代謝能力強，其體內的抗氧化酶能夠及時的清除氧化代謝產物，但當處于嚴重的脅迫環境時，產生的過多氧自由基會對部分酵母造成氧化損傷，使得過氧化產物MDA含量增加并積累。以上研究結果表明，釀酒酵母在1.4 g/L丁香醛脅迫下會造成細胞膜脂質過氧化反應，MDA含量顯著性增加，胞內自由基過多積累，細胞受損。

2.6 FTIR結果分析

本文采用FTIR間接表征了1.4 g/L丁香醛處理前后釀酒酵母細胞結構中活性基團變化情況，結果如圖7所示。參考相關文獻[17-19]，可將釀酒酵母中主要紅外峰位進行歸屬，如表2所示。

表2 釀酒酵母GJ2008主要紅外峰位可能的歸屬Table 2 The possible attribution of the main infrared peaks of S.cerevisiae GJ2008

由圖7和表2可知，比較對照組和丁香醛處理組釀酒酵母紅外圖譜，沒有出現新的紅外吸收峰，說明釀酒酵母在丁香醛脅迫下仍保持原有的基本化學結構。值得注意的是，在3 500～3 100 cm-1有一個強而寬的吸收峰，這是基團N—H變形振動和分子內或分子間氫鍵O—H伸縮振動產生的，酵母經丁香醛脅迫后，3 355 cm-1處的強寬峰藍移至3 371 cm-1，說明酵母細胞膜上的多糖、脂肪酸及蛋白質的O—H和N—H基團可能發生了變化；在2 928 cm-1處有一較強的吸收峰，這是由三?；视椭兄舅岬腃—H基團的非對稱振動引起的，而丁香醛處理組此基團的吸收峰移至2 933 cm-1，表明脂肪酸的C—H基團發生了位移。綜上，丁香醛通過影響細胞膜上脂肪酸、蛋白質和多糖結構，改變了細胞膜通透性，進而引起部分細胞損傷甚至死亡。

3 結論與討論

釀酒酵母是甘蔗糖蜜乙醇發酵的主體微生物，在將糖轉化成乙醇的過程中會面對各種環境脅迫，酵母也會對脅迫條件做出應答。為揭示發酵過程中丁香醛對釀酒酵母的影響，本研究以耐高糖的優良釀酒酵母GJ2008為出發菌株，250 g/L蔗糖替代甘蔗糖蜜中的可發酵性糖作為發酵體系，考察不同濃度丁香醛對釀酒酵母細胞生長的影響，并系統的探究釀酒酵母在1.4 g/L丁香醛脅迫下的毒性機理。

隨著丁香醛濃度的增大釀酒酵母細胞生長受抑制程度不斷增強。在酵母蔗糖乙醇發酵過程中，丁香醛處理組與對照組糖消耗速率和乙醇生成速率均呈現先升高后下降的趨勢，說明發酵剛開始時，酵母活性較高且營養物質豐富，使得生長代謝速度加快，乙醇生成速率也比較快；而發酵后期，由于發酵液中乙醇和其他副產物含量的增多造成酵母活性降低、乙醇生成速率減慢。值得注意的是，丁香醛處理組與對照組相比，最大乙醇生成速率的發酵時間向后延長了3 h，分析原因是丁香醛可改變細胞膜上蛋白與脂質的比例，干擾離子通道、ATP合成，從而擾亂細胞膜的功能，抑制細胞生長，造成乙醇發酵效率降低、最終乙醇濃度不高等不良現象[20]。此結論與兒茶酚對釀酒酵母細胞發酵過程中糖和乙醇代謝影響的結論相似[21]。研究表明，細胞在外界脅迫下，會改變細胞形態、增大細胞膜通透性、破壞膜流動性與穩定性[22]；同時，會在胞內累積ROS[23]，雖然適量ROS是細胞生長、繁殖所必需的，但是過多的ROS會攻擊膜和蛋白質[24-25]，使細胞質膜發生過氧化反應，引起膜氧化損傷[26]，細胞膜表面上的蛋白質和酶表達系統受到抑制[27]，進而影響細胞正常生長與代謝。而本研究表明釀酒酵母在丁香醛脅迫下，部分細胞發生皺褶、空洞、胞內物外泄，出現胞間粘連在一起的現象；同時，MDA含量的顯著增加和細胞膜脂肪酸、蛋白質、多糖成分中部分基團的改變也證明了丁香醛破壞了酵母細胞膜的完整性，這也從理化特性的角度解釋了糖醇代謝受阻的原因。后期可通過轉錄組學和代謝組學手段進行深層次分析丁香醛對釀酒酵母乙醇發酵的影響機制。

本文通過對丁香醛脅迫下釀酒酵母的生長、發酵過程和理化特性進行研究，揭示了丁香醛對酵母細胞的毒性機理，為后期培育耐受型菌株并提高糖蜜乙醇發酵能力，實現糖蜜高濃度乙醇發酵生產提供了理論基礎。