剪切稀化效應對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

趙磊，夏楊毅,2*，姬雯馨

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400700)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400700)

肉制品在加工過程中經常會受到剪切作用，如絞肉、斬拌、拌料混合、打漿、擠壓等機械剪切，管道輸送過程中的速度梯度剪切等。流體食品受剪切作用后黏度減小，具有剪切稀化效應，多認為是剪切作用打破了體系原有的穩定結構，減少了分子間的相互纏結造成的[1]。剪切稀化現象是可逆的，即當剪切作用取消后，剪切稀化效應會在放置的過程中逐漸減小，這是因為在放置過程中布朗運動使大分子重新恢復到其無取向的自然狀態，被破壞的結構重新形成[2]。

肌原纖維蛋白凝膠是通過蛋白質分子變性聚集、分子間相互作用而形成的[3]，不同程度的剪切稀化效應下，肌原纖維蛋白可能具有不同的凝膠性質。肌原纖維蛋白的凝膠性質直接關系到肉制品的硬度、持水性、咀嚼性等，影響肉制品的口感[4]，凝膠特性受到很多因素的影響，如鹽離子濃度[5]、pH[6]、高靜水壓[7]等，但目前關于剪切稀化效應對肌原纖維蛋白凝膠特性影響的研究還很少。

本實驗將肌原纖維蛋白溶液進行充分剪切(10 000 r/min，5 min)，在獲得一致的剪切稀化效應的基礎上，根據剪切稀化效應隨放置時間延長逐漸減小的特性，通過控制放置時間獲得不同的剪切稀化程度，探究肌原纖維剪切稀化效應對蛋白凝膠特性的影響，以期為肉制品加工參數優化和產品質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉購于永輝超市。

牛血清蛋白，上海麥克林生化科技有限公司；乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)，上海麥克林生化科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TA.XT Plus質構儀，英國Stable Micro System公司；MCR302模塊化旋轉與界面流變儀，德國Anton公司；TGL-16醫用冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；FSH-Ⅱ高速剪切器，江蘇金壇市環宇科學儀器廠；Spectrum 100紅外光譜儀，美國Perkin-Elmer公司；Phenom Pro 掃描電鏡，荷蘭Phenom World 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設計

剪切稀化效應最直觀的體現在流體的黏度變化上，因此本實驗以黏度作為剪切稀化程度的指標，剪切稀化程度越高的溶液黏度越低。將肌原纖維蛋白溶液充分剪切后(10 000 r/min，5 min)，用保鮮膜封裝，在4 ℃ 條件下保存。實驗組通過放置0、12、24、36、48、60和72 h，獲得不同剪切稀化程度，再分別進行凝膠制備和參數測定；對照組每隔12 h進行充分剪切(10 000 r/min，5 min)，在此剪切條件下溶液的黏度處在同一水平，即剪切稀化程度相同，制備凝膠和測定參數，以排除放置過程中無關因素如氧化，水分蒸發等對凝膠的影響。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參照GE等[8]的方法，以雞胸肉為原料，去除多余脂肪和結締組織后攪碎，加入4倍體積的緩沖液A(內含0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2·6H2O，10 mmol/L 乙二醇雙四乙酸，20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0)勻漿(10 000 r/min，1 min)，離心(8 000 r/min，15 min，4 ℃)后去除上清液，重復上述操作3次；將所得沉淀分散于4倍體積的緩沖液B(內含0.1 mol/L NaCl，pH 7.0)勻漿(10 000 r/min，1 min)，離心(8 000 r/min，15 min，4 ℃)后收集沉淀物，重復操作2次；加入4倍體積的緩沖液C(內含0.1 mol/L NaCl，pH 6.0)，勻漿后用4層紗布過濾，離心(8 000 r/min，15 min，4 ℃)，離心后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.3 肌原纖維蛋白熱致凝膠的制備

以牛血清蛋白做標準曲線，雙縮脲法測定蛋白濃度，用緩沖液(內含0.6 mol/L NaCl，20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 6.5)調節蛋白濃度到40 mg/mL，經10 000 r/min剪切5 min后，實驗組和對照組按照以下順序在水浴鍋中煮制凝膠：25 ℃平衡30 min、升溫到75 ℃并加熱30 min、取出冰浴30 min后于4 ℃冰箱中保存。

1.3.4 肌原纖維蛋白流變性質的測定

參照DAI等[9]的方法，使用MCR302模塊化旋轉與界面流變儀進行旋轉測試和溫度掃描。旋轉測試使用PP50探頭，間隙為0.5 mm，剪切速率范圍為0.1～100 s-1。

溫度掃描使用PP50探頭，間隙為1 mm，溫度掃描范圍25～75 ℃，升溫速率1 ℃/min，振蕩頻率1 Hz，應力振幅0.01。

1.3.5 凝膠持水性的測定

將制得的凝膠稱重到離心管中，在8 000×g，4 ℃下離心10 min后，移去多余水分，按照公式(1)計算凝膠的持水性：

(1)

式中：m1，離心管質量，mg；m2，離心前的離心管與凝膠總質量，mg；m3，離心后的離心管與凝膠總質量，mg。

1.3.6 凝膠強度的測定

使用P/0.5模具，測定模板為TPA，觸發類型為Stain，測前、測中、測后速度分別為2、1.0、1.0 mm/s，觸發力5 g，形變40%，凝膠強度定義為穿破凝膠的壓力，單位為g。

1.3.7 凝膠微觀結構的觀察

將制好的肌原纖維蛋白凝膠在2.5%(體積分數)的戊二醛中固定48 h，用磷酸緩沖液(pH 6.5)清洗3次后依次用體積分數為60%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液洗脫30 min進行梯度脫水，用叔丁醇置換3次后冷凍干燥48 h，噴金處理，放大10 000倍觀察凝膠的微觀結構。

1.3.8 凝膠化學作用力的測定

0.5 g凝膠分別與9.5 mL SA溶液(含0.05 mol/L NaCl)、SB溶液(含0.6 mol/L NaCl)、SC溶液(含0.6 mol/L NaCl，1.5 mol/L尿素)、SD溶液(含0.6 mol/L NaCl，8 mol/L尿素)混合，均質(10 000 r/min)3 min后，在4 ℃冰箱內保存3 h后離心(10 000×g，4 ℃，15 min，)以牛血清蛋白做標準曲線，采用福林酚法[10]對上清液的蛋白質含量進行測定。離子鍵、氫鍵、疏水相互作用分別采用SB與SA、SC與SB、SD與SC溶液中蛋白質濃度差表示。

1.3.9 肌原纖維蛋白凝膠二級結構的測定

使用傅里葉紅外光譜儀對肌原纖維蛋白凝膠的二級結構進行測定。凝膠冷凍干燥48 h后用瑪瑙研缽磨成粉末，在全波長400～4 000 cm-1下掃描，測定條件：掃描次數32次，分辨率4 cm-1。使用儀器自帶軟件進行自動基線校正、平滑、標準化處理后，導出數據。各二級結構的定量使用Peakfit 4.12對蛋白質酰胺Ι帶(1 600～1 700 cm-1)進行分析，將導出的數據依次進行基線校正、Gaussian去卷積、二階導數擬合，根據各子峰面積計算α-螺旋(1 650～1 657 cm-1)；β-折疊(1 612～1 640 cm-1)；β-轉角(1 680～1 696 cm-1)；無規則卷曲(1 640～1 650 cm-1)占總二級結構的比例[11]。

1.4 數據分析

實驗重復3次，數據處理采用SPSS Statistics軟件，采用Duncan′s多重比較和顯著性分析(P<0.05)。圖形通過Origin 2018軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 不同放置時間下肌原纖維蛋白剪切稀化程度的變化

圖1中的黏度曲線變化趨勢相同，黏度隨剪切速率增加而減小，表明肌原纖維蛋白溶液具有明顯的剪切稀化特性。對照組中，不同放置時間下的肌原纖維蛋白溶液進行充分剪切后(10 000 r/min，5 min)，黏度在130～165 Pa·s內波動，與實驗組(黏度從139.80 Pa·s增加到845.87 Pa·s)相比變化并不明顯，說明在此剪切條件下(10 000 r/min，5 min)，肌原纖維蛋白溶液的黏度處在同一水平，可以得到一致的剪切稀化程度。

a-實驗組；b-對照組圖1 不同放置時間下肌原纖維蛋白的黏度隨剪切速率的變化Fig.1 Change in viscosity of myofibrillar protein with shear rate under different storage time

實驗組中，肌原纖維蛋白溶液在0～72 h的放置過程中，黏度隨放置時間逐漸增加，分別為139.80、557.80、708.18、761.06、798.72、824.20、845.87 Pa·s，表明剪切稀化程度隨放置時間的延長而逐漸減??；而且黏度隨時間變化的幅度越來越小，當時間從60 h增加到72 h時，黏度不再明顯增加，說明放置72 h的肌原纖維蛋白溶液已經接近零剪切的狀態。

可以從兩方面來解釋剪切稀化效應隨放置時間延長而減小的現象：一是剪切作用破壞了肌原纖維蛋白的網架結構，在放置過程中被破壞的結構重新形成，使黏度上升，剪切稀化程度逐漸減??；另一方面，剪切作用后使散亂的肌原纖維蛋白滾動旋轉而收縮成團，減少了相互的纏結，在放置過程中蛋白質分子重新回到原來的自然狀態，相互勾掛纏結，使黏度上升，剪切稀化效應逐漸減小[2]。

2.2 剪切稀化效應對肌原纖維蛋白儲能模量的影響

儲能模量是指樣品在彈性形變中儲存能量的大小，其數值大小與被測物體的彈性相關[12]。如圖2所示，實驗組和對照組的儲能模量變化趨勢相似：在25～45 ℃儲能模量緩慢增加，因為升溫使肌原纖維蛋白開始熱聚集；在45～60 ℃儲能模量下降，這是由于輕酶解肌球蛋白和肌動球蛋白變性，使流動性增加[13]；在60～75 ℃儲能模量又逐漸增長，是因為高溫使蛋白質劇烈變性，形成更為穩定的網絡結構[14]。

實驗組的剪切稀化程度隨著放置時間的增加而逐漸減小，凝膠的最終儲能模量從75 Pa逐漸增加到375 Pa，而對照組在剪切稀化程度保持不變的情況下，最終儲能模量在60～120 Pa波動，與實驗組相比并未隨放置時間發生明顯變化；這表明是剪切稀化效應的減小導致了肌原纖維蛋白凝膠儲能模量的升高。實驗組中，放置時間長的初始儲能模量高，這可能是因為剪切稀化效應的減小使蛋白質體系結構恢復，彈性增加[15]；在加熱后期放置時間對儲能模量的影響越來越明顯，這可能是因為剪切稀化效應會破壞肌球蛋白和肌動蛋白之間的疏水相互作用和二硫鍵[16]，不利于蛋白質的展開和相互作用，造成了凝膠儲能模量偏低。

a-實驗組；b-對照組圖2 不同放置時間下肌原纖維蛋白的儲能模量隨溫度的變化Fig.2 Change in storage modulus of myofibrillar protein with temperature under different storage time

2.3 剪切稀化效應對肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響

肌原纖維蛋白相互聚集形成網絡結構，并將水分填充在網絡結構中即形成凝膠，良好的凝膠結構可以很好地固定凝膠中的水分[17]，持水性大小可以反映凝膠性能的優劣。凝膠持水性隨放置時間的變化如圖3所示，隨著放置時間延長，實驗組的剪切稀化效應逐漸減小，凝膠的持水性逐漸延長；前36 h內凝膠的持水性變化較為顯著(P<0.05)，而在后36 h的放置條件下，凝膠的持水性雖然在延長，但是變化并不明顯。對照組在剪切稀化效應保持一致的條件下，凝膠持水性并未隨著放置時間的延長發生顯著變化(P<0.05)，實驗組12～72 h放置時間下的凝膠持水性均顯著高于對照組(P<0.05)；這一結果說明是剪切稀化程度的降低造成了凝膠持水性的增加。

圖3 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠持水性的變化Fig.3 Change in water holding capacity of myofibrillar protein gels under different storage time注：字母A，B-實驗組和對照組之間具有顯著差異，字母a～d-實驗組和對照組在組內具有顯著差異；顯著性水平(P<0.05)(下同)

隨著放置時間的延長，剪切稀化程度逐漸減小，肌原纖維蛋白溶液被打破的結構逐漸恢復，使形成的凝膠結構更加穩固，從而促進持水性的增加[17]，這可能是造成持水性隨剪切稀化程度減小而升高的原因。同時持水性還和氫鍵作用[18]相關，有研究表明高強度的剪切會弱化蛋白質的相互作用[19]，而高強度的剪切代表著剪切稀化程度升高，因此可以推斷剪切稀化程度的升高會弱化蛋白質與水的氫鍵作用，從而使凝膠持水性降低。

2.4 剪切稀化效應對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響

肌原纖維蛋白的凝膠強度是影響肉制品加工特性、感官性質的重要因素[20]。肌原纖維蛋白凝膠強度隨放置時間的變化如圖4所示，實驗組中，隨著放置時間的延長，剪切稀化程度逐漸降低；實驗組在前48 h內，每隔12 h凝膠強度均顯著增加(P<0.05)，而在48～72 h，凝膠強度的增加并不顯著(P<0.05)，這與黏度在前面變化明顯，后面變化不明顯的現象相符合。對照組在保持剪切稀化程度一致的情況下，凝膠強度并未隨放置時間而發生顯著變化(P<0.05)，且實驗組12～72 h放置時間下的凝膠強度顯著高于對照組(P<0.05)；這表明是剪切稀化程度的降低導致了凝膠強度的增加。

圖4 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠強度的變化Fig.4 Change in the gel strength of myofibrillar protein gels under different storage time

隨著剪切稀化程度的降低，被打亂的大分子重新恢復到原有的取向，肌原纖維蛋白溶液體系逐漸趨于穩定狀態，這可能會增加肌原纖維蛋白之間的相互作用程度，促進肌原纖維蛋白的聚集，而相互作用和聚集程度的增加有利于形成凝膠的三維結構，使凝膠強度增加[21]。

2.5 剪切稀化效應對肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的影響

凝膠微觀結構隨放置時間的變化如圖5所示。隨著放置時間的延長，實驗組的剪切稀化程度逐漸減小，凝膠的微觀結構逐漸由松散變得緊湊，孔徑尺寸逐漸減小，孔徑分布逐漸變得均勻；在前48 h，凝膠的微觀結構變化較為明顯，當放置時間為60 h時，凝膠的孔徑已經變得細小而密集，放置時間再增加到72 h時，微觀結構較60 h條件下的變化并不明顯，這與凝膠強度和持水性在前期變化明顯，后期變化不明顯的趨勢相同。對照組在保持剪切稀化程度相同的情況下，凝膠的微觀結構不隨放置時間發生顯著變化(P<0.05)，一直有較大且分布不均勻的孔徑，與實驗組中放置時間為0 h條件下的凝膠相似；這表明是剪切稀化效應導致了凝膠微觀結構發生變化，即剪切稀化程度的降低會使凝膠結構變得緊湊，凝膠孔徑變的小而質密，有利于形成嚴密的凝膠結構，這可能是因為隨著放置時間的延長，剪切稀化程度逐漸降低，肌原纖維蛋白體系逐漸向平衡方向發展，蛋白質之間充分作用，使聚集程度增加，分布也更加均勻，形成的微觀結構也更加質密有序。研究表明，凝膠微觀結構越松散粗糙，凝膠的持水性越差，密集且均勻的孔徑可以更好地束縛住凝膠中的水[22]，這與持水性隨放置時間延長而增加的結果一致。

a～g，A～G分別表示實驗組和對照組在放置時間為0、12、24、36、48、60、72 h條件下的凝膠微觀結構圖5 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的變化Fig.5 Micro-structure observation of myofibrillar protein gels under different storage time

2.6 剪切稀化效應對肌原纖維蛋白凝膠化學作用力的影響

由圖6可知，肌原纖維蛋白凝膠的疏水相互作用值明顯要高于氫鍵和離子鍵，這說明疏水相互作用是維持凝膠結構穩定的主要作用力[23]，可能是由于加熱的原因造成氫鍵和離子鍵作用力較小[24]；實驗組的剪切稀化程度隨著放置時間的延長逐漸降低，同時離子鍵、氫鍵和疏水相互作用均逐漸升高；離子鍵和疏水相互作用與凝膠持水性和質構特性的變化趨勢相同，先隨放置時間延長顯著增加(P<0.05)后變化不明顯；氫鍵作用隨放置時間延長持續顯著增加(P<0.05)。對照組的剪切稀化程度不變，與實驗組相比，3種化學作用力不隨放置時間延長發生明顯變化，12～72 h內，實驗組的3種化學作用力均顯著(P<0.05)高于對照組；上述結論說明是剪切稀化程度的降低使肌原纖維蛋白凝膠的離子鍵、氫鍵以及疏水相互作用力升高。

a-離子鍵；b-氫鍵；c-疏水相互作用圖6 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠化學作用力的變化Fig.6 Change in chemical force of myofibrillar protein gels under different storage time

化學作用力是維持蛋白質凝膠結構穩定的重要原因，剪切稀化效應的減小使化學作用力增加，這是凝膠持水性、凝膠強度和儲能模量升高的直接原因[25]。剪切稀化效應的減小伴隨著結構的恢復和蛋白質體系的平衡，這有利于蛋白質充分暴露基團并相互作用，這可能是促使化學作用力增加的原因。

2.7 剪切稀化效應對肌原纖維蛋白凝膠二級結構的影響

如表1所示，在72 h內，實驗組和對照組中α-螺旋和無規則卷曲的含量均未發生顯著變化(P<0.05)，α-螺旋的含量均維持在12%左右，無規則卷曲的含量均維持在21%左右，實驗組和對照組之間無顯著性差異(P<0.05)；α-螺旋和無規則卷曲對加熱較為敏感，長時間的加熱會造成α-螺旋持續向無規則卷曲轉化[26]，本研究中凝膠加熱的條件一致，因此α-螺旋和無規則卷曲含量無明顯變化。

表1 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠各二級結構的相對含量Table 1 Relative content of each secondary structure of myofibrillar protein gels under different storage time

實驗組的剪切稀化程度隨著放置時間的延長逐漸降低，同時β-轉角含量逐漸降低、β-折疊含量逐漸增加；放置時間為36 h時β-折疊含量達到最大值，而后不發生顯著變化(P<0.05)；β-轉角含量在60 h達到最低值，而且從24 h后就沒有發生顯著的變化(P<0.05)；β-折疊和β-轉角變化趨勢相同，在前24 h 內變化顯著(P<0.05)之后變化不明顯。對照組的剪切稀化程度不變，β-折疊、β-轉角的含量也不隨放置時間發生明顯變化；在12～72 h內，實驗組的β-折疊、β-轉角含量與對照組均有顯著差異(P<0.05)。這表明是剪切稀化效應的降低使肌原纖維蛋白凝膠的β-折疊含量增加、β-轉角含量降低。HAN等[27]指出，β-折疊含量的增加有助于凝膠彈性的形成；KANG等[28]的研究表明，β-折疊含量與其持水性正相關；這與本研究中得到的結果一致。剪切稀化效應可能是通過改變凝膠中β-折疊的含量，來影響肌原纖維蛋白凝膠特性。

3 結論與討論

隨著放置時間的延長，實驗組的黏度逐漸增加，剪切稀化效應逐漸減小，肌原纖維蛋白凝膠特性發生了明顯的變化，對照組的黏度處在同一水平，剪切稀化效應不隨放置時間變化，則肌原纖維蛋白的凝膠特性不發生明顯的變化。這表明是剪切稀化效應使肌原纖維蛋白的凝膠特性發生了變化：隨著剪切稀化效應的減小，凝膠的持水性和凝膠強度顯著增加(P<0.05)，儲能模量明顯升高，形成凝膠的結構更加質密，孔徑更加小而密集；對肌原纖維蛋白凝膠化學作用力和二級結構變化的探究表明，剪切稀化效應的降低會使凝膠的離子鍵、氫鍵、疏水相互作用力顯著升高(P<0.05)，β-折疊含量顯著增加(P<0.05)，這可能是造成凝膠持水性，凝膠強度，儲能模量增加，凝膠結構更質密的原因。在凝膠類肉制品的加工過程中，應當考慮剪切稀化效應對產品品質的影響，通過放置一段時間來降低剪切稀化程度，可以提高凝膠的持水性、彈性等，有利于提高產品得率和產品質量。