新疆沙棘飲料與可樂對釉質脫礦的體外實驗研究

陳越，吳澤鈺，王靜，羅甜甜，孫新新，劉奕杉*

1(新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院) 兒童口腔科，新疆 烏魯木齊，830000)2(新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院) 牙體牙髓病科，新疆 烏魯木齊，830000)

酸蝕癥是指酸霧或酸酐作用于牙齒而造成的牙體硬組織的喪失，不涉及微生物[1]。年輕恒牙牙體硬組織礦化程度較成熟恒牙釉質低，萌出約2年才能進一步礦化，因此在牙齒新萌出2年內易發生脫礦[2]。在中國北京的179名年輕人中發現的患病率為46%[3]。有研究得出結論，酸蝕癥可能影響全球約35%的青少年恒牙[4]。臨床研究發現碳酸飲料，尤其是碳酸可樂飲料與酸蝕癥的發生相關。幾項體外研究通過使用不同的參數評估了可樂的脫礦潛力，如pH和緩沖能力、產品與牙齒表面的黏附性、鈣、磷酸鹽和氟化物濃度、牙齒脫礦和磨損；均表明可樂具有較強的脫礦能力[5-8]。特殊飲食，特別是富含水果和其他酸性食物的飲食，會增加牙齒侵蝕的風險[9]。一個國家內的不同地區在飲食和口味上有不同的偏好，其習俗和行為也不同，所有這些因素都會導致酸蝕癥發生率的變化[9]。新疆地處中國西北，作為古絲綢之路上的重要一站，獨特的地理位置及人文環境[10]，使得新疆沙棘汁在當地頗受歡迎，考慮到兒童及青少年是新疆沙棘汁的主要消費者，為了研究沙棘汁對釉質的影響，進一步探討沙棘汁與酸蝕癥之間的關系，本實驗通過在體外將新疆沙棘汁與已知的碳酸飲料(可樂)進行比較，探討其脫礦能力，有利于優化飲食結構，為預防酸蝕癥的發生提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

收集新鮮拔除的牛上頜切牙30顆(同齡牛)，保存在0.1%(質量分數)百里香酚溶液中，置于4 ℃冰箱內保存備用。

主要試劑和儀器：0.1%(質量分數)麝香草酚、去離子水、鈣磷離子檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；人造唾液(去離子水、NaCl、KCL、Na2SO4、NH4Cl、CaCl2·2H2O、NaH2PO4·2H2O、CN2H4O、NaF)(貨號：A7990)，北京索萊寶科技有限公司；顯微硬度儀，Zwick(中國)有限公司;激光共聚焦，徠卡測量儀器(中國)有限公司；掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社。選取市售可口可樂，中糧可口可樂飲料新疆有限公司；新疆沙棘汁(新疆惠華沙棘生物科技有限公司)作為實驗溶液，均購于當地超市。

1.2 樣本制備

流水下用低速打磨機以相同方向將牛切牙的牙冠制備成5 mm×5 mm×2 mm大小釉質塊，在蒸餾水中，依次用800、1 200、2 400目的碳化硅砂紙磨平拋光釉質面，使用超聲清洗機蕩洗8 min。牙釉質面4 mm×4 mm作為暴露中心，其余部分涂布雙層抗酸指甲油覆蓋。去離子水沖洗后存于0.1%(質量分數)溴麝香草酚溶液中備用。

1.3 分組及處理

根據處理溶液的不同分為可樂組、沙棘汁組、去離子水組，每組10個樣本。處理步驟如下所示：(1)將樣本放入15 mL離心管，加入處理溶液(10 mL/樣本)進行脫礦90 s，每天4次(時間為10∶00、12∶00、14∶00、16∶00)，脫礦14 d，脫礦過程中樣本置于恒溫箱中(維持37 ℃以模擬口腔環境)；(2)去離子水沖洗5 s后，其余時間浸入人工唾液(pH 6.8，10 mL/樣本)進行再礦化，不攪拌(模擬口腔靜息狀態時)，樣品在人工唾液中放置過夜，完成24 h的循環。每天更換1次處理溶液及人工唾液。

1.4 表面硬度測量

使用顯微維氏硬度儀測量樣本的硬度。在每個樣本釉質面開窗面測量5個點。在飲料脫礦前、脫礦7 d及脫礦后的14 d使用同樣的方法測定其硬度值。

1.5 pH值及鈣磷離子溶出量測定

實驗溶液均在常溫下開瓶，取10 mL使用pH計測量各實驗溶液的pH值，重復測量3次，取平均值。在脫礦第14天，應用磷鉬酸法檢測處理溶液中的磷離子濃度，鄰甲酚肽絡合銅法檢測鈣離子濃度。各取200 μL處理溶液放入96孔板中，每組重復3次，依據標準溶液濃度計算磷鈣離子濃度。

1.6 掃描電鏡觀察

脫礦前和脫礦后每組隨機各選取2個樣本，以2.5%(體積分數)戊二醛固定1 h，用50%、70%、80%、90%及100%(體積分數)叔丁醇依次進行梯度脫水，每種濃度脫水15 min，隨后掃描電鏡下觀察樣本實驗區釉質表面形態。

1.7 激光共聚焦觀察

隨機選取處理后的樣本，制備3～5片300 μm薄片，每組1個，用羅丹明B溶液避光下放入37 ℃恒溫培養箱染色48 h，觀察脫礦區熒光滲入情況，分析釉質熒光面積(area of the fluorescent lesion，A)、所測區域總熒光量(total fluorescent，TF)、所測區域平均熒光量(average fluorescent of the lesion，AF)數值。

1.8 統計學處理

2 結果與分析

2.1 樣本表面顏色變化

可樂組和沙棘汁組樣本表面失去光澤，見色素沉著，可樂組牙面變為深棕色，從開窗面積中心到周邊，顏色逐漸變深；沙棘汁組牙面為棕褐色，在開窗面積中，顏色分布均勻。在去離子水組觀察到牙面變為白堊色。

2.2 表面顯微硬度

如圖1所示，樣本初始硬度值和各組間初始顯微硬度值無統計學差異；脫礦第7天，去離子水組釉質塊硬度大于可樂組，二者均大于新疆沙棘汁組，組間比較均具有統計學差異；在脫礦第14天，去離子水組硬度值遠大于可樂組和新疆沙棘汁組，組間比較差異具有統計學意義。

A-初始硬度值；B-第7天硬度值；C-第14天硬度值圖1 各組樣本表面顯微維氏硬度值Fig.1 T Vickers hardness value of surface of samples in each group注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001(下同)

2.3 三種飲料pH值及鈣、磷離子濃度情況

如表1所示，沙棘組中鈣離子濃度大于可樂組，二者均大于去離子水組，差異均具有統計學意義(P<0.05)；可樂組中磷離子濃度大于新疆沙棘汁組，二者均大于去離子水組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表1 三種飲料pH值及鈣、磷離子濃度情況Table 1 pH Value and concentration of calcium and phosphorus ions in three beverages

2.4 掃描電鏡觀察結果

可樂組釉質表面見較密集的小凹陷，部分區域連接成片，6 000倍下觀察到釉柱不均勻斷裂；去離子水組樣本其表面結構未發現明顯凹陷，僅見零星小凹陷；新疆沙棘汁組釉質呈蜂窩狀結構，表面凹陷面積連接成片(圖2)。

A、B-去離子水組；C、D-可樂組；E、F-新疆沙棘汁組圖2 各組樣本掃描電鏡圖像Fig.2 Scanning electron microscope images of samples in each group注：A、C、E為3 000倍下圖像；B、D、F為6 000倍下圖像

2.5 激光共聚焦

由表2可知，新疆沙棘汁組A、TF、AF值最大，3組間比較中，新疆沙棘汁組與去離子水組和可樂組的AF值差異具有統計學意義(P<0.01)；且新疆沙棘汁組熒光染料滲透深度連續均勻；可樂組熒光染料不連續，去離子水組中僅見到輕微熒光染料滲入(圖3)；表明新疆沙棘汁脫礦深度強于可樂組及去離子水組。

表2 各組樣本激光共聚焦參數結果Table 2 Confocal laser scanning microscope parameter results for each group of samples

A-去離子水組；B-可樂組；C-新疆沙棘汁組圖3 各組溶液處理后樣本的激光共聚焦圖像Fig.3 Confocal laser images of samples after treatment with each group of solutions注：A、B、C均為100倍下圖像

3 結論與討論

楚金普等[11]通過實驗證實與人牙具有相似化學組成的牛牙很適合代替人牙來檢測脫礦和再礦化的效果，因此本體外研究以牛牙釉質為基質，研究了市售可樂、去離子水和新疆沙棘汁對牙釉質表面的影響。從硬度、鈣磷離子溶出量、釉質表面結構及脫礦深度方面評價了可樂、去離子水和新疆沙棘汁對釉質表面的脫礦影響。

關于表面顯微硬度變化，觀察到隨處理時間的增加，各組釉質塊顯微硬度值均降低，所有測試飲料均具有脫礦能力，其中新疆沙棘汁組硬度值變化最大，數值最低，其次為可樂組。前7 d觀察到最強脫礦效果，在后7 d中的硬度值變化小于前7 d，可以確定釉質硬度值的降低與脫礦時間呈正相關，脫礦速率由快到慢，持續脫礦。此外，3組釉質的表面顯微硬度損失均增加。此外，口腔環境復雜，微生物多樣，實驗所用人工唾液并不能完全模擬口腔微生態環境，人工唾液再礦化效果并不明顯，因此觀察到去離子水組具有一定程度的脫礦能力，后期應設計更為精細的體內實驗進一步驗證。

釉質脫礦涉及棱鏡核prism core(I型脫礦)或棱鏡鞘prisms(Ⅱ型脫礦)，也可以表現出2種類型的脫礦(Ⅲ型脫礦)[17]。最常見的被稱為Ⅰ型脫礦，棱鏡核心材料被優先去除，留下棱鏡外圍相對完整。在Ⅱ型脫礦中，棱鏡的外圍區域被優先去除，留下棱鏡的核心部分相對不受影響。在Ⅲ型脫礦中，其中一些區域與Ⅰ型脫礦和Ⅱ型脫礦相對應，同時還有一些區域的蝕刻模式不能與棱鏡形態相關[18]。釉柱的方向似乎決定了發生的脫礦模式[18]。掃描電鏡分析顯示新疆沙棘汁組表面出現明顯的變化，表面釉柱斷裂，孔隙率大于可樂組及去離子水組；在脫礦最深區域，觀察到釉質表面呈鋸齒狀結構，部分區域形似火山口，大小不等、形狀不同且部分連接成片，很難分辨正常釉質與受累釉質之間的邊界；圖2-E、圖2-F可以看出沙棘汁組為Ⅱ型脫礦。相同處理時間下，可樂組表面觀察到在脫礦累及處釉柱斷裂，部分區域呈蜂窩狀結構，部分連接成片，能分清正常釉質與受累釉質間的邊界，圖2-C、圖2-D中看出可樂組為Ⅲ型脫礦。去離子水組僅見小面積釉柱斷裂。合理推測，沙棘汁組脫礦程度強于可樂組，或許與飲料脫礦類型及牙齒表面存在無定形無棱柱釉質所致。

進行激光共聚焦測量的目的是評估熒光染料滲入釉質的能力，進一步評估不同實驗溶液的脫礦能力。表2可以看出新疆沙棘汁組A、TF、AF值最大，3組間比較中，AF差異具有統計學意義(P<0.01)。新疆沙棘汁引起的釉質表面發生變化，除了與沙棘汁中酸的類型、可滴定酸含量的不同、緩沖能力有關外；還涉及到新疆沙棘汁的提取工藝，新疆沙棘汁的提純工藝有限[19]，在將沙棘果轉為沙棘汁的過程中，植物纖維與果汁未完全分離，沙棘果汁中存在較多植物纖維，比起市售其他果汁，新疆沙棘汁更濃稠，更易黏附在樣本表面，進一步造成牙齒的脫礦。值得注意的是，去離子水組觀察到釉質表面硬度降低，溶液中鈣磷離子濃度升高，且差異具有統計學意義；但從掃描電鏡下觀察，其表面結構未發現明顯凹陷，僅見零星小凹陷。結果與AMORAS等[20]和REDDY等[21]所得結果一致。REDDY等[21]調查了379種市售軟飲料的酸蝕潛力，確定39%具有極強酸蝕性能(pH<3)，54%具有酸蝕性(pH=3～3.99)，僅7%確定為輕微酸蝕性(pH≥4)；普通起泡礦泉水即使其可滴定酸度較低，也具有較低的脫礦能力。眾所周知，唾液的作用可顯著減少因酸蝕而造成的牙齒結構損失，由于獲得性薄膜、動態唾液流動和細菌以及溫度變化的存在，在體外研究中復制口腔狀況存在一些困難。盡管這項體外研究存在局限性，但提示在以后的研究中需要考慮溫度控制、唾液流量、攪拌等因素。

綜上所述，本實驗中3種實驗溶液均具有不同程度脫礦，暴露于實驗溶液的時間越長，脫礦愈嚴重。新疆沙棘汁會造成嚴重的牙釉質脫礦，新疆沙棘汁脫礦能力強于可樂，且去離子水也存在脫礦。這提示需要對家長進行指導，為孩子提供不含過多酸性產物的飲食，有助于進一步優化飲食結構，研究結果為酸蝕癥的早期診斷和預防提供了實驗基礎及理論依據。