基于頂空固相微萃取-氣相色譜-飛行時間質譜聯用技術分析固樣方法對茶葉揮發性成分的影響

李炫燁，陳思，劉毓婕，陳亮，俞曉敏，馬建強*

1(中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州，310008)2(中國農業科學院研究生院，北京，100081)3(福建農林大學園藝植物生物學及代謝組學研究中心，福建 福州，350002)

香氣是衡量茶葉質量的重要指標之一，GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中顯示，香氣因子占綜合得分25%以上。茶葉中的揮發性成分，例如香葉醇、芳樟醇等萜類及衍生物，苯甲醇、苯乙醇等芳香族類化合物，以及水楊酸甲酯、己酸葉醇酯等脂肪酸衍生物等，大多具有較好的香型和較低的閾值，對茶葉香氣風味的形成具有重要作用[1]。但是這些揮發性成分在茶葉樣品制備過程中易受影響，因此選擇合適的固樣方法對于開展茶葉香氣研究至關重要。

目前測定茶葉品質成分常用的固樣方法包括熱風固樣(hot-air drying,HA)、微波固樣(microwave drying,MW)和真空冷凍固樣(vacuum freeze drying,VF) 等[2-3]。項麗慧等[4]比較了真空冷凍、微波和熱風固樣對茶多酚、游離氨基酸和咖啡堿等物質含量的影響，認為微波固樣具有較好的簡便性、保真性和節能性。朱善良[5]的研究表明，微波殺青+烘干的固樣方法更適用于鮮葉生化成分的檢測。龔志華等[6]比較了6種固樣方法對茶多酚、蛋白質、可溶性糖等成分的影響，發現真空冷凍固樣的效果最好。但上述研究都是針對非揮發性成分，而固樣方法對茶葉揮發性成分的影響鮮有報道[7]。

本研究以‘黃旦(HS)’、‘黃奇(HQ)’、‘福鼎大白茶(FD)’和‘尖波黃13號(JBH)’等4個茶樹品種鮮葉為供試材料，采用頂空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)結合氣相色譜-飛行時間質譜技術(gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC-TOF-MS)，對真空冷凍、微波和熱風等3種固樣方法處理的茶葉樣品以及綠茶樣品進行揮發性成分分析，為開展茶葉香氣成分批量檢測和高香茶樹品種選育等工作提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹鮮葉原料來源于浙江省杭州市國家茶樹種質資源圃，2020年10月采摘‘黃旦’、‘黃奇’、‘福鼎大白茶’、和‘尖波黃13號’等4個品種的一芽二葉新稍，使用真空冷凍、微波和熱風等3種固樣方法以及烘青綠茶(green tea,GT)工藝制成茶葉樣品。

1.2 儀器與設備

FD8-3P-GOLD-SIM凍干機，金西盟(北京)儀器有限公司；7890B氣相色譜，美國安捷倫公司；Pegasus HT飛行時間質譜，美國力可公司，G70F23 N1P微波爐，廣東格蘭仕集團有限公司；CHM-901型電熱式碧螺春烘干機，浙江春江茶葉機械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 固樣方法

真空冷凍固樣：鮮葉置于液氮速凍后，使用凍干機在-70 ℃和10 mTorr條件下真空冷凍處理48 h。微波固樣：鮮葉使用微波爐在800 W條件下微波處理7 min。熱風固樣：鮮葉使用碧螺春烘干機120 ℃初烘14 min，然后80 ℃烘至足干。綠茶樣品：鮮葉經攤放(5 h)、殺青(220～280 ℃，1.5～2 min)、揉捻、干燥(初烘120 ℃，復烘80 ℃)等工序制成綠茶樣品。樣品名稱及編號見表1，每個樣品設置3個生物學重復。

表1 樣品名稱及編號Table 1 Sample names and codes

1.3.2 揮發性成分提取與檢測

將茶葉樣品研缽成均勻粉末，稱取1.5 g置于20 mL 頂空瓶中，參考CHEN等[8]方法采用HS-SPME提取揮發性成分，然后使用GC-TOF-MS進行檢測。同時每個樣品取等量進行混合，制成質量控制樣品，在數據采集時每隔5個茶葉樣品加入1個質量控制樣品，以檢測儀器的穩定性。

SPME條件：萃取針PDMS/DVB(美國Supelco公司)，孵化溫度80 ℃，孵化時間30 min，萃取時間30 min，解吸附時間5 min。GC-TOF-MS條件：色譜柱Restek Rxi-5Sil MS capillary column(30 m×0.25 mm×0.25 μm film thickness)，進樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度275 ℃；載氣為氦氣，流速1.5 mL/min；程序升溫為：50 ℃保持5 min，3 ℃/min升至210 ℃保持3 min，15 ℃升至230 ℃保持5 min；不分流進樣；溶劑延遲200 s，掃描范圍30～500 AMU，采集速率10譜圖/s，檢測器電壓1 570 V，EI電離能量 -70 eV，離子源溫度250 ℃。

1.4 數據處理

將質譜數據導入ChromaTof軟件(version 4.51.6，美國LECO公司)，經解卷積、峰對齊后得到揮發性成分的峰面積。根據保留時間和質譜信息，利用標準樣品和NIST 2014(National Institute of Standards and Technology)數據庫的標準質譜圖進行化合物鑒定，以3次生物學重復的平均峰面積代表相對含量。采用SIMCA-P 14.0軟件進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，使用‘悟空’在線分析平臺(https://www.omicsolution.com/wkomics/main/)繪制韋恩圖和熱圖，利用SPSS 18(美國IBM公司)進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 PCA和相關性分析

全部樣品共檢測到1 085個峰，經過數據過濾(剔除質量控制樣品RSD>30%的峰)，共得到341個化合物，導入SIMCA-P 14.0軟件進行PCA。結果顯示，不同固樣方法的樣品可以被很好地區分開，而在相同的固樣方法樣品組中，4個品種樣品間的差異則相對較小。由PCA得分圖可見，PC1(第一主成分)貢獻率為46.4%，PC2(第二主成分)貢獻率為17.7%(圖1)，其中真空冷凍樣品明顯區別于其他3組樣品，微波、熱風和綠茶樣品僅在PC2方向上呈現出一定的分離趨勢，而熱風和綠茶樣品的差異性相對較小。

圖1 四個茶樹品種不同固樣方法和綠茶樣品的揮發性成分PCA分析Fig.1 PCA analysis of total volatiles of green tea and tea leaf samples of four cultivars derived from different drying methods

皮爾遜相關性分析與PCA分析結果類似：相同固樣方法處理的樣品，其揮發性成分的相似性系數最高，而同一品種中的真空冷凍樣品與其他3種樣品的相似性系數最低，并且綠茶樣品與熱風樣品的相似性高于微波樣品(圖2)。上述結果表明，固樣方法會對茶葉的揮發性成分造成較大影響，真空冷凍樣品明顯區別于微波、熱風和綠茶樣品，同時熱風和綠茶樣品比較相似。

圖2 四個茶樹品種不同固樣方法和綠茶樣品的揮發性成分相關性分析Fig.2 Correlation analysis of total volatiles of green tea and tea leaf samples of four cultivars derived from different drying methods

2.2 揮發性成分的定性分析

根據化合物保留時間及質譜信息，通過標準樣品信息比對和NIST數據庫檢索，共鑒定出95種揮發性成分(附表)，按照化合物類型大致可分為七大類(圖3-A)，其中酯類化合物數量最多，共26種，占比27%，隨后依次為烯類18種(19%)、醇類13種(14%)、醛類11種(12%)、酮類9種(9%)、吡咯類及其衍生物6種(6%)，以及其他化合物12種(13%)。

全部樣品中檢測到的共有揮發性成分有44種(附表)，以烯類(27%)最多，其后為醇類(20%)、酯類(16%)、酮類(14%)、醛類(14%)、吡咯類及其衍生物(2%)、以及其他化合物(7%)(圖3-B)。其中相對含量較多的揮發性成分包括：香葉醇、芳香醇及其氧化物、苯甲醇、苯乙醇、檸檬烯、青葉醇、β-羅勒烯、正己醇、丁酸葉醇酯、水楊酸甲酯、己酸葉醇酯、β-紫羅酮、橙花叔醇、α-法呢烯等。這些化合物大多是茶葉的重要香氣成分，這與前人的研究結果基本一致[9-10]。

A-95個揮發性成分；B-44個共有揮發性成分圖3 鑒定出的95個揮發性成分和44個共有揮發性成分的類別和數量百分比Fig.3 Types and percentages of 95 volatiles detected in all samples and 44 common volatiles in each sample

2.3 不同固樣方法茶葉的揮發性成分比較

分析4個品種不同固樣方法樣品的揮發性成分種類差異，結果如圖4所示?！S旦’品種真空冷凍、微波、熱風和綠茶樣品的揮發性成分分別為73、72、70和67種，‘黃奇’為71、71、73和70種、‘福鼎大白茶’ 為80、68、67和70種，‘尖波黃13號’為79、62、66和69種。從數量上看，真空冷凍樣品檢測到的揮發性成分相對較多，而熱風、微波與綠茶樣品大致相當。同時，真空冷凍樣品含有較多的特異揮發性成分，主要包括甲酸葉醇酯、己酸乙酯、水楊酸乙酯等酯類化合物；其次為微波樣品，主要包括2-乙?；量?、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等吡咯類及其衍生物；而熱風和綠茶樣品中的特異揮發性成分相對較少。

將鑒定到的95種揮發性成分進行聚類分析，結果劃分為三個大類(圖5)。Cluster 1主要包括乙酸葉醇酯、香葉醇、苯乙醇、水楊酸甲酯以及芳樟醇及其氧化物等31個化合物，這些成分大都在真空冷凍樣品組中含量較高。Cluster 2包含29個化合物，其中2,2,6-三甲基環己酮、β-環檸檬醛、(-)-α-古蕓烯、檸檬烯、丁酸丁酯、二氫獼猴桃內酯在熱風樣品組中含量較高；而水楊酸-2-乙基己酯、2-甲基四氫呋喃-3-酮、三乙酸甘油酯、棕櫚酸甲酯、二甲基芐基原醇、對薄荷烷在微波樣品組中含量較高。Cluster 3主要包括茉莉酮、α-法呢烯、橙花叔醇、2-甲基丁酸己酯、己酸葉醇酯、β-丁香烯、β-羅勒烯等35個化合物，其含量大都在綠茶樣品組中較高。

圖5 鑒定到的95種揮發性成分聚類熱圖Fig.5 The cluster heat map of 95 volatiles

以每個品種的綠茶樣品為對照，分析不同固樣處理對15個已知的綠茶重要香氣成分[11]含量的影響(表2)，結果發現4個品種的整體變化趨勢基本一致，真空冷凍樣品的香葉醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、乙酸葉醇酯、水楊酸甲酯、正己醇、β-紫羅酮、青葉醇、檸檬烯、苯乙醇等10個揮發性成分含量均高于綠茶樣品；同時，熱風和微波樣品的香葉醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、水楊酸甲酯、青葉醇、苯乙醇、芳樟醇氧化物Ⅱ、丁酸葉醇酯、α-法呢烯、β-羅勒烯等10個揮發性成分含量均低于綠茶樣品。上述結果進一步表明固樣方法對茶葉的揮發性成分具有顯著影響，真空冷凍固樣能較好地保留大多數重要的揮發性成分，而微波和熱風固樣可能導致揮發性成分種類減少和含量大幅變化。

表2 不同固樣方法和綠茶樣品的主要揮發性成分相對含量比較Table 2 Relative content ratios of main volatiles of green tea and tea leaf samples derived from different drying methods

3 討論

香氣是茶葉風味的重要組成部分。近年來高香茶樹品種選育成為茶樹遺傳育種研究的重要方向，但茶葉香氣的影響因素復雜，研究難度較大。準確測定茶葉中的揮發性成分對于開展茶樹種質資源和育種材料的香氣成分鑒定和育種潛力評價等工作至關重要。樣品固定是揮發性成分檢測的重要步驟，本研究利用HS-SPME/GC-TOF-MS技術對4個代表性茶樹品種3種固樣方法及綠茶樣品的揮發性成分進行分析，以評估固樣方法對茶葉揮發性成分組成的影響。研究結果表明不同固樣方法會導致茶葉的揮發性成分種類和含量呈現明顯差異。CHEN等[12]研究發現茶鮮葉中超過20%的揮發性成分在其成品茶葉中低于檢測閾值。本研究中在真空冷凍樣品中檢測到一些特異的揮發性成分，主要是酯類化合物，例如甲酸葉醇酯、己酸乙酯等，推測可能是在微波、熱風處理和綠茶加工時，這些化合物因受熱揮發或轉化而大量損失。同時，大部分重要的香氣成分，例如香葉醇、苯乙醇、芳樟醇及其氧化物等，其含量在微波、熱風和綠茶樣品中比真空冷凍樣品相對較低，這與綠茶加工工藝相關研究的結果一致[13]。

本研究中的真空冷凍固樣方法是在茶鮮葉采摘后立即使用液氮處理以抑制生物酶活性,然后在真空超低溫條件下通過直接升華方式脫去水分，理論上可以較好地保留茶鮮葉中的內源揮發性成分[14-15]。CHEN等[16]比較了茶鮮葉、液氮保存茶鮮葉、以及真空冷凍干燥茶鮮葉的揮發性成分差異，發現真空冷凍干燥處理仍會對揮發性成分組成產生一定影響，其原因可能是在冷凍干燥過程中，一些高揮發性化合物大量損失，以及極少量的物質代謝形成新的化合物。但是在茶樹遺傳育種研究中往往需要進行大批量的樣品分析，如果直接對茶鮮葉或液氮保存茶鮮葉進行揮發性成分測定，因樣品中仍存在大量水分，在樣品保存和前處理方面較為復雜，影響檢測效率。從本研究結果來看，真空冷凍固樣保留了較多的內源揮發性成分，能相對真實地反映茶鮮葉中的揮發性成分組成，因此可作為大批量茶鮮葉內源揮發性成分研究時較優的固樣方法。

熱物理化學作用是影響茶葉香氣成分的重要因素[17-18]。茶葉在高溫烘焙過程中氨基和羰基化合物能通過美拉德反應能形成吡咯類、吡嗪類等雜環化合物[19]。由于茶鮮葉中水分分布不均，在微波固樣時局部過熱，這可能是本研究中微波樣品含有較多特異吡咯類及其衍生物的原因。此外，茶鮮葉采后的酶促反應是另一個影響茶葉香氣成分的重要因素，通過萜類合成代謝和β-亞麻酸代謝能促進萜類和脂肪酸衍生物香氣成分的增加[17]。本研究中綠茶樣品的攤放工序可能是導致其β-羅勒烯、β-丁香烯、β-蓽澄茄烯、丁酸葉醇酯、己酸葉醇酯等揮發性成分含量高于其他樣品的原因，這與WANG等[20]研究結果基本一致。從整體來看，熱風固樣和綠茶樣品的揮發性成分組分是較為相似的。在育種工作中，通常需要耗費大量精力制作茶樣才能進行香氣評價，并且一些稀有種質資源或單株材料，由于鮮葉量有限，制作茶樣較難。因此針對上述情況，可以考慮使用熱風固樣進行鮮葉快速處理和香氣成分鑒定，作為篩選高香綠茶育種材料的初步依據。

對比本研究中的4個品種樣品，發現香葉醇、青葉醇、乙酸葉醇酯、苯甲醇、芳樟醇及其氧化物等是共有的主要揮發性成分，但其含量在不同品種中差異較大，這與前人的研究大體一致[21-22]。2個烏龍茶品種‘黃旦’和‘黃奇’相同固樣方法處理的樣品，其揮發性成分組分較為相似，且萜類化合物含量都較高。其原因可能與它們的親緣關系較近有關，‘黃奇’ 是由‘黃旦’與‘白奇蘭’的自然雜交后代選育而來，而揮發性萜類化合物是烏龍茶品種的核心香氣組分[23]。WANG等[24]通過對‘黃旦’和2個綠茶品種的比較基因組學研究，發現萜類合成酶家族基因的擴增和特異性高表達是‘黃旦’高香氣特征的分子基礎。

綜上所述，真空冷凍、微波和熱風固樣方法會導致茶葉揮發性成分發生不同變化，本研究認為在針對大批量茶鮮葉的揮發性成分分析時真空冷凍可能是普遍適宜的固樣方法，而在育種研究中，熱風固樣可作為育種材料揮發性成分快速鑒定和香氣潛力評估的輔助方法。值得注意的是，本研究中的熱風固樣方法是參考常規的生化茶葉樣品制作方法，未來可以有針對性地開展系統深入研究進行進一步優化。