柱前衍生-超高效液相色譜測定不同品種桑枝中的17種氨基酸的含量

張椿翊，黃小蘭，黃文平，李金金，王森，張曉淵，周濃*

1(重慶三峽學院 生物與食品工程學院，重慶，404120)2(重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶，404120)3(遵義醫科大學 藥學院，貴州 遵義，563000)4(重慶三峽學院 教師教育學院，重慶，404120)

?？浦参锷orusalbaL.是常用的藥食兩用的植物，桑枝為桑的干燥嫩枝，味微苦，性平，歸肝經[1]。桑枝是常用的中藥材，常在春末夏初采收，去葉，曬干，或趁鮮切片后曬干。桑枝始載于《本草圖經》，其中描述桑枝為“桑枝療遍體風癢干燥，兼療口干”；我國古代的其他本草著作中也有許多關于桑枝藥用的典籍，如在《本草再新》中則記載桑枝“壯肺氣，燥濕，滋腎水，通經”；在《本草備要》中記述桑枝“利關節，養津液，行水祛風”[2]。桑枝中含有豐富的生物活性物質，如生物堿類、黃酮類、核苷類，多糖類、揮發油類、氨基酸類[3-5]等。

眾所周知，氨基酸是蛋白質的基本結構單元，是維持人體生命活動的重要營養成分，在人體生理病理過程中起到至關重要的作用，在人體激素以及酶類物質的合成過程中作為原料參與[6]。目前，對于桑枝的研究主要集中在黃酮類以及生物堿類等有效成分上，對于桑枝中氨基酸的研究鮮見報道。目前，氨基酸含量的檢測方法有很多，主要有分光光度計法[7]、氨基酸自動分析儀法[8-10]、液相色譜-質譜串聯法[11-13]、氣相色譜法[14]以及高效液相色譜法[15]，分光光度計法雖然操作簡單方便，但是檢測的氨基酸種類單一，只能檢測單個類別的氨基酸，無法對氨基酸進行分離，具有一定的局限性[7]。氨基酸自動分析儀對氨基酸的測定具有專一性，但是分析時間長，價格昂貴，普及度不高。高效液相色譜法在幾種測定方法中因具有高效、測定時間短、操作簡單易上手、檢測成本較低等特點，在實驗室氨基酸檢測中應用較為普遍。由于氨基酸本身沒有發色基團，沒有紫外吸收和熒光反應，需要對檢測樣品進行衍生化處理將其轉化為具有紫外吸收和發射熒光的物質才能被儀器所檢測到[16]。衍生化又分為柱前衍生和柱后衍生兩種，柱前衍生是將樣品在上機測定前進行衍生化，將氨基酸衍生化成適合超高效液相色譜所能檢測的物質。柱后衍生是樣品經過離子交換柱后分離，將分離后的氨基酸經過衍生化處理以便被儀器檢測。目前柱前衍生以其方便快捷的優勢被普遍使用，常用的衍生試劑有鄰苯二甲醛、丹黃酰氯和異硫氰酸苯酯等[16-17]。

本研究以采自重慶不同區縣的9個采樣點、3個品種共計18批次的桑枝作為樣本，參照黃小蘭等[16]的實驗方法，即異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)柱前衍生，超高效液相色譜(ultra-high performance liquid chromatography，UPLC)法對這18批桑枝中17種氨基酸進行測定，并利用WPS、SPSS 26.0等軟件進行氨基酸含量計算和主成分分析，以此比較出9個采樣點、3個品種共計18批桑枝中氨基酸含量的差異，為桑枝的后期研究及利用提供理論數據依據及參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

桑枝分別采自重慶市不同區縣的9個采樣點、3個品種共計18批次，具體信息見表1。經重慶三峽學院生物與食品工程學院周濃教授鑒定為?？浦参?。將采摘的新鮮桑枝洗凈后切段，置于恒溫鼓風干燥箱中45 ℃烘干至恒重，粉碎后過三號篩，備用。

表1 桑枝采樣地點及品種信息Table 1 Mulberry branch sampling location and variety information

1.2 實驗試劑

鹽酸、苯酚、冰醋酸(均為分析純)，成都科龍化工試劑廠；三乙胺(優級純)，成都科龍化工試劑廠；乙酸鈉(分析純)，天津市光復科技發展有限公司；正己烷(色譜純)，天津市光復科技發展有限公司；PITC(純度≥99%，蛋白測序級)，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈(色譜純)，德國麥克公司；實驗用水，去離子超純水。

氨基酸標準品為17種氨基酸混標，購于壇墨質檢科技股份有限公司，具體信息如下：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys) (批號：BWT30 103-1-C-1，濃度：1.000 mmol/L)。

1.3 儀器與設備

BPG-9240A精密鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；3-30KS高速離心機，德國Sigma；MS 3 BS025渦旋混合器，德國IKA；Biotage Turbovap LV氮吹儀，瑞典Biotage；ME204T/02萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Waters UPLC ACQUITY CLASS UPLC超高效液相色譜儀，美國waters；Milli-Q Advantage A10超純水機，美國Millipore。

1.4 實驗方法

1.4.1 桑枝樣品溶液的配制

1.4.1.1 桑枝樣品的水解

本研究參照國家標準GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定方法》中的測定方法，準確稱取制備好的桑枝樣品粉末0.5 g(精確至0.000 1 g)于水解管中，加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，向水解管中加入苯酚4滴并立即密封。將水解管放入110 ℃的電熱鼓風恒溫干燥箱內水解22 h后，取出，冷卻至室溫。打開水解管后，用純水少量多次的沖洗殘渣并轉移至20 mL容量瓶中,加純水定容，搖勻，離心后取上層桑枝水解液0.4 mL于氮吹管中，并于50 ℃水浴條件下氮吹至近干，加0.4 mL純水復溶，備用。

1.4.1.2 氨基酸的衍生化處理

將1.4.1.1節復溶后的水解液全部轉移至10 mL 離心管中，分別加入0.1 mol/L PITC-乙腈溶液和1.0 mol/L 三乙胺-乙腈溶液各0.2 mL，搖勻，于室溫條件下靜置1 h后，加入正己烷1 mL，渦旋振蕩60 s，6 000 r/min冷凍離心5 min，萃取反應過剩的PITC，棄去上層正己烷，將下層溶液轉移至2 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，經0.22 μm微孔水相濾膜過濾，待上機測定。

1.4.1.3 空白溶液的制備

取鹽酸溶液(0.1 mol/L)0.4 mL置于10 mL離心管中，自“分別加入0.1 mol/L PITC-乙腈溶液和1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液各0.2 mL”起按照“1.4.1.2”進行衍生化處理，即得空白溶液。

1.4.2 標準溶液的配制

取17種混合氨基酸標準品儲備液適量于10 mL離心管中，補充0.1 mol/L的鹽酸至0.4 mL,與樣品同法進行衍生化處理。

1.4.3 儀器方法

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C 18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL；流速：0.2 mL/min；流動相：A為0.05 mol/L乙酸鈉-乙腈(體積比為97∶3)溶液(冰醋酸調pH 6.5)，B為80%的乙腈溶液，梯度洗脫，流動相梯度洗脫比例詳見表2。

表2 梯度洗脫程序表Table 2 Gradient elution program table

1.5 數據處理

2 結果與分析

2.1 系統適用性

取衍生化后的標準品工作液和樣品液，按照“1.4.3”中的儀器方法進行測定。結果表明，衍生化后的17種混合氨基酸標準品和樣品的色譜峰峰形尖銳，分離度良好，如圖1所示?？捎糜谏Ｖ悠分邪被岷康臏y定。

1-天冬氨酸(Asp)；2-谷氨酸(Glu)；3-絲氨酸(Ser)；4-甘氨酸(Gly)；5-組氨酸(His)；6-精氨酸(Arg)；7-蘇氨酸(Thr)；8-丙氨酸(Ala)；9-脯氨酸(Pro)；10-酪氨酸(Tyr)；11-纈氨酸(Val)；12-甲硫氨酸(Mct)；13-半胱氨酸(Cys)；14-異亮氨酸(Ile)；15-亮氨酸(Leu)；16-苯丙氨酸(Phe)；17-賴氨酸(Lys)a-氨基酸標準品UPLC圖譜；b-華桑(S1)UPLC圖譜圖1 氨基酸標準品和華桑(S1)UPLC圖譜Fig.1 UPLC Chromatograms of amino acid standard and Warmulberry (S1)

2.2 氨基酸線性關系

取“1.4.2”中衍生化處理后的標準品系列工作液，過0.22 μm水相濾膜后按照“1.4.3”中的儀器方法進行含量的測定。以各個氨基酸標準品工作液的質量濃度(X)為橫坐標，相應的峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程，17種氨基酸的相關系數為0.997 9～0.999 9，結果表明，17種氨基酸在線性范圍內線性關系良好，結果詳見表3。

表3 17種氨基酸的標準曲線、線性范圍、相關系數、儀器精密度和方法重復性Table 3 Calibration curves,linear ranges,correlation coefficients,instrument precision and method repeatability for amino acids detected by UPLC

2.3 精密度實驗

取同一濃度的混合標準品衍生液，按照“1.4.3”的儀器方法平行測定6次，記錄17種氨基酸的峰面積，結果顯示17種氨基酸峰面積的相對標準偏差RSD在0.06%～1.49%，均<2.00 %，表明儀器精密度良好，可用于本實驗分析。

2.4 重復性實驗

平行稱取6份同一桑枝樣品粉末(S2)0.5 g，按照“1.4.1”進行樣品測試液的制備，制成6份樣品測試液，按照“1.4.3”的儀器方法進行測定，記錄17種氨基酸的峰面積，結果顯示17種氨基酸峰面積對應的相對標準偏差在0.63%～2.75%，表明該方法的重復性較好，可用于桑枝樣品中氨基酸的含量測定。

2.5 穩定性實驗

取同一濃度的混合標準品衍生液，按照“1.4.3”的儀器方法每隔3 h測定1次，結果表明,17種氨基酸在24 h內的相對標準偏差在0.82 %～4.74 %，氨基酸衍生物在24 h內穩定性良好，超過24 h后，個別氨基酸相對標準偏差超過5.00 %，其中半胱氨酸降解較快,由此表明氨基酸的衍生物會隨著時間的推移而發生降解，導致濃度下降。所以為了保證實驗數據的準確性，建議桑枝樣品在完成衍生化后的24 h內測定完畢。

2.6 桑枝中的17種氨基酸的含量測定

將18批桑枝樣品按照“1.4.1”樣品溶液的配制，每批樣品平行3份，按照“1.4.3”中的儀器條件進行氨基酸含量測定，結果見表4。

表4 不同品種桑枝中的氨基酸含量(n=3) 單位：mg/gTable 4 Amino acid content in mulberry branches of different varieties(n=3)

2.6.1 桑枝樣品中氨基酸含量分析

對9個采樣點、3個品種的18批桑枝進行氨基酸含量的檢測后發現，在這18批桑枝樣品中均檢測出17種氨基酸，檢測結果詳見表4，由表得知，桑枝樣品中氨基酸總量(total amino acid,TAA)為41.09～111.70 mg/g，平均含量為64.48 mg/g，18批桑枝樣品在氨基酸總量上存在顯著差異，其中氨基酸總量最多的為巴南區波瀾鎮的雞桑，為111.70 mg/g，其次為萬州區分水鎮的桑，為88.96 mg/g，南岸區黃桷埡鎮的雞桑和奉節柏樹村的雞桑在氨基酸總量上結果相似，分別為74.67 mg/g和74.39 mg/g，氨基酸總量最低的為萬州分水鎮的雞桑，只有41.09 mg/g。桑枝中測得的17種氨基酸中含量最高的為脯氨酸，為5.04～22.38 mg/g，平均含量為10.49 mg/g，占氨基酸總量的16.27%。其次為谷氨酸，含量為4.35～9.68 mg/g，平均含量為6.37 mg/g，占總氨基酸含量的9.88%；17種氨基酸中含量較低的氨基酸為半胱氨酸，含量為0.43～0.47 mg/g，平均含量為0.45 mg/g，僅占總氨基酸含量的0.70%。

桑枝中檢測出7種人體必需氨基酸(essential amino-acid,EAA)，必需氨基酸的總含量在16.88～35.45 mg/g，平均含量為23.53 mg/g。必需氨基酸含量由高到低為亮氨酸>纈氨酸>賴氨酸>異亮氨酸>苯丙氨酸>蘇氨酸>甲硫氨酸，其中最高的亮氨酸平均含量為5.94 mg/g，占必需氨基酸總量高達25.24%，占氨基酸總量9.21%，在17種氨基酸中排第四。最低的甲硫氨酸含量為0.39 mg/g。占必需氨基酸總量的1.66 %，僅占氨基酸總量的0.60%。18批桑枝按必需氨基酸總量由高到低排序為S4、S7、S8、S10、S14、S17、S3、S9、S11、S18、S2、S5、S1、S13、S12、S15、S16、S6。18批桑枝樣品中必需氨基酸總量占氨基酸總量(EAA/TAA)的31.74%～41.07%，平均值為36.92%。必需氨基酸總量與非必需氨基酸總量(EAA/NEAA)的百分比為46.50%～69.69%，平均值為58.70 %。與聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織標準中氨基酸理想模式的規定必需氨基酸與氨基酸總量比值為 40%和必需氨基酸與非必需氨基酸比值為60%[18]相差不大，結果表明桑枝中的氨基酸營養成分分布比較均勻。

18批桑枝中桑有4批，總氨基酸平均含量為63.15 mg/g，其中萬州區分水鎮的最高，為88.96 mg/g，奉節柏樹村的最低，為48.70 mg/g；華桑有5批，總氨基酸平均含量為59.52 mg/g，其中云陽縣雙河鎮的最高，為67.27 mg/g，奉節柏樹村的最低，為50.37 mg/g；雞桑有9批，總氨基酸平均含量為67.84 mg/g，其中巴南區波瀾鎮的最高，為111.70 mg/g，萬州分水鎮的最低，為41.09 mg/g。如表5所示，在這18批桑枝中，桑、雞桑、華桑在17種氨基酸中，精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸這三種氨基酸之間含量存在較大差異，其余氨基酸差異不明顯。結果顯示三種品種桑枝雖然在總氨基酸含量上差別不大，均在60 mg/g左右，但是同一品種間根據采摘的地方不同而有較大的差異，這可能與采摘地的氣候，土壤等有較大關系。

表5 不同品種桑枝氨基酸含量 單位：mg/gTable 5 Amino acid content of mulberry branches of different varieties

桑枝中藥用氨基酸種類豐富，有天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸，總共9種。藥用氨基酸總量在22.98～59.99 mg/g，平均含量為35.58 mg/g，占氨基酸總量的52.09%～61.94%，平均占比為55.21%，桑枝的藥用氨基酸平均值與地參[16]一致。其中谷氨酸和精氨酸是桑枝中的主要藥用氨基酸，分別占藥用氨基酸總量的17.90%和16.81%。其中谷氨酸在人體內可與血氨作用解除人體內的氨毒，能起到保護肝臟的作用[19]。與此同時，谷氨酸在中樞神經中可以作為興奮性的神經遞質來介導神經信號的傳導，能改善記憶和學習功能[20]。精氨酸能增加胰島素的分泌，促進蛋白質的合成，使人體的免疫調節功能間接發揮作用，增強機體免疫功能[21]。所以，桑枝可作為藥用氨基酸的補充劑，也可作為藥用氨基酸提取的原料，增加了氨基酸提取原料的選擇性。

2.6.2 主成分分析

采用SPSS 26.0 軟件對18批桑枝中氨基酸組分進行主成分分析，特征值>1作為提取主成分的標準，從17種氨基酸組分中提取了3個主成分，特征值分別為13.496、1.211、1.097，方差貢獻率為79.388%、7.124%、6.452%,累計貢獻率為79.388%、86.512%、92.964%。結果詳見表6。

表6 主成分分析Table 6 Principal component analysis

將17種氨基酸的含量值標準化后所得到各個主成分的特征值進行開根號，將開根號所得到的值與表7中的系數向量值相乘，根據每個主成分對應的特征值占所提取主成分總特征值之和的比例作為權重得到主成分綜合得分表達式為F=0.795F1+0.071F2+0.067F3,結合方程進行主成分綜合得分計算，結果如表8所示。

表7 主成分系數向量值Table 7 Vectors of principal components

表8 樣品主成分得分和綜合得分Table 8 Principal component scores and comprehensive scores

如表8所示，在第一主成分中，S4的得分最高；在第二主成分中，S13得分最高；在第三主成分中，S5得分最高。綜合得分排序為S4>S7>S8>S14>S10>S17>S9>S11>S3>S2>S18>S5>S13>S1>S12>S15>S16>S6,其中最高的是巴南區波瀾鎮，綜合得分有8.57，最低的為萬州分水鎮，綜合得分為-4.58。表7中的F值表明，這18批桑枝中的氨基酸含量差異明顯。

采用主成分分析法可用于區分不同品種桑枝氨基酸組分含量差異,可為桑枝中氨基酸評價及其開發提供理論基礎。

3 結論與討論

氨基酸作為蛋白質的基本組成單元，在人體中起著十分重要的作用，參與了多個代謝過程以及酶類物質的合成[6]。本試驗采用超高效液相色譜儀法對采自重慶不同區縣的3個品種、18批次桑枝的17種氨基酸含量進行測定，試驗結果顯示，18批桑枝樣品中均檢出17種氨基酸，總氨基酸平均含量為64.48 mg/g，表明桑枝中氨基酸含量較高。試驗還發現，桑枝中藥用氨基酸種類豐富，共含有9種藥用氨基酸，平均總含量在35.58 mg/g，占氨基酸總量的52.09%～61.94%，平均占比55.21%，可用于制作氨基酸類藥物。18批桑枝樣品中必需氨基酸含量占氨基酸總含量的31.74%～41.07%，平均值為36.92%。必需氨基酸總量與非必需氨基酸總量的比值為46.50%～69.69%，平均值為58.70%，與聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織標準中氨基酸理想模式的規定必需氨基酸占氨基酸總量百分比40%和必需氨基酸與非必需氨基酸百分比60%[19]相差不大，表明桑枝中氨基酸成分分布比較均勻。對3個不同品種桑枝進行分析，結果顯示3種品種桑枝雖然在總氨基酸含量上差別不大，均在60 mg/g左右，但同一品種間根據采樣的地域不同而有較大的差異。在這18批桑枝中，桑、雞桑、華桑3個品種中，精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸3種氨基酸含量存在較大差異，其余氨基酸差異不明顯。桑樹在三峽庫區種植面積廣泛，原料獲取成本低。根據藥用氨基酸的不同用量需求，提取氨基酸可選擇不同品種的桑枝原料。