TLR4/NF-κB 通路在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉和不伴鼻息肉的黏膜上皮修復機制中的作用

劉亮亮，文 華，楊 瑾，盧媛媛，王正輝

（1.西安交通大學醫院眼耳鼻咽喉科，陜西 西安 710049；2.西安交通大學醫院公共衛生中心，陜西 西安 710049；3.西安交通大學醫院婦產科，陜西 西安 710049；4.西安交通大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科病院，陜西 西安 710004）

慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP）是臨床上常見的鼻腔、鼻竇炎性病癥慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）的2 個亞型。既往的研究表明CRSwNP 和CRSsNP 在發病機制、治療、預后等方面存在明顯差異[1]；但近來的研究證實[2]，鼻竇黏膜上皮細胞損傷、黏膜脫落是兩者共同的病理學特征改變。Stevens WW 等[3]研究證實，鼻竇黏膜損傷后，上皮細胞自行的異常修復直接導致鼻粘膜組織結構的改變，進而影響鼻竇黏膜組織功能的改變以及鼻竇病變的產生。細胞中的多種蛋白因子或者參與，或者直接調控了上皮細胞損傷后的自行修復。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）能夠刺激上皮細胞的增殖，調控細胞的粘附和遷移在鼻竇黏膜損傷后修復中發揮關鍵性作用[4]。Toll 樣受體4/核轉錄因子-κB（TLR4/NF-κB）通路是廣泛存在細胞內的信號轉導通路，在細胞的增殖與凋亡，損傷與修復、炎性與應激等生理過程中發揮了重要作用[5]。研究表明[6]，細胞損傷后，TLR4/NF-κB通路被激活，驅動炎性細胞因子的大量產生，進而加重炎性反應。Zhang QI 等[7]通過臨床研究證實，TLR4在CRS 的2 個壓型CRSwNP 和CRSsNP 存在表達差異的現象。而TLR4/NF-κB 在CRS 中鼻竇黏膜上皮細胞增殖作用的報道罕見。本研究旨在探討TLR4/NF-κB 信號通路對CRSwNP 和CRSsNP 中鼻竇黏膜上皮細胞增殖的作用，以期為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本 收集2018 年3 月-2021 年9 月就診于西安交通大學附屬醫院耳鼻咽喉科且在鼻內鏡下接受手術治療的30 例患者的鼻篩竇黏膜上皮組織。將CRS 患者標本組分為CRSsNP 組和CRSwNP 組，每組10 例。CRSsNP 組男6 例，女4 例；年齡19～56歲，中位年齡43 歲；CRSwNP 組男7 例，女3 例；年齡22～58 歲，中位年齡45 歲；對照組標本來源于進行視覺性鼻整形術的10 例患者，男5 例，女5 例；年齡22～48 歲，中位年齡44 歲，術中所見均無鼻竇炎癥性疾病。各組患者的性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；且經鼻竇CT 檢測，無支氣管哮喘、糖尿病并發癥、阿司匹林耐受不良、鼻竇真菌或細菌或病毒感染、妊娠、惡性腫瘤以及鼻絨毛不動綜合癥和免疫功能缺陷癥等，所有患者均未首次采用鼻內鏡手術，術前均未曾使用激素或者抗組胺類藥物。本研究中患者的診斷均參照EPOS-2012（2012 歐洲CRS 科研與診斷意見書）的標準進行，對照組患者均無鼻竇炎性病癥。

1.2 細胞及主要試劑和儀器 TLR4/NF-κB 信號通路抑制劑PDTC（美國Selleckchem 公司），多聚甲醛（南京卓普生物科技有限公司），DMEM 培養基（Gibco 公司）；HE 染色劑（Thermo Fisher scientific 公司）；胰蛋白酶（Amersco 公司）；TLR4、NF-κB 抗體（Santa Cruz，CA，USA）；免疫組化試劑盒、CCK-8 試劑盒（Thermo 公司）。CO2細胞培養箱（SHELLAB 公司，美國），細胞培養板（美國Costar 公司），MK3 酶標儀（日本島津公司），超凈工作臺（北京六一儀器廠），LEICA激光共聚焦熒光顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.3 HE 染色鼻黏膜組織病理學觀察 從樣品中取等量的后組篩竇黏膜上皮組織，10%多聚甲醛固定，HE 染色，光學顯微鏡下觀察各組鼻黏膜組織病理學改變情況。

1.4 免疫組化法檢測TLR4 以及NF-κB 的蛋白表達從樣品中取等量的前組篩竇黏膜上皮組織，常規固定包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液中進行修復，以充分暴露抗原決定簇。然后用3%的雙氧水室溫下浸泡10 min，封閉，分別加稀釋好的一抗4 ℃過夜孵育，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加適量二氨基聯苯胺（DAB）作用2～5 min 后用去離子水終止反應，蘇木素復染1.5～2 min，清洗后于乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果；染色評判標準以腫瘤細胞細胞膜和細胞質內出現黃色或棕黃色顆粒為陽性，每個切片隨機取10 個400 倍視野，以100 個細胞為計數單位，按染色面積及細胞被染色強度計分，計分原則如下：染色面積范圍≤10%為0 分，＞10%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞5%～75%為3 分，＞75%為4 分；細胞無染色0 分，弱黃色1 分，黃色染色2 分，棕黃色3 分。若兩者積分之和大于或等于3 分則為陽性，低于3 分則為陰性。切片的結果由腫瘤院病理科兩位醫師雙盲閱片，單獨評分，最后統一匯總，對有爭議的評分需要經病理科兩位以上主任復核修訂，得到最終結果。

1.5 鼻粘膜上皮細胞的提取以及離體培養 從樣品中取等量的中組篩竇黏膜上皮組織，無菌生理鹽水清洗3 次，維持4 ℃置于胰蛋白酶（trypsin，濃度0.25%）和乙二胺四乙酸（EDTA，濃度0.01%）混合液中15～20 h，1000 rpm 離心3 min 去掉上清液，PBS緩沖液沖洗沉淀物3 次，加入200 ml 以3∶1 比例的含10%胎牛血清的DMEM 和Ham's F 的培養液以懸浮細胞，放置于溫度37℃、5%CO2細胞培養箱中常規培養。

1.6 CCK-8 法檢測鼻黏膜上皮細胞的增殖 當細胞單層生長接近完全融合時，將細胞制成單細胞懸液，以1×105個/ml 的濃度接種在96 孔培養板中，置于溫度37 ℃、5%CO2細胞培養箱中24 h 后，分組依次進行CCK-8 實驗。本試驗分為4 組，各組添加等體積的相同濃度的細胞培養液，分別施加以下4 種刺激因素[8]：空白對照組；EGF 組（添加5 ng/ml EGF，劑量50 ml）；TLR4/NF-κB 組（依次添加5 ng/ml TLR4 和NF-κB 培養24 h 后，添加5 ng/ml EGF）；PDTC 組（添加5 ng/ml 信號通路抑制劑PDTC 培養12 h 后，添加5ng/ml TLR4 和NF-κB 培養12 h 后，添加5 ng/ml EGF），37℃，5%CO2生化培養箱中繼續培養4 h，然后每孔加入20 μl CCK-8 溶液后再恒溫孵育5 h，待完全顯色后，100 rpm，10 min，棄掉上清液，Multiskan MK3 酶標儀在450 nm 處檢測吸光值A。

1.7 ELISA 檢測各組鼻黏膜上皮細胞中IL-β、IL-5的表達 調整細胞濃度至1×104個/ml 接種于24 孔板中，分組處理1.6，37 ℃，5%CO2生化培養箱中繼續培養24 h，ELISA 試劑盒檢測各組細胞中IL-β、IL-5 的水平；每個樣本獨立重復測量3 次。

1.8 統計學分析 本研究數據分析采用SPSS 16.0，作圖工具采用Graphpad 5.01，免疫組化結果采用秩和檢驗，3 組樣本間的差異比較采用Kruskal-Wallis分析，兩兩樣本間的比較采用Mann WhitneyU檢驗。不同刺激條件下的結果分析采用方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRS 患者CT 檢查 CRSsNP 和CRSwNP 組典型的實體和CT 檢查見圖1，依照[9]Lund-Mackay 方法進行評分。對兩組患者鼻竇以及其復合體分別評分，正常記為0 分，部分陰影記為1 分，全部陰影記為2分。評分結果顯示，與CRSsNP 組（7.76±4.66）分相比，CRSwNP 組的鼻竇CT 評分為（16.82±8.25）分。從CT 檢查來看CRSwNP 組患者具有更為嚴重的鼻腔、鼻竇黏膜病變。

圖1 典型的CRSsNP 和CRSwNP 實體圖（SP×200）及其對應CT 圖

2.2 HE 鼻黏膜組織病理學觀察 對照組患者的鼻粘膜組織結構完整，假復層柱狀纖毛清晰可辨，纖毛粗細均勻，排列整齊，黏膜下層的纖維結締組織少量分布，黏膜上皮細胞排列均勻，結構完整；CRSsNP 組患者的鼻粘膜組織纖毛紊亂，粗細不一，假復層柱狀和復層鱗狀結構同時存在，上皮細胞基質增厚明顯，細胞間質明顯水腫，大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞浸潤為主，成纖維細胞明顯增多，杯狀細胞數量明顯增多；CRSwNP 組患者的鼻粘膜組織上皮細胞結構不完整，甚至有脫落現象，杯狀細胞數量增多，黏膜基膜增厚，黏膜固有層可見嗜酸性炎性細胞大量浸潤，腺體腫大明顯，數量明顯減少，息肉中無神經結構出現且無新生血管，見圖2。

圖2 HE 染色病理圖片（SP×400）

2.3 免疫組化法檢測TLR4 以及NF-κB 的蛋白表達免疫組化法檢測TLR4 以及NF-κB 的蛋白表達結果見圖3，TLR4 主要在胞膜和胞質內大量表達，鼻黏膜假復層柱狀纖毛上皮中大量分布，染成棕黃色；NF-κB 主要在胞核和胞質內大量表達，鼻黏膜假復層柱狀纖毛上皮以及固有腺體細胞中大量分布。與對照組患者相比，CRSsNP 組、CRSwNP 組患者的鼻粘膜組織中TLR4、NF-κB 的表達量升高（P＜0.05）；與CRSsNP 組患者相比，CRSwNP 組患者的鼻粘膜組織中TLR4、NF-κB 的表達量升高（P＜0.05）。

圖3 免疫組化法檢測TLR4 以及NF-κB 的蛋白表達（SP×400）

2.4 CCK-8 法檢測各組黏膜上皮細胞的增殖活性利用CCK-8 法檢測TLR4/NF-κB 信號通路及抑制劑對鼻黏膜上皮細胞增殖的作用，結果見圖4，與對照組相比，CRS 患者鼻粘膜上皮細胞的增殖基線降低（P＜0.05）；與CRSsNP 組相比，CRSwNP 組患者鼻粘膜上皮細胞的增殖基線升高（P＜0.05）；對照組和CRS 組加入EGF 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞的增殖基線升高（P＜0.05）；加入TLR4 和NFκB 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞的增殖基線降低（P＜0.05），說明加入TLR4 和NF-κB 明顯抑制了EGF 對鼻粘膜上皮細胞的增殖作用；加入PDTC 后，EGF 誘導細胞增殖的作用有所恢復（P＜0.05）。說明TLR4 和NF-κB 抑制了對照組和CRS組鼻粘膜上皮細胞的增殖，但是PDTC 可以減弱這種抑制作用，。

圖4 CCK-8 法檢測各組黏膜上皮細胞的增殖活性

2.5 各組黏膜上皮細胞炎性因子IL-β、IL-5 的表達情況 ELISA 試劑盒檢測各組細胞中IL-β、IL-5 的水平，結果見圖5，與對照組相比，CRS 組患者鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平升高（P＜0.05）；與CRSsNP 組相比，CRSwNP 組患者鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平升高（P＜0.05）；對照組和CRS 組加入EGF 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平降低（P＜0.05）；加入TLR4 和NFκB 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平升高（P＜0.05），說明加入TLR4 和NFκB 明顯激活了鼻粘膜上皮細胞的炎癥作用；加入PDTC 后，鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平明顯有所降低（P＜0.05）。說明TLR4 和NF-κB 明顯激活了鼻粘膜上皮細胞的炎癥作用，但是PDTC 可以減弱這種激活作用。

圖5 ELISA 試劑盒檢測各組細胞中IL-β、1L-5 的水平

3 討論

CRSsNP 和CRSwNP 都是上呼吸道系統炎性疾病，目前關于CRSsNP 和CRSwNP 的發病機制存在變態反應、免疫失衡、微生物膜感染等多種假說[10]，具體發病機制仍未明確。由于兩者在患者主觀感受、臨床表現、組織病理、治療以及預后方面的諸多差異，將兩者同時同步研究的報道較少[11]。近來研究表明[12]，諸多信號通路在CRSsNP 和CRSwNP 的上皮細胞修復中發揮趨勢一致的作用。本研究中亦從CRSsNP 和CRSwNP 兩種疾病的鼻粘膜上皮細胞損傷與修復的角度出發，尋找可以治療CRSsNP 和CRSwNP 兩者的靶向位點。

臨床研究表明[13]，CT 檢查評分以及HE 染色觀察是目前針對CRS 患者病變程度的客觀評價的重要手段。本研究針對CRSsNP 和CRSwNP 的CT 檢查表明，與CRSsNP 組（7.76±4.66）分相比，CRSwNP組的鼻竇CT 評分為（16.82±8.25）分，推斷CRSwNP組患者具有更為嚴重的鼻腔、鼻竇黏膜病變。HE 觀察結果對照組患者的鼻粘膜組織結構完整，CRSsNP組患者鼻粘膜組織纖毛紊亂，以中性粒細胞浸潤為主，成纖維細胞明顯增多，杯狀細胞數量明顯增多，CRSwNP 組患者的鼻粘膜組織杯狀細胞數量增多，黏膜基膜增厚，黏膜固有層可見嗜酸性炎性細胞大量浸潤，腺體腫大明顯，數量明顯減少，息肉中無神經結構出現且無新生血管。因此，推斷CRSwNP 組患者的鼻粘膜病理更為嚴重。

對CRS 的信號通路的研究能更從更深層次的揭示患者的發病機制，推斷基因靶向治療或者更準確的探針診斷。目前炎癥信號通路TLR4/NF-κB 和炎癥因子在CRS 中的作用引起廣泛關注[14]。Hirschberg A 等[15]研究表明上調或者下調TLR4 的表達能明顯CRSsNP 和CRSwNP 患者的發病和治療及預后。Kaczmarek M 等[16]通過臨床研究表明，Toll 樣受體具有靶向治療CRS 的潛力。華麗等[17]報道，抑制TLR4/NF-κB 信號通路能下調炎性遞質的產生和釋放。林甦等[18]研究證實，下調TLR4/NF-κB 信號通路的表達能明顯減輕鼻粘膜的損害，抑制鼻粘膜的炎性反應，改善變應性鼻炎癥狀。但未見有TLR4/NF-κB 通路在鼻粘膜上皮細胞修復中的作用。

本研究中采用CCK-8 法檢測各組鼻粘膜上皮細胞的增殖活性，結果表明對照組和CRS 組加入EGF 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞的增殖基線升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；單獨加入TLR4 和NF-κB 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞的增殖基線降低，差異有統計學意義（P＜0.05），說明加入TLR4 和NF-κB 明顯抑制了EGF 對鼻粘膜上皮細胞的增殖作用；加入PDTC 后，EGF 誘導細胞增值的作用有所恢復，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明TLR4 和NF-κB 抑制了對照組和CRS 組鼻粘膜上皮細胞的增殖，但是PDTC 可以阻斷這種抑制作用。

炎癥性病變是CRS 鼻粘膜上皮中最重要的病理改變。研究顯示[19]，IL-β、IL-5 屬于脂肪蛋白因子，也是黏膜上皮中重要的促炎因子，炎性因子的大量積累能夠介導氧化應激、反饋激活炎癥TLR4/NF-κB信號通路，使上皮細胞的損傷加劇[20]。胡琛等[21]研究表明，活化后的TLR4 能進一步誘導更廣泛的級聯反應激活NF-κB，使NF-κB 發生核移位，轉導信號進入細胞核內，激活更多的細胞內炎癥通路。研究顯示[22]，NF-κB 被激活后，調控更多相關炎癥因子基因的轉錄，調節IL-β、IL-5 等細胞因子的釋放，更進一步放大炎癥反應。本研究中采用ELISA 法檢測炎性因子的表達，結果發現抑制TLR4/NF-κB 信號通路后能降低IL-β、IL-5 的表達（P＜0.05）。

總之，本研究證明TLR4/NF-κB 信號通路影響CRS 中CRSsNP 和CRSwNP 兩者鼻粘膜上皮細胞損傷后的修復，抑制TLR4/NF-κB 信號通路能明顯增強CRS 患者鼻粘膜上皮細胞的增殖作用。但是如何將這其中的作用機制應用到臨床治療CRSsNP 和CRSwNP 兩者上阿托伐他汀還待進一步的研究。