謝明杰,陳穗保
(廣東省第二人民醫院口腔科,廣東 廣州 510317)
口腔癌(oral cancer)是一種世界范圍內的高發病率癌癥,死亡率較高[1-3]。隨著咀嚼檳榔、飲酒和吸煙的人群逐漸增多,口腔癌在多個國家的發病率和死亡率逐年增加[4,5]。因此,通過開發更有效的治療方法來治愈口腔癌至關重要??拱┧幬锱c放療聯合是治療口腔癌的常見策略[6,7]。然而,這種聯合治療通常會對正常組織產生嚴重的副作用,患者依從性和預后較差。表兒茶素(Epicatechin)作為茶多酚中主要的活性單體,藥理作用廣泛,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、預防心血管疾病、改善糖尿病和免疫調節等作用[8-10]。研究表明[11],PI3K/AKT 信號通路對口腔癌細胞增殖、侵襲、抑制凋亡和血管生成均起著重要作用。本研究旨在通過PI3K/AKT 信號通路探討表兒茶素對口腔癌細胞的作用,現報道如下。
1.1 藥物與試劑 表兒茶素,純度>98%,批號:SE8100,購于上海脈鉑醫藥科技有限公司;TNF-α和IL-1β ELISA 試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司;人口腔癌KB 細胞購于中科院上海細胞庫;CCK-8 購于上海碧云天生物技術公司;RPMI-1640 細胞培養液、胎牛血清(FBS)購于美國gibco公司;PI3K 和AKT 單抗和GAPDH 二抗購于英國Abcam 公司。
1.2 主要儀器 DYCZ-24DN 迷你雙垂直電泳儀電泳槽蛋白凝膠電泳儀、WD-9413A 凝膠成像分析系統和WD-9402D 型梯度PCR 儀購于北京六一儀器廠;二氧化碳培養箱購于Thermo Fisher Scientific 公司;SKSW-KC-100 型酶標儀購于北京海富達科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 細胞培養 37 ℃孵育復蘇人口腔癌KB 細胞后,使用1%雙抗RMPI-1640 培養液(含10%FBS),于5% CO2和37 ℃細胞培養箱中常規傳代培養細胞。
1.3.2 細胞增殖抑制率(CCK-8 法)選擇對數生長期的人口腔癌KB 細胞,采用0.25%胰酶-EDTA 消化貼壁細胞,新鮮完全培養基終止反應、1000 rpm離心5 min,稀釋為1×104個細胞,100 μl/孔接種于96 孔板,細胞培養箱靜置培養24 h,分別加入濃度為20、40、80、160 nmol/L 的表兒茶素處理,0 nmol/L 為空白對照組,每組設定6 個復孔。放回細胞培養箱分別再培養24、48、72 h 后,每孔加入10 μl的CCK8 試劑并放回細胞培養箱中孵育3 h,在450 nm 波長處檢測各孔OD 值,分析各組細胞的增殖抑制率。其中,增殖抑制率(%)=[1-OD(λ)藥物處理組/OD(λ)空白對照組]×100%
1.3.3 細胞TNF-α 和IL-1β 水平(ELISA 法)取對數生長期的人口腔癌KB 細胞,稀釋成1×105個后,1 ml/孔接種于24 孔培養板中,繼續在細胞培養箱中培養24 h,分別加入表兒茶素處理,其終濃度分別為20、40、80、160 nmol/L,0 nmol/L 為空白對照組,每組設定6 個重復孔,繼續培養細胞48 h,收集細胞上清,按試劑盒說明書操作步驟,檢測細胞上清TNF-α 和IL-1β 水平。
1.3.4 細胞Bax 和Bcl-2 基因表達水平(RT-PCR法)按1.3.3 方法處理細胞后,PBS 緩沖液沖洗細胞3 次,提取細胞總RNA,使用PCR 儀檢測Bax 和Bcl-2 基因的表達水平。Bax 和Bcl-2 的引物序列見表1。
表1 Bax 和Bcl-2 的引物序列
1.3.5 細胞PI3K 和AKT 蛋白表達水平(Western blot法)按1.3.3 方法處理細胞后,裂解細胞和檢測細胞蛋白。配制電泳凝膠(12%分離膠和5%濃縮膠),每孔30 μg/孔上樣,SDS-PAGE 電泳分離(120 V)、轉膜(80 V)、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入PI3K(1∶1000)和AKT(1∶1000)一抗4 ℃冰箱孵育過夜。洗膜5 次后,加入二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,洗膜5 次,專用儀器自動曝光。分析圖像的灰度值(Image J 軟件)。目的蛋白表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。
1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件分析實驗數據,計量資料以()表示,采用單因素方差分析,組間比較采用LSD-t法,以P<0.05 表示差異有統計學意義。
2.1 各組增殖抑制率比較 表兒茶素處理組24、48、72 h 增殖抑制率高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05);且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L表兒茶素組24、48、72 h 增殖抑制率均高于20 nmol/L表兒茶素組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1。
圖1 表兒茶素對人口腔癌KB 細胞的增殖抑制率的影響
2.2 各組TNF-α 和IL-1β 水平比較 表兒茶素處理組TNF-α 和IL-1β 水平低于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05);且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組TNF-α 和IL-1β 水平低于20 nmol/L 表兒茶素組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。
圖2 表兒茶素對人口腔癌KB 細胞TNF-α 和IL-1β 水平的影響
2.3 各組Bcl-2 和Bax mRNA 表達比較 表兒茶素處理組Bcl-2 mRNA 表達量低于空白對照組,而Bax mRNA 表達量高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05);且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組Bcl-2 mRNA 表達量低于20 nmol/L 表兒茶素組,而Bax mRNA 表達量高于20 nmol/L 表兒茶素組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。
圖3 表兒茶素對人口腔癌KB 細胞Bcl-2 和Bax mRNA 表達的影響
2.4 各組PI3K 和AKT 蛋白表達比較 表兒茶素處理組PI3K 和AKT 蛋白表達水平低于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05);且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組PI3K 和AKT 蛋白表達水平低于20 nmol/L 表兒茶素組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4。
圖4 表兒茶素對人口腔癌KB 細胞PI3K 和AKT 蛋白表達的影響
口腔癌是世界上最常見癌癥之一,其5 年生存率較低,不超過50%[12]??谇话┑闹委煱ㄊ中g、放療、化療和靶向治療等。最常用的化療藥物有5-氟尿嘧啶、卡鉑、順鉑和紫杉醇[13]。然而,耐藥性和副作用大仍然是化療的重要障礙。因此,開發更有效以及更安全的抗口腔癌藥物極為重要。
腫瘤細胞一般呈現出增殖和分化異常的基本特征,如控制腫瘤細胞增殖和分化可作為初步判斷藥物有效性的依據之一[14]。本研究結果顯示,表兒茶素處理組24、48、72 h 增殖抑制率高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05);且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組24、48、72 h 增殖抑制率均高于20 nmol/L 表兒茶素組,差異有統計學意義(P<0.05),提示表兒茶素可明顯抑制人口腔癌KB細胞的增殖,呈濃度和時間依賴性。多種炎癥因子與癌癥的發生發展密切相關。有研究顯示[15,16],高水平的TNF-α 可明顯促進腫瘤惡化,而IL-1β 參與了腫瘤的發生與轉移。本研究結果顯示,表兒茶素處理組TNF-α 和IL-1β 水平低于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05);且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組TNF-α 和IL-1β 水平低于20 nmol/L 表兒茶素組,差異有統計學意義(P<0.05),說明表兒茶素可降低人口腔癌KB 細胞TNF-α 和IL-1β 的水平,提示表兒茶素可能通過抑制炎癥,進而抑制口腔癌細胞的過度增殖。此外,促進異常細胞的凋亡也是抗癌的重要策略,而線粒體凋亡途徑是細胞重要的凋亡途徑,Bcl-2 和Bax 是線粒體凋亡途徑中重要的調控因子[17]。本研究結果表明,表兒茶素處理組Bcl-2 mRNA 表達量低于空白對照組,而Bax mRNA 表達量高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05);且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組Bcl-2 mRNA 表達量低于20 nmol/L 表兒茶素組,而Bax mRNA 表達量高于20 nmol/L 表兒茶素組,差異有統計學意義(P<0.05),說明表兒茶素上調人口腔癌KB 細胞Bax mRNA 的表達水平,而下調Bcl-2 mRNA 的表達水平,呈濃度依賴性,提示表兒茶素可能通過影響線粒體凋亡途徑,促進人口腔癌KB 細胞的凋亡。研究顯示[18-20],PI3K/AKT 信號通路參與調控癌細胞的增殖、分化和侵襲等。本研究結果表明,表兒茶素處理組PI3K 和AKT 蛋白表達水平低于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05);且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組PI3K 和AKT 蛋白表達水平低于20 nmol/L 表兒茶素組,差異有統計學意義(P<0.05),提示表兒茶素通過抑制PI3K/AKT 信號通路PI3K 和AKT 蛋白的表達水平,從而抑制人口腔癌KB 細胞的過度增殖。
綜上所述,表兒茶素可抑制人口腔癌KB 細胞的過度增殖,促進其凋亡,其作用機制可能與抑制PI3K/AKT 信號通路有關。