黃芪對細胞毒素相關蛋白A 誘導的大鼠系膜細胞外基質分泌的影響

陳 越，彭 莉

（1.自貢市第一人民醫院腎內科，四川 自貢 643000；2.成都市第七人民醫院腎內科，四川 成都 610000）

IgA 腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是一組臨床上以反復發作性的肉眼血尿或鏡下血尿為主要表現、病理上表現為腎小球系膜區IgA 沉積或以IgA 沉積為主要特征的原發性腎小球疾病[1]，并以腎小球系膜增生及細胞外基質分泌增加為其基本組織學改變，占我國終末期腎病病因的第1 位，占40%～47.2%[2]。在我國，IgAN 已成為導致慢性腎功能衰竭最主要的腎小球疾病[3]。過度增生與凋亡減少的腎小球系膜細胞均可引起細胞外基質的過度表達和聚積，從而導致腎小球系膜區增寬和基質增生，最終導致腎小球硬化[4，5]。研究表明[6]，細胞毒素相關蛋白A（cytotoxin-associated protein A，CagA）具有促進大鼠腎小球系膜細胞增殖與細胞外基質分泌的作用。在腎病綜合征的中藥治療中，黃芪（Astragalus Membranaceus）因具有活血化淤、益氣補血的作用，而被廣泛應用于多種腎臟疾病的治療中，但其具體分子機制尚未完全闡明[7]?；诖?，本研究通過觀察黃芪對CagA 誘導的大鼠系膜細胞外基質分泌的影響，探討其抑制系膜細胞外基質分泌的作用機制，以期為IgA 腎病的防治研究提供思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 HBZY-1 細胞株（大鼠系膜細胞）：西南醫科大學中心實驗室惠贈；IL-1β（R&D 公司，美國）；幽門螺桿菌CagA 蛋白（上海合星生物科技有限公司）；1640 培養基（Gibco 公司，美國）；黃芪注射液（每安瓿2 ml，2 g/ml，批號0306052）：購自成都地奧九鴻制藥廠；PCR 儀（定量定性分析類，Continuous fluorescence detector：CFD-3220，MJ，美國）；多功能酶標儀（Infinite M200，TECAN，瑞士）；TRIzol（Invitrogen TRIzol，賽默飛，美國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠系膜細胞培養 復蘇系膜細胞基于5%二氧化碳、37 ℃孵箱環境進行培養，細胞培養基為加入滅活FBS（56 ℃滅活）的1640 培養基，并加入終濃度為0.1 mg/ml 的鏈霉素和100 U/ml 的青霉素，采倒置相差顯微鏡觀察細胞生長。

1.2.2 細胞分組 培養的大鼠系膜細胞經充分洗滌后，依據不同干預方法分為4 組：空白對照組、IL-1β 陽性對照組（IL-1β 濃度10 ng/ml）、CagA 實驗組（CagA 濃度4 μg/ml）、CagA+黃芪干預組（加入4 μg/ml 的CagA 和1 mg/ml 的黃芪注射液）。

1.2.3 樣本收集與保存 細胞刺激培養完成后，細胞懸液以1000 rpm 離心5 min，收集上清液，PBS 液洗滌2 次，采用Trizol 法重復離心收集細胞，并采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測提取的mRNA。收集的上清液再次以2500 rpm 離心20 min，上清液置于4 ℃冰箱用于當日酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測，未完成檢測標本上清液及逆轉錄cDNA 置于-70 ℃長期保存。

1.2.4 檢測方法 ①采用ELISA 法檢測收集細胞上清液的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白濃度，采用多功能酶標儀檢測OD 值，利用Curve Expert 軟件繪制標準曲線；再根據標準曲線計算樣品的Ⅰ、Ⅲ型膠原濃度；②采用RT-PCR 法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA 表達，Trizol 法提取細胞RNA，采用RNA 瓊脂糖電泳驗證提取RNA 的完整性，使用超微量分光光度計檢測RNA 濃度、純度，合成引物序列：內參照GAPDH（上游：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′）；ColⅢ（上游：5′-TAAAGGGTGAACGGGGCAGT-3′；5′-ACGTTCCCCATTATGGCCAC-3′）；RT-PCR 反應條件：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環；PCR 產物進行瓊脂糖電泳，采用Image J 軟件分析凝膠電泳條帶。

1.3 統計學方法 應用SPSS 13.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠系膜細胞外基質分泌水平比較 四組CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白濃度比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中IL-1β 陽性對照組、CagA 實驗組系膜細胞外基質濃度高于空白對照組，CagA+黃芪干預組細胞外基質濃度低于CagA 實驗組，見表1。

表1 各組大鼠系膜細胞外基質分泌水平比較（，μg/ml）

表1 各組大鼠系膜細胞外基質分泌水平比較（，μg/ml）

2.2 各組大鼠系膜細胞外基質mRNA 表達水平比較四組CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中IL-1β 陽性對照組、CagA 實驗組系膜細胞外基質mRNA 表達水平高于空白對照組，CagA+黃芪干預組系膜細胞外基質mRNA 表達水平低于CagA 實驗組，見圖1、表2。

圖1 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA 表達比較

表2 各組大鼠系膜細胞外基質mRNA 表達水平比較（）

表2 各組大鼠系膜細胞外基質mRNA 表達水平比較（）

3 討論

IgAN 作為全球范圍內發病率最高的原發性腎小球疾病，同時也是導致終末期腎臟病的主要原因之一[8-11]，其病理學機制主要是以二聚體或多聚體的IgA 為主的免疫復合物在腎小球系膜區沉積[12]。正常情況下，IgA 主要由粘膜組織產生，而在IgAN中，腎外黏膜組織受抗原刺激后，會產生的異常IgA分子并在腎小球系膜區沉積，從而引起和促進了IgA 腎病的發生與發展。黏膜組織的免疫功能紊亂，尤其是扁桃體，目前被較多研究者作為IgA 腎病發病機制研究的重點方向[13]。黏膜免疫功能異常引起如β-1，3半乳糖基轉移酶等糖基化相關酶類及其相關的伴侶蛋白表達降低，以及黏膜淋巴B 細胞產生O-糖鏈糖基化異常的IgA 分子，該異常的IgA 分子沉積在腎小球系膜區，進而導致IgA 腎病的發生與發展[14]。在臨床治療中可以觀察到，扁桃體切除術后，部分IgAN 患者的生活質量、尿檢異常、腎功能惡化的進展均有所改善，這些研究結果均提示扁桃體等黏膜組織可能為IgA 腎病的致病抗原產生場所[15，16]。腎間質纖維化是所有腎臟疾病慢性化的病理表現，也是影響慢性腎臟病預后和導致腎功能損害的主要因素之一。

本研究結果發現，IL-1β 陽性對照組、CagA 實驗組系膜細胞外基質濃度及mRNA 表達水平高于空白對照組（P＜0.05），提示CagA 可以在體外誘導大鼠系膜細胞外基質異常分泌，在蛋白與mRNA 層面均提高了CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達，同IL-1β陽性對照具有相似作用。CagA 作為幽門螺桿菌（Hp）主要的毒力蛋白之一，在消化性潰瘍等胃腸道疾病以及Hp 感染方面發揮關鍵作用，其主要機制為CagA 可以導致胃上皮細胞的破壞、黏膜損傷、組織炎癥甚至腫瘤發生。在Hp 感染與IgAN 的相關研究中，IgAN 患者的腎小球系膜區可見Hp 以及相關的免疫復合物沉積[17]。腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質分泌的增加是IgAN 的基本組織學改變。CagA 具有促進腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質分泌的作用[18]。因此，當腎小球受到炎癥或如同CagA 等因素作用時，可刺激系膜細胞增殖，分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原，致ECM 大量堆積，并分泌多種細胞因子、層粘蛋白等，更進一步介導腎臟免疫、炎癥反應，加重腎臟損傷。

黃芪具有益氣補腎、活血化淤的功效，在臨床治療中有提高血漿白蛋白、減輕腎損害的作用，且藥理學研究表明[19]，黃芪及其黃芪皂苷可以通過各種機制參與對腎臟的保護，但其作用機制尚未完全闡明。黃芪苷Ⅳ可以減少單側輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型的細胞外基質分泌以及炎癥細胞浸潤，并通過TLR4/NF-кB 調控改善腎間質纖維化[20]。黃芪甲苷通過miR-98-5p 抑制小兒IgAN 中半乳糖缺乏的IgA1 分泌，參與對IgAN 的保護作用[21]。在糖尿病腎病中，黃芪可以顯著抑制腎皮質NLRP3、Caspase-1和IL-1β 的表達水平，降低血清腫瘤壞死因子-α 和單核細胞趨化蛋白-1 的水平。在高糖誘導的足細胞中，黃芪顯著提高NLRP3、Pro-Caspase-1 和Caspase-1 的表達水平，表明黃芪可以通過抗NLRP3 炎癥小體介導的炎癥改善了db/db 小鼠的腎功能和足細胞損傷，并延遲了糖尿病腎病的發展[22]。本研究結果發現，CagA+黃芪干預組細胞外基質濃度及mRNA 表達水平低于CagA 實驗組（P＜0.05），提示黃芪干預可抑制CagA 誘導的大鼠系膜細胞外基質的異常分泌，無論從CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白或者mRNA 表達水平都起到了抑制作用。

綜上所述，黃芪或通過降低Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達水平，抑制CagA 誘導異常分泌的大鼠系膜細胞外基質，從而可為臨床上IgAN 的治療提供新思路。本研究尚存在較多不足，黃芪可能通過抑制腎小球系膜細胞外基質增多而減緩IgA 腎病進程，然而，在人體內是否有類似作用還需要進一步通過臨床實驗加以驗證。此外，參與調控黃芪對系膜細胞細胞外基質異常分泌的抑制信號通路需進一步研究。