右美托咪定對心肌缺血再灌注損傷大鼠的作用及機制研究

李曉濱，白建云，趙啟兵

(1.寶雞市中醫醫院麻醉手術科，陜西 寶雞 721001；2.榆林市第三醫院麻醉科，陜西 榆林 719000；3.安康市人民醫院麻醉科，陜西 安康 725029)

一般情況下，缺血心肌組織經血液再灌注后，其結構和功能可得到恢復。缺血患者恢復血液灌注后的這種損傷程度與缺血持續時間、側支循環狀況、需氧量、再灌注狀況密切相關[1]，也可能與需氧自由基爆發、超負荷Ca2+、內皮細胞功能障礙和線粒體損傷等有關[2]。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一種新型α2-腎上腺素能受體激動劑，具有高特異性，臨床上用于鎮靜、鎮痛和抗焦慮，其呼吸抑制比其他鎮靜劑少得多，藥效也很快消失，不會讓患者昏昏欲睡[3]。研究[4]表明，Dex降低了術后心臟相關并發癥的風險，包括心肌缺血再灌注損傷 (Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)和心律失常，顯示出心臟保護作用。研究[5]表明，心臟手術期間使用Dex與較低的術后病死率、較少的并發癥和心臟手術結果的改善相關。此外，動物研究[6]表明，Dex預處理通過抑制炎癥反應來減輕MIRI。因此，Dex可能是治療MIRI的一種有前途的治療藥物。鑒于此，本研究探討Dex對MIRI大鼠的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠36只，體重200～260 g，購自陜西醫藥控股集團生物制品有限公司，許可證號：SYXK(陜)2018-010。所有大鼠均在(24±1)℃、14 h∶10 h光/暗循環(即每24 h光照14 h)下飼養，并自由進食和飲水。

1.2 主要試劑 Dex(國藥準字H20110085)購自江蘇恩華藥業股份有限公司；miR-146a模擬物、miR-146a抑制劑(批號：4464061)購自美國Thermo Fisher公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(批號：C0016)購自上海碧云天生物科技有限公司；Apo DETECT Annexin V-FITC試劑盒(批號：331200)、Ribo PureTMRNA純化試劑盒(批號：AM1924)購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 MIRI模型制備與分組處理 所有大鼠隨機分為對照組、MIRI模型組(MIRI組)和Dex治療組(MIRI+Dex組)，每組12只。MIRI組和MIRI+Dex組的24只大鼠用于建立MIRI模型：將大鼠麻醉后，于第5肋間剪開胸壁，逐層暴露心臟，在大鼠左耳下緣處用6-0縫合線穿入左冠狀動脈前降支，深度約1.5 mm，平穩后收緊結扎線，缺血30 min后再進行灌注3 h。當心電圖ST段顯示弓背向上抬高、心外膜顏色變成灰白色且出現充血、心肌呈紫色后迅速消失，表示建模成功。MIRI+Dex組大鼠腹腔注射50 mg/kg Dex，對照組和MIRI組大鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 心肌細胞培養及轉染 將實際大鼠心臟剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的組織塊，加入10 ml質量分數為0.08%的胰蛋白酶消化8 min后靜置，棄上清。向上清液中加入30%體積DMEM培養基(含15%胎牛血清)以終止消化作用，1200 r/min離心12 min后所得沉淀用約20 ml培養基輕輕吹散，200目孔徑鋼網過濾后移入培養瓶中進行差速貼壁，55 min后取細胞懸液以1000 r/min離心10 min，所得沉淀用培養基(pH 7.2)輕輕吹散。進行細胞計數，以5×108/L密度接種到培養瓶中，37 ℃培養24 h。miR-146a模擬物(5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’)、miR-146a抑制劑(5’-AACCCAUGGAAUUCAGUU-CUCA-3’)和陰性對照(NC，5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’)由上?；蛑扑幒铣晒咎峁?，并根據制造商方案通過LipofectamineTM2000轉染試劑轉染心肌細胞。

1.5 心肌細胞分組 為研究miR-146a在Dex對MIRI大鼠心肌細胞作用中的機制，將細胞分為NC組(對照組大鼠心肌細胞)、抑制劑組(對照組大鼠心肌細胞轉染miR-146a抑制劑)、MIRI+NC組(MIRI組大鼠心肌細胞)、MIRI+抑制劑組(MIRI組大鼠心肌細胞轉染miR-146a抑制劑)、Dex+MIRI+NC組(MIRI+Dex組大鼠心肌細胞)和Dex+MIRI+抑制劑組(MIRI+Dex組大鼠心肌細胞轉染miR-146a抑制劑)。為驗證絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是否參與了Dex對MIRI損傷心肌細胞的作用機制，將心肌細胞分為對照組(僅用培養基處理大鼠心肌細胞)、SB組[p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路抑制劑SB203580，大鼠心肌細胞用0.5 μmol/L SB預處理2 h]、MIRI組(MIRI組大鼠心肌細胞)、MIRI+SB組(MIRI組大鼠心肌細胞用0.5 μmol/L SB預處理2 h)、Dex+MIRI組(MIRI+Dex組大鼠心肌細胞)和Dex+MIRI+SB組(MIRI+Dex組大鼠心肌細胞用0.5 μmol/L SB預處理2 h)。

1.6 LDH、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平測定 培養24 h后，采用LDH檢測試劑盒、脂質過氧化法測定LDH和SOD活性以及MDA水平。收集4.5×106個細胞，加入反應混合物，在37 ℃下孵育，然后在最佳波長處測量光密度(OD)值，所有參數均根據協議設置。

1.7 細胞凋亡率和活性氧(ROS)水平評估 培養24 h后，使用Mito SOXTMRed測定ROS水平：收集每組4.5×106個細胞轉移到裝有0.5 ml完全磷酸鹽緩沖液的試管中，將試管在37 ℃下通過搖動20 min進行孵育，然后用0.5 ml完全磷酸鹽緩沖液(在37 ℃下預熱)洗滌細胞2次，再將細胞懸液加載到流式細胞儀上，檢測ROS水平。使用Apo DETECT Annexin V-FITC 試劑盒檢測細胞凋亡率：收集4.5×106個細胞，加入195 μl Annexin-V結合溶液、6 μl Annexin-V和4 μl碘化丙啶，將細胞在25 ℃下進一步培養20 min，加載到流式細胞儀上以檢測細胞凋亡率。

1.8 定量實時PCR(qPCR)檢測目的基因 使用TRIzol提取心肌細胞總RNA。使用Ribo PureTMRNA純化試劑盒反轉錄RNA。反應體系包含2×SYBER Green master mix 10 μl、cDNA模板1.5 μl、正向引物(10 μmol/L)1 μl、反向引物(10 μmol/L)1 μl和ddH2O 6.5 μl。擴增程序設置為95 ℃ 2 min熱啟動，然后進行40個循環的3步PCR(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s)。引物序列見表1。將mRNA水平標準化為β-actin。目的基因包括葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、下游靶基因C/EBP家族同源蛋白(CHOP)、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、醌氧化還原酶1(NQO1)、過氧化氫酶(CAT)和miR-146a。

表1 各基因引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織miR-146a、氧化應激指標、ERS指標及細胞活力與凋亡水平比較 見表2。MIRI組miR-146a水平、SOD活性和細胞活力低于對照組，LDH活性、MDA水平、GRP78和CHOP水平、細胞凋亡率高于對照組(均P<0.05)。MIRI+Dex組miR-146a表達水平、SOD活性和細胞活力高于MIRI組，LDH活性、MDA水平、GRP78和CHOP水平、細胞凋亡率低于MIRI組(均P<0.05)。推測Dex可能能夠提高miR-146a，并通過下調MIRI損傷的大鼠心肌細胞中的氧化應激和ERS指標，導致細胞活力增加和細胞凋亡率降低。

表2 各組大鼠心肌組織miR-146a、氧化應激指標、ERS指標及細胞活力與凋亡水平比較

2.2 各組大鼠心肌細胞miR-146a mRNA、ROS及細胞活力水平比較 見表3。抑制劑組和MIRI+NC組細胞活力和miR-146a mRNA相對表達量明顯低于NC組，Dex+MIRI+NC組細胞活力和miR-146a mRNA相對表達量高于Dex+MIRI+抑制劑組，而ROS水平表現出相反趨勢(均P<0.05)。表明Dex可能通過上調miR-146a表達來增加MIRI損傷大鼠心肌細胞的細胞活力，氧化應激可能參與了這一機制。

表3 各組大鼠心肌細胞miR-146a mRNA、ROS及細胞活力水平比較

2.3 各組大鼠心肌細胞GRP78、CHOP、CAT、MnSOD、NQO1 mRNA相對表達量比較 見表4。抑制劑組和MIRI+NC組GRP78、CHOP mRNA相對表達量高于NC組，MIRI+NC組低于MIRI+抑制劑組而高于Dex+MIRI+NC組，且Dex+MIRI+抑制劑組高于Dex+MIRI+NC組，而CAT、MnSOD、NQO1 mRNA相對表達量顯示出相反趨勢(均P<0.05)。說明Dex可以通過增加miR-146a表達來抑制MIRI損傷大鼠心肌細胞的ERS和氧化應激，MAPK信號通路可能參與了這一機制。

表4 各組大鼠心肌細胞GRP78、CHOP、CAT、MnSOD、NQO1 mRNA相對表達量比較

2.4 p38 MAPK信號通路抑制劑作用下各組大鼠心肌細胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相對表達量比較 見表5。MIRI組細胞活力低于對照組，但在MIRI+SB組和Dex+MIRI組中升高(均P<0.05)。MIRI組GRP78、CHOP mRNA相對表達量高于對照組，MIRI+SB和Dex+MIRI組則低于MIRI組(均P<0.05)。但Dex+MIRI+SB組GRP78 mRNA相對表達量低于Dex+MIRI組，CHOP mRNA相對表達量高于Dex+MIRI組(均P<0.05)。

表5 p38 MAPK信號通路抑制劑作用下各組大鼠心肌細胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相對表達量比較

2.5 miR-146a抑制劑和SB預處理2 h后各組大鼠心肌細胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相對表達量比較 見表6。抑制劑組細胞活力低于NC組，而抑制劑+SB組細胞活力高于抑制劑組(均P<0.05)。抑制劑組CHOP、GRP78 mRNA相對表達量高于NC組和抑制劑+SB組(均P<0.05)。抑制劑+SB組GRP78、CHOP mRNA相對表達量低于抑制劑(均P<0.05)。由此可知，Dex可能會增加miR-146a表達并進一步使MAPK信號通路失活，從而抑制細胞外信號調節激酶活化和ERS，促進MIRI損傷大鼠心肌細胞的細胞活力。

表6 miR-146a抑制劑和SB預處理2 h后各組大鼠心肌細胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相對表達量比較

3 討 論

臨床將患者冠狀動脈部分或者完全急性梗阻后于一定時間內重新獲得再通時缺血心肌恢復正常灌注但其組織損傷出現加重的病理過程稱為心肌缺血后再灌注損傷。該疾病嚴重影響患者生命健康，甚至會導致其死亡，預防心肌缺血后再灌注損傷的發生是臨床一直致力解決的問題。本研究探究了Dex在MIRI損傷大鼠模型中的作用，進一步揭示了miR-146a、ERS、氧化應激和MAPK信號通路是關鍵調節劑，Dex可以通過這些調節劑調節MIRI損傷大鼠心肌細胞活力或凋亡。因此，在本研究中發現的機制可能是支持性證據，表明Dex在治療MIRI損傷中的有效性。

Gao等[7]研究發現，Dex可以防止MIRI誘導的心肌細胞損傷和炎癥，從而提高細胞存活率。因此，Dex、miR-146a和細胞生長間可能存在聯系。本研究發現，MIRI+Dex組細胞活力、SOD活性和miR-146a相對表達量高于MIRI組，LDH活性、MDA水平、GRP78和CHOP表達、細胞凋亡率均低于MIRI組。其中，SOD、MDA和LDH是評價抗氧化系統狀態的標志物，而GRP78和CHOP被視為ERS指標[8-9]。提示Dex可能會提高miR-146a，并通過下調MIRI損傷大鼠心肌細胞的氧化應激和ERS，導致細胞活力增加和細胞凋亡率降低。研究[10-12]表明，ERS參與了MIRI進程，抑制ERS可以減輕MIRI對心肌細胞的損傷。還有報道稱ERS能夠引發氧化應激并破壞線粒體功能，導致CHOP依賴性細胞死亡。研究[13-14]顯示，Dex通過抑制NLRC5缺陷小鼠炎癥和氧化應激來防止肝臟缺血/再灌注損傷，通過抑制氧化應激和炎癥反應來減輕對大鼠大腦的缺血/再灌注損傷。因此，可假設Dex可以提高miR-146a表達，從而下調ERS和氧化應激，導致細胞活力增加和細胞凋亡降低。據報道[15-16]，Dex通過α2-腎上腺素受體依賴性抑制氧化應激來減輕原位肝移植引起的急性腸道損傷。因此，Dex可通過α2-腎上腺素受體刺激MAPK信號通路，從而減輕心肌細胞的MIRI損傷。此外，通過探討Dex對MIRI損傷大鼠心肌細胞在抑制miR-146a后的影響發現，細胞活力和miR-146a、CAT、MnSOD和NQO1的表達降低，而細胞凋亡率、使用miR-146a 抑制劑和Dex后的ROS水平、GRP78和CHOP表達增加，表明miR-146a在Dex對細胞活力、細胞凋亡、氧化應激和ERS的影響中起關鍵作用[17-18]。在MIRI損傷大鼠心肌細胞中使用SB與Dex組合不會增加細胞活力，但會進一步降低Dex降低的GRP78和CHOP表達。將SB與miR-146a抑制劑一起使用能夠增加被miR-146a抑制劑降低的細胞活力，并且在心肌細胞中GRP78和CHOP表達被miR-146a抑制劑降低。鑒于這些事實，推測Dex可以通過miR-146a影響ERS，從而影響細胞活力，這在一定程度上依賴于MAPK信號通路。

綜上所述，Dex可能通過調節miR-146a表達，進一步調節ERS和氧化應激，最終通過MAPK信號通路影響MIRI損傷大鼠心肌細胞的細胞活力和凋亡。然而，這項研究存在一定局限性，由于α2-腎上腺素受體在心室肌細胞中表達不高，在進一步實驗之前檢測心肌細胞中α2-腎上腺素受體表達可使研究更有說服力。Dex是一種新型的α2-腎上腺素受體激動劑，膜內受體表達的改變會影響Dex的作用，因此應進一步探討MIRI損傷后受體表達的變化[19]。此外，SB部分逆轉了miR-146a抑制劑對細胞活性、GRP78和CHOP的影響[20]。