基于網絡藥理學和分子對接探討桑枝改善高尿酸血癥的作用機制

阮仕洋，陳 慧，曾凡麗，廖尚高,2,3，羅喜榮,

（1.貴州醫科大學藥學院，貴州貴陽 550025；2.貴州醫科大學藥學院/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心/貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽 550004）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）作為一種常見的代謝性疾病，主要是由于嘌呤在代謝過程中發生異常所致，體外嘌呤攝入過多、內源性嘌呤生產過剩以及嘌呤排泄不及時等都是誘發高尿酸血癥的關鍵因素。根據發病過程中機制的差異性，可將其劃分為原發性HUA 和繼發性HUA 兩大類型，由基因突變引起的多為原發性HUA，為遺傳性類；由藥物使用或腎臟等疾病誘導的多為繼發性HUA。許多研究證明血清尿酸（UA）的升高已成為與疾病密切相關的獨立危險因子，如痛風、糖尿病、心血管方面疾病、高血壓和腎臟方面慢性疾病等。臨床上，降低血清尿酸常作為防治HUA 的措施，目前常用抑制尿酸生成藥、改善尿酸排泄藥、尿酸酶合成劑和堿化尿液藥等4 類藥物治療HUA，但治療過程中副作用較為明顯，臨床應用受到了限制。近年來傳統中藥成為研究熱點，主要由于其在療效突出的同時，兼具安全性高及多靶點治療的特性，所以在調節尿酸水平及發揮抗炎作用方面的優勢是西醫無法替代的。

桑枝（L.）又名桑條，通常為桑樹干燥嫩枝的統稱，其藥性平和，味略苦澀，歸于肝經，具有祛除風濕、改善關節等功效，常用于治療關節炎及風濕病等。據2022 年發布的藥食同源最新目錄，桑枝被收錄于可用于保健食品的物品名單中，表明桑枝可作為保健食品的原料，具有較大的開發及應用前景。此外，桑枝治療痛風痹證歷史悠久，《蒼生司命》中已有記載；陳寶剛等及高忠恩等在整理及論述總結傳統醫籍治療名方時，該功效也被論證。此外，研究表明，桑枝提取物能有效控制黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性，從而降低HUA 模型小鼠的血清尿酸水平。近年來中藥研究領域，網絡藥理學被廣泛應用，作為建立在系統生物學理論基礎上的一門新技術，網絡藥理學主要闡述藥物相互作用機制，特性主要包括“整體性”與“系統性”，通過從整體角度揭示藥物的作用機制，與中藥治療具有一致性，同時中醫的整體觀念也是如此，兩者之間不謀而合。結合現有研究報道及實驗室前期工作基礎，可知桑枝具有抗HUA 作用，但發揮防治作用的藥效物質及作用方式缺少整體認識。因此，本實驗采取網絡藥理學這一新技術來探討桑枝治療HUA 的藥效組分及作用靶點，以期為桑枝后續開發及臨床研究給予方向及思路。

1 實驗方法

1.1 桑枝組分及靶點建立

以“桑枝”、“Sangzhi”、“mulberry twig”為檢索詞，于TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php/）、Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、CNKI（https://www.cnki.net/）等數據庫平臺進行檢索，獲取桑枝組分群，TCMSP 平臺中口服生物利用度（Oral bioavailability）和類藥性（Drug-like）及SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數據庫中的Pharmacokinetics 和Druglikeness 等中藥體內ADME 相關指標參考程歡歡等進行，借助Swiss-TargetPrediction 及PharmMapper（http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/）在線平臺檢索組分靶點，去除重復值，建立桑枝組分靶點庫。

1.2 HUA 靶點獲取

于 GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://omim.org/）平臺，以“Hyperuricemia”、“Gout”等為檢索關鍵詞，獲取HUA 靶點；借助UniProt（https://www.uniprot.org/）數據庫，設定物種類型為“Homo sapiens”，得到靶點名稱并去重，建立疾病靶點庫。

1.3 關鍵靶點獲取

分別將“1.1”和“1.2”項下的靶點輸入在線平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作靶點韋恩圖，獲取關鍵靶點。

1.4 蛋白互作網絡圖（PPI）建立

參照王佰靈等將“1.3”項下靶點導入到STRING（https://string-db.org/）在線平臺分析，并將結果導入到Cytoscape 3.8.2 平臺展開網絡拓撲學過程分析，篩選桑枝核心靶點。

1.5 關鍵靶點富集分析

將關鍵靶點借助DAVID（https://david.abcc.ncifcrf.gov/）平臺進行GO 功能注釋及KEGG 富集分析（0.01），限定物種類型為“Homo sapiens”，并將結果可視化。

1.6 “化合物-靶點-通路”網絡圖建立

利用Cytoscape 軟件平臺獲取“化合物-靶點-通路”關系網絡圖，圖中節點代表化合物、靶點、通路，邊表示彼此之間的交互關系。

1.7 核心靶點晶體結構獲取及處理

于PDB（https://www1.rcsb.org/）平臺獲取核心靶點對應的晶體結構，借助Discovery Studio 3.5 平臺去除受體原配體和水分子、添加氫原子、檢測扭轉中心和扭轉鍵等，并尋找活性口袋。

1.8 分子對接

采用AutoDock Vina 1.1.2 軟件平臺將核心靶點分別與活性組分及對照藥（非布司他）進行分子對接驗證，對網絡分析可靠性加以評價，并將結果可視化。

2 結果與分析

2.1 桑枝組分及靶點

從數據庫及文獻挖掘共檢索到桑枝化合物156 個，首先依次將156 個化合物按“1.1”項進行ADME篩選，其次采取SwissTargetPrediction 及PharmMapper 在線平臺對符合ADME 篩選條件的化合物進行靶點預測，其中PharmMapper 平臺以Normalized Fit Score≥0.7 為遴選條件，SwissTarget-Prediction 平臺以Probability≥0 為遴選條件，然后將每個化合物分別在兩個平臺中預測所得的靶點進行匯總并去重，得到每個化合物對應的靶點，通過UniProt 在線平臺核對校正。最終共獲得符合條件的潛在活性組分45 個以及匯總去重靶點共620 個，組分詳情見表1。

表1 桑枝潛在活性組分Table 1 Potential active components of mulberry twig

2.2 HUA 及共同靶點

以“Hyperuricemia”、“Gout”等為檢索關鍵詞，從Genecards 和OMIM 在線平臺獲取疾病作用靶點，共1277 個。將“2.1”項下的成分靶點與HUA 相關的1277 個靶點取交集，獲取共同靶點，共128 個，結果見圖1。

圖1 HUA 靶點與活性組分靶點交集韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the intersection of HUA target and active component target

2.3 蛋白互作網路（PPI）結果

將128 個關鍵靶點導入到STRING 平臺分析并用Cytoscape 軟件平臺建立PPI 圖，結果見圖2。節點代表不同靶點，交互作用強弱以節點連線數量表示，節點顏色由外到內變化代表相應的degree 值由小到大。Degree 值均大于中位數12 的靶點共有56 個，其中靶點、、、、、、、、、、、、的Degree 值大于中位數的3 倍，表明以上靶點可能為桑枝治療HUA 的核心靶點，對發揮治療作用具有重要意義。

圖2 蛋白互作網絡圖Fig.2 Protein interaction network diagram

2.4 交集靶點富集分析

于DAVID 平臺進行GO 功能注釋及KEGG 富集分析（＜0.01）。GO 分析共獲取295 個條目，將前10 結果可視化，結果見圖3。生物過程（BP）共212 個，主要包括細胞增殖正相調控、凋亡過程負相調控等；細胞組成（CC）共31 個，靶點主要存在于質膜及細胞質等；分子功能（MF）共52 個，主要涉及蛋白質結合、ATP 結合等。

圖3 桑枝靶點GO 功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis of the targets of mulberry twig

KEGG 富集分析結果表明，128 個交集靶點總共涉及78 條通路（＜0.01），信號通路排名前25 的結果見圖4，主要包括PI3K-Akt、TNF、Ras、Rap1、HIF-1、TRP、Cancer、Toll-like receptor等信號通路。

圖4 桑枝靶點KEGG 通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of the targets of mulberry twig

2.5 “化合物-靶點-通路”網絡作用圖

將成分、靶點及通路預測結果處理后，導入到Cytoscape 平臺，搭建三者之間交互作用圖，結果見圖5。其中，環桑色烯（Cyclomulberrochromene）、槲皮素（Quercetin）、柚皮素（Naringenin）、異鼠李素（Isorhamnetin）、圣草酚（Eriodictyol）、山奈酚（Kaempferol）、桑色素（Morin）、桑辛素M（Moracin M）、木犀草素（Luteolin）、桑黃酮E（Kuwanon E）等的degree 值較高（圖中藍色圓點），degree 值分別為32、28、25、28、23、27、27、27、27、26，均能與多個靶點相互作用，推測上述組分可能是桑枝治療HUA的主要活性組分。

圖5 “化合物-靶點-通路”網絡圖Fig.5 “Compound-Target-Pathway”network diagram

2.6 分子對接結果

將“2.3”項下靶點蛋白分別與“2.5”項下活性組分及對照藥（非布司他）進行分子對接驗證，結果見圖6。當配體與受體相互作用時，一般認為結合能小于-5.0 kcal/mol，則表明兩者結合良好，并且該值越小代表結合越良好，相互作用越強。結果顯示，95%組分與靶點蛋白之間均具有較好的結合，且部分結合性優于對照藥，揭示預測結果較為可靠。

圖6 分子對接能量熱圖Fig.6 Molecular docking heat-map

選取結合能較小的結果進行可視化分析，結果見圖7。結果表明，Kuwanon E 與中的Pro-249、Tyr-152 形成氫鍵，與Phe-153 產生π-π 共軛，與Lys-206、Phe-153 形成疏水作用，使體系能量降低，結構趨于穩定（圖7A）；Luteolin 分別與中的His-204、Glu-181、Thr-182 形成氫鍵，與Lys-206 產生疏水作用，使體系能量降低，形成穩定結構（圖7B）；與中的Gln-51、Tyr-224、Asp-228 形成氫鍵，與Trp-52 產生疏水作用，降低體系能量，形成穩定結構（圖7C）；與中的Gln-661、Pro-168、Pro-757殘基形成氫鍵，與Arg-662 產生疏水作用，形成穩定結構（圖7D）；結果表明幾者之間均結合良好。

圖7 桑枝分子對接模式圖Fig.7 Molecular docking pattern diagram of mulberry twig

3 討論與結論

“化合物-靶點-通路”網絡拓撲分析表明，桑色素、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、環桑色烯、桑辛素M 等為桑枝治療HUA 的主要活性組分。研究表明：桑色素是一種具有抑制和促進尿酸排泄雙重作用的天然產物黃酮成分；槲皮素可降低XOD 活性，并減少葡萄糖轉運蛋白9 在肝臟及腸道中的表達量，從而使血清尿酸（UA）表達水平降低；異鼠李素能夠抑制XOD 在肝臟中的活性，從而使UA 的產生量減少；山奈酚能抑制XOD 的活性且具有顯著性，當底物與XOD 活性位點中心結合時，其能夠占據該位點，從而使尿酸生成量減少；柚皮素能清除XOD 活性；木犀草素能夠降低血清IL-1和TNF-表達水平，還能通過降低腎臟mURAT1，并在一定程度上抑制XO 活性，對高尿酸血癥小鼠具有有效的尿酸排泄作用。上述結果表明本研究篩選具有一定的理論依據，可為桑枝治療HUA 的藥效成分研究提供方向，綜上初步推測加強尿酸排泄、抑制尿酸生成以及改善炎癥3 個方面可能是桑枝中主要活性組分發揮治療HUA 的作用方式。分子對接結果表明，桑枝活性組分與核心靶點結合良好（結合能小于-5.0 kcal/mol），其中對接結合能最好的活性化合物Luteolin 與關鍵的、核心靶點蛋白，研究證明Luteolin 可以濃度依賴性地抑制靶點蛋白的表達量；Luteolin 可作為靶點蛋白的直接抑制劑，從而在NF-B 的激活中起核心作用，證實了Luteolin 具有較強的抗炎活性，其能夠直接阻斷激酶活性。綜上可知活性組分可對關鍵核心靶點加以調控從而發揮治療HUA 作用，另一方面也對網絡藥理學分析預測結果的可靠性進行了驗證。高尿酸血癥（HUA）是一種代謝性疾病，與氧化應激和炎癥反應密切相關。在桑枝治療HUA 的分子機制中，GO 功能注釋及KEGG通路分析結果表明，128 個核心靶點在功能注釋方面，主要參與細胞增殖的正調控、凋亡過程的負調控、信號轉導、蛋白質自磷酸化、血管生成、炎癥反應、先天免疫反應等發揮關鍵治療作用的生物過程；在分子功能方面，發揮蛋白酪氨酸激酶活性、ATP 結合、受體結合、絲氨酸型內肽酶活性、蛋白質結合、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶活性等關鍵功能作用，提示桑枝可能通過體內的多種生物學過程發揮治療HUA 的作用。KEGG 通路富集分析方面，桑枝活性主要涉及調控TNF、HIF-1、Cancer、PI3K-Akt、Ras、Rap1、TRP、Toll-like receptor 等信號通路，結合PPI 拓撲分析篩選桑枝防治HUA 的核心靶點，推測桑枝可能通過調控如、、、、等靶點，參與細胞增殖、細胞凋亡、炎癥反應、免疫反應、蛋白質ATP 結合的過程，從而抑制炎癥反應、改善免疫功能及調節尿酸代謝轉運來發揮治療HUA 作用。大量研究證明，TNF 信號通路在痛風性關節炎的發病機制中意義重大，其機制包括誘導IL-1 活化、增強IL-6 介導的炎癥反應、激活NFB 炎癥信號通路，該過程與慢性痛風性關節炎密切相關；并且TNF-水平在痛風患者血清中表達會升高，當NF-B 的表達被TNF-上調后會引起一系列效應，從而使機體炎癥反應程度受到影響，與HUA的發生密切相關。TRP 通路屬離子通道類，與炎癥和疼痛發生息息相關，研究揭示，類風濕性關節炎、痛風、骨關節炎等病癥和該通路密切相關。Toll-like receptor 通路與炎性疾病關系緊密，其能夠識別內源性的尿酸鹽結晶信號分子，從而激活NFB，進而誘導IL-1、IL-6、IFN-、TNF-、IFN-等炎癥因子釋放表達，促進痛風性炎癥發作。PI3K-Akt 信號通路和細胞凋亡及細胞增殖兩方面緊密相關，調控該信號通路，可以使造血和血小板生成率增加，發揮補血活血的作用，從而促進血管新生，加快生物過程轉化，推測調控該通路可以促進代謝轉運，從而加快尿酸排泄。綜上，本研究采取網絡藥理學對桑枝治療HUA 的活性組分、核心靶點及信號通路作了初步探索，并借助分子對接將活性組分及核心靶點加以進一步驗證，從系統層面闡釋了桑枝治療HUA 中多組分、多通路、多靶點的作用特點。但由于中藥成分具有復雜性，基于網絡藥理學對桑枝的初步探索仍具有不足，針對預測結果中桑枝治療HUA 的作用靶點及通路，后期將進一步予以實驗驗證，以期為桑枝治療HUA 的藥效組分研究提供理論依據及參考，也為后期加強實驗設計優化及進一步探討提供依據。