易腐果蔬中殺菌劑殘留檢測技術研究進展

杜 營，侯廣月，周莉莉，孫勝敏，劉麗潔，卞英芳，高 偉，劉 寧，李大為，徐志嬌，孔 寒，孔 蒙，吳玲娟

（山東省產品質量檢驗研究院，國家加工食品質量檢驗檢測中心（山東），山東濟南 250102）

果蔬類農產品平均水分占比超過80%，給大部分細菌、真菌、酵母菌等微生物的生長繁殖提供了有利條件，導致果蔬腐敗變質，甚至會對人體產生危害，引發食源性疾病[1-2]。

在果蔬的生產、流通、貯藏過程中，常使用有機殺菌劑，即通過使用化學物質來抑制或殺滅細菌、真菌等微生物來保證其產量和品質。有機殺菌劑對菌體的殺菌或抑制作用方式主要表現在破壞菌體細胞結構、干擾菌體細胞代謝和對菌體核酸、蛋白質合成產生影響三個方面。有機殺菌劑活性范圍廣、作用位點多，是減少果蔬采后腐爛的有效手段，也是流通貯藏期間廣泛使用的保鮮措施[3]。

有機殺菌劑在保護果蔬生長、提高產量和保障儲存質量等方面發揮了至關重要的作用，但殺菌劑殘留不可避免地會對果蔬造成污染，從而對動物體及人體健康產生不良影響[4-6]。殺菌劑類農藥殘留問題已成為社會關注的重大食品安全問題之一，現行國家標準GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》對果蔬中近160 種殺菌劑的最大殘留限量進行了規定[7]。農藥殘留最大限量標準的實施增強了農藥的監管力度，因此采用先進的分析技術測定果蔬中多種殺菌劑農藥殘留尤為重要。本文闡述了近年來果蔬中殺菌劑類農藥殘留測定的前處理及檢測技術進展，旨在推動建立一種更加快速、安全、高效、靈敏的果蔬中殺菌劑的檢測分析技術。

1 果蔬中常用有機殺菌劑概況

有機殺菌劑通常是指能夠有效防治和殺死病原微生物的有機化學藥劑，按傳導特性不同可分為內吸性殺菌劑和保護性殺菌劑。內吸性殺菌劑能被植物葉、莖、根、種子吸收進入植物體內，具有治療和保護作用，如多菌靈、多霉清、霜疫清、甲霜靈等；保護性殺菌劑不能被植物內吸并傳導、存留，不能用來防治深入植物體內的病害，只具有保護作用，如代森錳鋅、福美雙、百菌清等[8]。果蔬中常用的有機殺菌劑按原料來源主要分為有機硫殺菌劑、有機磷殺菌劑、有機氯殺菌劑、酰胺類殺菌劑、酰亞胺類殺菌劑、取代苯類殺菌劑、苯并咪唑類殺菌劑、三唑類殺菌劑和雜環類殺菌劑，見表1（見上頁）。

表1 果蔬中常用有機殺菌劑的分類Table 1 Classification of common organic fungicides in fruits and vegetables

2 果蔬中常見殺菌劑前處理方法

樣品前處理是果蔬中殺菌劑類農藥殘留分析檢測的關鍵環節，主要包括提取、凈化、濃縮等幾個步驟，前處理過程影響檢測的準確性和重現性，因此需要優化樣品前處理過程中的各種因素[9]。近年來，隨著殺菌劑類農藥最大殘留限量的降低，樣品前處理技術也朝著更簡單、快速、高效的方向發展。果蔬中有機殺菌劑類農藥殘留檢測常用的前處理方法有固相萃取法、固相微萃取法、固相分散萃取法、超臨界流體萃取法、凝膠滲透色譜法和QuEChERS 法等。表2 列出了果蔬中多種有機殺菌劑的前處理方法。

表2 果蔬中多種有機殺菌劑檢測前處理方法Table 2 Various pretreatment methods for detecting organic fungicides in fruits and vegetables

2.1 固相萃取法

固相萃取法是利用固體吸附劑吸附樣品中的目標化合物，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，從而達到分離和富集目標化合物的目的[18]。該技術試劑消耗量小、操作簡單、回收率高、分離效果好、重現性好，也可與其他儀器聯用實現自動化，在殺菌劑類農殘檢測中得到了越來越廣泛的應用，但固相萃取柱大多是一次性的，雖然凈化效果好，但樣品用量較大時成本較高，濃縮過程耗時久[19]。Schermerhorn 等[20]采用C18 固相萃取技術結合液相色譜-串聯質譜測定了果蔬中14 種三唑類農藥和8種三唑類代謝物，回收率為60%～120%。周瑤等[21]采用氨基固相萃取柱前處理凈化技術，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定6 種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的方法，該方法操作簡單，能滿足果蔬中6 種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量的檢測要求，重復性好。

2.2 固相微萃取法

固相微萃取法是在固相萃取技術基礎上發展起來的集萃取、濃縮和進樣于一體的前處理技術，可與多種檢測技術聯用，具有操作簡單、省時安全、靈敏度高、選擇性好、無需溶劑等顯著優點，應用前景廣闊[22]。但由于固相微萃取技術所需裝置價格比較昂貴，對于揮發性差的物質分析效果不理想、重現性不高，一定程度上限制了其應用。Navalon 等[23]采用頂空固相微萃取前處理方法，研究了pH 值、離子強度、萃取和脫附時間及萃取溫度對葡萄、草莓和西紅柿中嘧霉胺和醚菌酯殘留的影響，方法回收率為91.6%～104.8%。Munitz 等[24]采用固相微萃取前處理方法，研究了嘧菌酯和唑菌胺酯在藍莓中的殘留檢測，該方法選擇性好、準確度和靈敏度高。

2.3 固相分散萃取法

固相分散萃取是在樣品提取液中加入固相吸附劑，經渦旋、離心，最后取上清液進行測定的過程。這種方法能同時實現樣品均質、提取和凈化，僅需要少量樣品和溶劑，不需要特殊的儀器設備[25]，但這種方法存在提取條件優化復雜、自動化程度不高、樣品用量小但需要混合均勻等問題。Wu 等[26]建立了固相分散萃取-液相色譜串聯質譜法測定水果蔬菜中酰胺類殺菌劑的方法，酰胺類殺菌劑的平均回收率為72.4%～98.5%。Guo 等[27]采用基質固相分散萃取前處理方法，通過液相色譜-串聯質譜對果蔬中的苯并咪唑類殺菌劑及其代謝物進行測定，在1～500 ng/g 水平范圍內，該方法的平均回收率在70%～110%范圍內。

2.4 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法是利用超臨界流體從液體或固體中萃取出特定成分，以達到分離的目的[28]。這種前處理方法具有有機溶劑用量小、簡單快速、自動化程度高、可與氣相色譜聯用等優點，在果蔬等樣品的前處理中應用較多，但是這種萃取體系的可選擇性較小、設備價格高昂，因而制約了該技術的推廣使用[25]。李新社[29]采用超臨界二氧化碳流體萃取蔬菜中的殘留農藥，由于超臨界二氧化碳呈化學惰性，它不會影響樣品分析的準確性，且其萃取效率較高，可廣泛應用于萃取蔬菜中的殘留農藥。王建華等[30]采用超臨界流體萃取果蔬中多種有機磷殘留，樣品中農藥殘留回收率可達82%～108%。

2.5 凝膠滲透色譜法

凝膠滲透色譜分離是一種物理過程，能夠很好地分離有機大分子物質，有效降低了基質干擾，提高了殺菌劑類農藥殘留前處理效率，同時具有回收率高、載荷量大、自動化程度高等優點，但凝膠滲透色譜本身也有其局限性，若樣品基質中的小分子雜質與待測物相對分子量相近則很難分離[31]。Christensen 等[32]采用乙酸乙酯和環己烷提取、凝膠滲透色譜凈化的前處理方法，對水果中嘧菌酯、醚菌酯和肟菌酯的殘留進行檢測，這三種殺菌劑的方法回收率為70%～114%。傳統的離線凝膠色譜法雖然能有效分離有機大分子物質，但前處理過程需使用大量的有機溶劑洗脫后再進行濃縮，耗時較長。田麗等[14]利用在線凝膠色譜凈化結合三重四極桿氣質聯用儀建立了篩查食品中農藥殘留的分析方法。這種方法能有效減少試劑消耗，降低基質對目標物質的干擾，同時可通過大體積進樣來提高檢測靈敏度，有利于樣品中痕量農藥殘留的篩查。

2.6 QuEChERS 技術

QuEChERS（quick easy cheap effective rugged safe）前處理技術是一種基于分散固相萃取技術而形成的樣品前處理技術，原理與高效液相色譜和固相萃取相似，都是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到除雜凈化的目的。這種方法具有簡單、高效、快速、安全、價格低廉等顯著優點，目前已廣泛應用于果蔬中農藥殘留的檢測分析[33-36]。畢思遠等[37]采用QuEChERS 前處理方法結合氣相色譜-串聯質譜法建立了葡萄等漿果中7 種酰胺類殺菌劑殘留量的測定方法，他提出，QuEChERS 前處理方法具有操作簡單、試劑消耗量小、準確度高等顯著優點。龔蕾等[38]建立了改進的QuEChERS提取和凈化方法，結合超高效液相色譜-串聯質譜法測定果蔬中18 種琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑。該方法操作簡單、凈化效果好，適用于果蔬中新型琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑的快速檢測。

3 果蔬中常見殺菌劑檢測技術

隨著現代分析化學技術的提高，殺菌劑檢測技術迅速發展，殺菌劑殘留檢測主要采用氣相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法和免疫分析技術等。表3（見下頁）列出了果蔬中常見的有機殺菌劑儀器檢測技術。

表3 果蔬中多種有機殺菌劑儀器檢測技術Table 3 Various instrumental techniques for detecting organic fungicides in fruits and vegetables

3.1 氣相色譜法

氣相色譜法（gas chromatography，GC）具有操作簡便、選擇性高、分離效能好、靈敏度高、分析快速以及應用范圍廣等特點。對于易揮發且不會發生分解的殺菌劑均可采用氣相色譜法進行檢測，可以實現一次進樣、待測組分得到完全分離的效果。

吳俐等[49]建立了同時測定6 種三唑類殺菌劑殘留量的氣相色譜方法。6 種三唑類殺菌劑在樣品添加水平為0.05～0.20 mg/kg 時，方法檢出限為0.002～0.007 mg/kg，可同時滿足植物源性食品中多種三唑類殺菌劑殘留量的檢測需要。吳潔珊等[50]建立了一種同時測定柑橘中四種殺菌劑殘留量的氣相色譜法，外標法定量，醚菌酯、肟菌酯、唑菌胺酯和烯肟菌酯的方法檢出限分別為5、5、10、10 μg/kg。張晶等[51]建立了福美鐵、丙森鋅和代森錳三種殺菌劑類農藥殘留的氣相色譜-火焰光度檢測器測定方法，提高了二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑的檢測專一性。該方法操作簡單、定量準確可靠，能夠滿足農藥殘留檢測的要求。

3.2 氣相色譜-串聯質譜法

氣相色譜-串聯質譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS），是將氣相色譜儀的高效分離能力與質譜儀獨特的選擇性、靈敏度、相對分子質量和分子結構鑒定能力相結合的一種分析檢測技術[52]，具有定性能力強、靈敏度高、高效快捷等特點，現已廣泛應用于農藥殘留檢測中，特別是在農藥代謝物、降解物的檢測和多農藥殘留檢測等方面具有顯著優勢。

李繼革等[53]建立了同時測定水果中11 種三唑類殺菌劑殘留量的氣相色譜-串聯質譜方法，該方法基質效應和背景干擾低、靈敏度高，11 種三唑類殺菌劑的方法定量限均在0.8～3.4 μg/kg 之間，低于國家標準及有關文獻報道值，可用于水果中三唑類殺菌劑的同時測定。張瑤等[54]建立了氣相色譜-串聯質譜測定蔬菜中啶氧菌酯、醚菌酯、醚菌胺等10 種殺菌劑殘留的檢測方法，這10 種蔬菜殺菌劑線性關系良好，方法檢出限為0.1～0.5 μg/kg。范良彪等[55]建立了氣相色譜-串聯質譜法測定3 種食用菌中6 種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量的分析方法，該方法具有前處理速度快、操作簡便、重復性好、準確度高等優點。張晶等[56]建立了香菇樣品中福美雙、丙森鋅和代森聯3 種殺菌劑的氣相色譜-串聯質譜檢測方法，方法操作簡便、靈敏度高、定量準確可靠，各項指標均能滿足農藥殘留檢測要求。

3.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（liquid chromatography，LC）可以解決氣相色譜技術的一些局限，尤其適用于高沸點、熱穩定性差、強極性、離子型以及大分子化合物的檢測分析[57]，現已成為有機殺菌劑殘留檢測不可缺少的重要方法。

朱群英等[58]建立了同時測定豆芽中多菌靈、福美雙和百菌清等11 種植物生長劑和殺菌劑的在線固相萃取-高效液相色譜分析方法，通過優化在線固相萃取條件和色譜分離條件，實現了11 種植物生長調節劑和殺菌劑的有效分離，精密度和準確度良好。楊濤等[59]提出了高效液相色譜法同時測定果蔬中10 種防腐殺菌劑的方法，這10 種防腐殺菌劑的方法檢出限在0.02～0.05 mg/L 之間。

3.4 液相色譜-串聯質譜法

液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS），是將液相色譜與質譜聯接起來的方法，用于分析對熱不穩定、分子量較大、難以用氣相色譜分析的農藥殘留，具備幾乎通用的多殘留分析能力。它能結合液相色譜和質譜二者的優點，具有檢測靈敏度高、選擇性好、定性定量可同時進行、能夠提供待測組分結構信息等優點[60]。盡管液相色譜-質譜聯用法對分析技術和儀器的要求高，它仍是一種很有利用價值的高效率、高可靠性的農藥殘留分析技術。

孫亞米等[61]建立了果蔬中16 種新型酰胺類殺菌劑的液相色譜-串聯質譜快速分析方法。該方法定量限在3.0×10-4～0.01 mg/kg 之間，完全能夠滿足果蔬中16 種新型酰胺類殺菌劑殘留量的分析要求。徐瀟穎等[62]建立了高效液相色譜-串聯質譜法同時快速測定水果蔬菜中7 種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的方法。樣品采用HPLC-MS/MS 電噴霧正離子多反應模式監測，基質標曲進行外標法定量。該方法操作簡單，重復性好，基質干擾少。

3.5 免疫分析法

免疫分析是以抗原抗體特異性識別和結合反應為基礎的分析方法，通過對半抗原或抗體的標記，利用標記物的生物、物理或化學放大作用，對樣品中特定的農藥殘留物進行定性定量檢測。免疫分析具有特異性強、靈敏度高、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等優點，一般不需要貴重儀器，可大大簡化甚至省去前處理過程，目前已廣泛應用于農藥殘留的快速檢測中[63-65]。

Watanabe 等[66]建立了單克隆抗體酶聯免疫吸附檢測百菌清的方法，并檢測了黃瓜、蘋果等4 種農產品中的百菌清含量，該方法I50值為0.34 ng/g，檢出限為0.052 ng/g。柳雙等[67]基于多菌靈多克隆抗體建立了直接競爭酶聯免疫吸附測定方法檢測果蔬中的多菌靈殘留，該方法校正曲線的檢測限為（0.30±0.15）μg/L，靈敏度為（2.70±0.30）μg/L。

4 小結與展望

作為分析工作中非常重要的一環，有機殺菌劑前處理技術不斷發展，目前QuEChERS 技術已成為檢測果蔬中有機殺菌劑的主要手段，這種技術具有簡單、高效、快速、安全、價格低廉等顯著優點，但這種方法也存在基質效應明顯、方法靈敏度不高等問題。在實際分析檢測過程中需要根據果蔬樣品特性、目標殺菌劑化合物特性等來優化前處理方法。而在果蔬類農產品殺菌劑的檢測方面，LC-MS/MS 法具有檢測靈敏度高、選擇性好、定性定量準確、結果可靠等優點。盡管這種方法對分析技術和儀器設備的要求較高，但它仍是一種很有利用價值、高效可靠的農藥殘留分析技術。

綜上所述，QuEChERS 法結合LC-MS/MS 技術將是果蔬中殺菌劑殘留檢測分析的主流技術，但仍存在基質效應、回收率不高等問題。未來隨著檢測手段和儀器設備的不斷升級發展，相應技術手段也將不斷完善。

殺菌劑市場不斷更新迭代，隨著人們生活水平及環保意識的提高，高毒殺菌劑將逐步淡出市場，未來我國有機殺菌劑將朝著廣譜、高效、低毒及無交互抗性的方向發展。殺菌劑的快速發展也對其殘留量檢測提出了更高要求，未來殺菌劑類農藥殘留檢測將朝著快速、高效、靈敏度高等方向發展：一是將發酵學、細胞學和生物芯片等生物技術和化學分析技術相結合，提高分析選擇性和靈敏度；二是研究和開發出快速、準確度高且能進行高通量篩查的痕量檢測技術。