微波萃取輔助高效液相色譜法測定新疆級外紅棗中的蘆丁含量

王 璐，楊濱銀，王小琴，孫路明，庹見偉

（阿克蘇地區疾病預防控制中心，新疆阿克蘇 843000）

紅棗富含紅棗多糖、維生素、氨基酸、環磷酸腺苷、黃酮類化合物等生理活性物質[1-2]，其中重要的是黃酮類物質[3]，研究結果表明，生物類黃酮具有多種生物活性，因此紅棗有“百果之王”的美稱[4]。

蘆丁是紅棗中重要的活性成分之一，具有較高的醫用和藥用價值[5]，能降低毛細血管通透性和脆性，促進細胞增殖和防止血細胞凝聚，以及發揮抗炎、抗過敏、利尿、解痙、鎮咳、降血脂等作用[6]。目前紅棗是新疆林果類產業發展的重點項目之一，紅棗果實在成熟期落果率達到25%，紅棗的加工過程中也會產生部分級外果品[7]。級外紅棗絕大多數以廢物的形式丟棄或作為燃料被燃燒掉，未能實現更高附加值的資源利用。紅棗蘆丁的提取實現了級外果的有效利用和價值提升。

目前，紅棗蘆丁的測定主要有分光光度法和高效液相色譜法[8-13]，高效液相色譜對于高沸點、大分子、強極性化合物的分離分析有較大的優勢；微波萃取無需干燥等預處理，簡化了工藝，對天然產物的提取具有選擇性高、操作時間短、溶劑用量少、有效成分得率高、浸出過程材料細粉不凝聚、不糊化等優點；二者結合能夠優勢互補、相輔相成。目前采用微波萃取技術提取級外紅棗中蘆丁含量的高效液相色譜法分析的報道較少。本文通過微波萃取前處理方法提取紅棗蘆丁，采用高效液相色譜儀測定紅棗中的蘆丁，并優化工藝條件，為充分利用紅棗落棗及級外棗中的蘆丁提供依據，從而充分發揮紅棗的醫用價值，解決紅棗落棗及級外棗銷售不暢的難題，同時提高了紅棗收益和農民收入。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用紅棗為級外灰棗干品，產地為新疆阿克蘇市。蘆丁標準品，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98.0%，CAS#153-18-4；無水乙醇，純度99.7%，分析純，萊陽經濟技術開發區精細化工廠；磷酸，分析純，85wt%，西亞化工技術公司（山東）；甲醇，色譜純，99.99%，美國Fisher 公司；實驗用水由Milli-Q 凈化制得。

1.2 儀器與設備

HPLC 液相色譜儀，ACQuity Arc，美國Waters 公司；202 型電熱恒溫干燥箱，上海申光儀器儀表有限公司；BSA224S-CW 分析天平，賽多利斯科儀器有限公司；AS10200BDT 超聲儀，天津奧特賽斯儀器有限公司；TGL-18MS 離心機，上海盧湘儀儀器有限公司；MARS 全自動固相萃取儀，美國GEM公司。

1.3 方法

1.3.1 紅棗中蘆丁的提取與分析

原料→干燥→磨粉→過篩→加乙醇浸提→在微波下萃取→過濾→氮吹濃縮→蘆丁提取液→HPLC 分析

1.3.2 操作要點

將紅棗樣品切成細條，去核，放入50 ℃烘箱中烘干，然后粉碎過80 目篩，備用。準確稱取0.300 0 g（精確至0.000 1 g）于50 mL 離心管中，加入一定量30%乙醇水溶液，微波萃取2 min，冷卻至室溫后用水定容至50 mL。在4 000 r/min 下離心10 min，取上清液，過0.22 μm 濾膜，HPLC 上機測定。

1.3.3 微波萃取輔助乙醇浸提技術參數優化

準確稱取紅棗粉0.300 0 g，萃取時間2 min，料液比1∶15 條件下，分別加入不同濃度（50%、60%、70%、80%、90%、100%）的乙醇4.5 mL，微波功率分別按功率300、350、400、450、500 W 提取，采用單因素實驗分別考察乙醇濃度和微波功率。

1.3.4 HPLC 條件優化方法

影響HPLC 檢測效果的因素主要有檢測波長、流動相、柱溫和流速，分別考察對蘆丁峰面積的影響。采用二極管陣列檢測器對波長進行考察，選擇247～358 nm 波長范圍進行全波長掃描；分別以甲醇-水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液和乙醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相，設置不同配比（30∶70、35∶65、40∶60、45∶55）；柱溫采用30、40、50 ℃三個水平，流速采用0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 四個水平，對標準品溶液進行測定。

1.4 測定指標與方法

參照中國藥典和其他文獻[14-15]，精密吸取對照品溶液與紅棗提取液注入高效液相色譜儀中，采用外標法測定蘆丁含量。根據標準曲線方程計算紅棗樣品液中蘆丁的質量濃度，并根據公式（1）計算其蘆丁的得率Y。

式中，Y為蘆丁的得率,%；M為樣品溶液中蘆丁的質量，mg；m為用于提取的棗粉質量，mg。

1.5 數據處理

所有數據均重復測定3 次，取平均值。蘆丁含量采用的外標法，通過液相色譜儀相配套的Empower 3 色譜數據處理軟件完成相關成數據采集與處理，采用Excel 97-2003 數據處理軟件對數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 微波輔助乙醇提取條件的選擇

2.1.1 乙醇濃度的選擇

如圖1 所示，隨著乙醇濃度的增加，蘆丁提取量先增加后減少，當乙醇濃度為70%時，蘆丁提取量最大，為0.262 g/100 g。因此，乙醇濃度選擇70%。

圖1 乙醇濃度對蘆丁含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on rutin content

2.1.2 微波功率的選擇

如圖2 所示，隨著微波功率的增大，蘆丁含量先增加后減少，當微波功率為400 W 時，蘆丁含量最高，為0.264 g/100 g。因此，微波提取功率選擇400 W。

圖2 微波功率對蘆丁含量的影響Fig.2 Effect of microwave power on rutin content

2.2 HPLC 條件的選擇

2.2.1 檢測波長的選擇試驗測得最佳吸收波長為274 nm，峰面積最高為124 238，靈敏度最高。因此檢測波長選擇274 nm。

2.2.2 流動相的選擇

由色譜峰出峰時間結果顯示，單標蘆丁溶液的保留時間隨流動相組成變化有較大變化，流動相中甲醇比例從45%降到30%時，蘆丁保留時間從6.04 min 延長至21.25 min，說明流動相中甲醇比例降低，流動相極性增強，延長了蘆丁的出峰時間。陳靜等[16]在研究甲醇流動相比例對蘆丁出峰影響時得出，當甲醇比例從60%降至30%時，蘆丁組分的保留時間延長了21 min，與試驗結果變化趨勢相似?？紤]到紅棗中含有色素較多以及組分的復雜性，蘆丁的保留時間以12 min 左右較宜，故選擇流動相組成為甲醇-0.5%磷酸水溶液=40∶60。

2.2.3 色譜柱柱溫的選擇

在柱溫為30、40、50 ℃條件下，對紅棗蘆丁提取液進行分析得出，隨著柱溫的增加，柱壓下降，洗脫效率增強，蘆丁出峰時間提前，柱溫過高影響儀器和色譜柱的壽命。因此柱溫選擇40 ℃。

2.2.4 流速的選擇

流速過高，不但不利于儀器和色譜柱的保護，同時造成流動相的浪費；流速過低，蘆丁的出峰時間延長。本實驗在流速0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 條件下測得在流速為0.8 mL/min 時，得到的色譜峰出峰時間和靈敏度最好，故流速選擇0.8 mL/min。

2.3 樣品的測定

精確稱取同一批次級外紅棗樣品6 份，按最佳的色譜條件，即色譜柱為Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）；在檢測波長為274 nm，用甲醇-0.5%磷酸水溶液（40∶60）為流動相，流速為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃，分別制備供試樣品溶液，進樣量1 μL，測定各樣品溶液蘆丁峰面積，蘆丁提取量最高為0.264 g/100 g，計算蘆丁含量間的RSD 為2.6%，表明該方法可以作為提取紅棗中蘆丁的色譜方法且重復性良好。

3 方法學考察

3.1 標準曲線及線性范圍

準確稱取一定量的標準品于105 ℃下干燥至恒質量，并于干燥器內冷卻至室溫，精確稱取標準品0.010 0 g，用甲醇溶液分3 次洗滌燒杯，并移入10 mL 容量瓶中，配制成1 000 mg/L 的標準儲備液。

表1 蘆丁加標回收率和相對標準偏差Table 1 Recovery and relative standard deviation of rutin

精密量取蘆丁標準溶液0、50、100、150、200、300、400 μL，用甲醇定容至1 mL，混勻進行測定。以峰面積為縱坐標，以蘆丁進樣濃度為橫坐標，進行線性回歸，得到回歸方程為Y=-6.35×10-2X+2.32×10-3，R2=0.9992；蘆丁對照品濃度在50～400μg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

3.2 精密度

用空白樣品配制濃度范圍為50 μg/mL 的基質溶液連續進樣5 次，蘆丁相對標準偏差RSD 為0.633%，小于5%（n=5），表明儀器精密性良好。

3.3 加標回收率

用空白樣品配制濃度范圍為0～400 μg/mL 的基質標準工作曲線，分別進行20、50、100 mg/kg 的添加回收試驗（n=6）。利用添加水平50 mg/kg 的測量結果計算檢出限和定量限，以信噪比S/N=3 確定方法檢出限為1～5 mg/kg；以信噪比S/N=10 確定方法定量限為20～50 mg/kg。蘆丁在3 個不同添加水平下，回收率介于90.1%～98.5%之間，相對標準偏差（RSD）均小于20%。

4 結論

此次試驗建立了高效液相色譜法測定紅棗中蘆丁的方法，通過優化微波強化提取條件，建立了經濟、快捷的微波強化前處理方法，建立色譜條件為以甲醇-0.5%磷酸（40∶60）為流動相，在柱溫為40 ℃、用70%的乙醇1∶15 的料液比、400 W 的萃取條件下，紅棗中的蘆丁提取量最高為0.264 g/100 g，比趙志勇等[9]在響應面法優化新疆紅棗總黃酮乙醇提取工藝中提取得到蘆丁含量稍高，說明微波強化前處理比傳統的前處理更為快速簡單、穩定高效。試驗結果表明HPLC 方法測得蘆丁濃度為50～400 μg/mL，蘆丁濃度與峰面積線性關系良好，精密度、穩定性良好，樣品回收率介于90.1%～98.5%之間，蘆丁在3 個添加水平的相對標準偏差（RSD）均小于20%（n=6）?？傮w上該方法簡單、快速、準確度高、精密度好，完全能夠滿足紅棗中蘆丁成分測定的需求，可以為新疆級外紅棗的綜合利用及其深加工技術的開發提供一定的理論依據。