自毒脅迫對黃瓜砧穗種子萌發和抗氧化特性的影響

肖雪梅 馬 寧 李 菊 王 瑞 胡琳莉 武 玥 郁繼華*

（1 甘肅農業大學園藝學院，甘肅蘭州 730070；2 省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730070）

黃瓜（L.）是設施栽培的主要蔬菜種類之一，隨著連作年限的增加，生產上出現品質下降、產量降低、病蟲害加重等連作障礙問題。前人研究表明，作物根系分泌的自毒物質對其自身的毒害作用是引起連作障礙的主要原因之一（喻景權和杜堯舜，2000；Huang et al.，2013）。植物自身釋放的化感物質對同種或同科植物產生的生長抑制效應稱為自毒現象（Rice &Kozlowski，2013；陳鋒等，2017）。黃瓜根系可以分泌包括苯甲酸、2，5-二羥基苯甲酸、肉桂酸和苯丙酸在內的11 種酚酸類自毒物質（Yu &Matsui，1994），其中肉桂酸是主要的自毒物質，常作為外源物質來模擬自毒脅迫（Ye et al.，2006；Bu et al.，2018）。這些自毒物質通過影響黃瓜種子萌發和胚根生長、幼苗的離子吸收和光合作用，抑制黃瓜生長（Yu &Matsui，1997；Yu et al.，2003；Bu et al.，2016）；還可引起根系氧化脅迫，促進枯萎病的發生（Ye et al.，2006）；抑制細胞有絲分裂和細胞周期相關基因的表達（Zhang et al.，2009）。因此，提升黃瓜對自毒脅迫的耐受性可一定程度增強其抵御連作障礙的能力。

通過嫁接換根措施可有效提高蔬菜作物的抗逆性，減輕連作障礙的產生。李玉洪等（2012）發現嫁接能提高苦瓜對枯萎病、蔓枯病、白粉病等病害的抗性，解決苦瓜生產中的連作障礙問題；適宜的砧木嫁接可提高西瓜（Ning et al.，2013）和茄子（陳紹莉 等，2010；Chen et al.，2011）幼苗對自毒物質的耐受性，增強其對土傳病害的抗性。甘肅農業大學蔬菜逆境生理研究團隊前期研究采用二代轉錄組測序技術明確了黑籽南瓜（Bouché）嫁接通過調節光合作用、碳氮代謝途徑中關鍵基因的上調，增強黃瓜植株對自毒脅迫的耐受性（Xiao et al.，2020）。Ding 等（2007）研究證實黃瓜與黑籽南瓜幼苗的根系生長對肉桂酸處理表現出不同的響應，其中黃瓜根系中活性氧積累，膜脂過氧化程度加重，生物膜H-ATPase 活性降低，甚至根系活力喪失，而在黑籽南瓜中則沒有這種變化。黑籽南瓜這種較強的適應性是否在發芽期就表現出來尚未得到證實，黃瓜、黑籽南瓜種子萌發和胚根生長對肉桂酸的響應差異及相關的生理機制也尚不明確。因此，本試驗以肉桂酸為外源物質模擬自毒脅迫，探究黑籽南瓜和黃瓜種子萌發對自毒脅迫的響應是否存在差異及其潛在的生理代謝和基因調控機制，以期進一步從理論上說明黃瓜自毒作用和調控機理，為科學防治黃瓜連作障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以新春4 號黃瓜和黑籽南瓜種子為試驗材料。供試種子購買于甘肅省農業科學院種子市場。

1.2 試驗設計

試驗于2020 年9—12 月在甘肅農業大學園藝學院設施園藝實驗室進行。選取健壯飽滿、形態一致的黃瓜和黑籽南瓜種子，經溫湯浸種后將種子均勻擺放于鋪有兩層濾紙的培養皿（直徑9 cm）中，黃瓜種子每皿30 粒，黑籽南瓜種子每皿20 粒。預試驗結果表明0.25 mmol · L是黃瓜種子萌發的中度肉桂酸脅迫濃度，因此本試驗向培養皿滴加0.25 mmol · L肉桂酸（CA）溶液浸濕濾紙，以滴加等量蒸餾水為對照（CK），共4 個處理。每處理3 次重復，每個重復10 皿，置于人工氣候箱在28 ℃黑暗條件下催芽。催芽期間每天補充適量的蒸餾水或0.25 mmol · L肉桂酸溶液。發芽標準為種皮裂開、胚根露白，處理后2～5 d 每天記錄發芽種子數，計算發芽率。前期試驗結果表明黃瓜、黑籽南瓜種子萌發的起始時間分別為8 h 和32 h，發芽最快時間分別為11 h 和35 h，因此分別于黃瓜種子萌發的0、8、11、24、48 h 和黑籽南瓜種子萌發的0、32、35、48、72 h 取整株芽苗，每個重復取2 皿。將樣品用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干水分，液氮處理后，于-80 ℃保存，用于測定活性氧、丙二醛含量和抗氧化酶活性、基因表達量等指標。分別于黃瓜催芽5 d 和黑籽南瓜催芽7 d 收集胚根，測定芽苗根系形態，每個重復取5 株。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 種子發芽指標

發芽率=萌發種子數/供試種子總數× 100%

芽苗根系形態采用WinPHIZO BASIC 2005 根系分析系統測定，記錄根系的總根長、根表面積、根體積和根尖數等指標。

1.3.2 活性氧和丙二醛含量 參照Hu 等（2012）的方法，過氧化氫（HO）含量用硫酸鈦法測定，超氧陰離子（O）產生速率用羥胺氧化反應法測定，丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法測定。

1.3.3 抗氧化酶活性 根據Gossett 等（1994）的方法，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）還原法測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫分光光度法測定，抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性采用抗壞血酸紫外吸收法測定，谷胱甘肽還原酶（GR）活性采用NADPH 氧化法測定。

1.3.4 抗氧化酶基因的相對表達量 抗氧化酶基因-、-、、、、表達量采用熒光實時定量PCR（qRT-PCR）法測定（Zhao et al.，2017）。取樣時間為黃瓜發芽8 h和黑籽南瓜發芽32 h。

總RNA 采 用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa）試劑盒〔寶生物工程（大連）有限公司〕提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，并采用NanoDrop 2000 檢測RNA 濃度和純度。采用PrimeScriptRT Master Mix（TaKaRa）試劑盒〔寶生物工程（大連）有限公司〕將RNA 反轉錄為cDNA。依據TaKaRa公司的SYBR System操作手冊，于LightCycler 96 實時熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏）上，采用兩步法進行PCR 擴增?；蛱禺愋砸镄蛄幸姳?，以基因為內參。根據得到的值，采用2方法計算目的基因的相對表達量。

表1 基因及其引物信息

1.4 數據處理

所有數據采用SPSS 軟件進行最小顯著性差異法（LSD）分析，顯著水平＜0.05；采用Microsoft Excel 2010 作圖。

2 結果與分析

2.1 肉桂酸對黃瓜砧穗種子發芽率和胚根形態的影響

由表2 可知，黃瓜和黑籽南瓜種子萌發對肉桂酸處理的響應不同。0.25 mmol · L肉桂酸處理可顯著抑制黃瓜種子的萌發，發芽率降低了7.8 百分點；而黑籽南瓜種子發芽率卻比對照略有升高，但未達到顯著水平。表明黑籽南瓜種子萌發對自毒脅迫的耐受性高于黃瓜。

表2 肉桂酸處理對黃瓜和黑籽南瓜種子發芽率和胚根形態的影響

黃瓜和黑籽南瓜芽苗胚根形態均不同程度受到肉桂酸的抑制。其中，黃瓜胚根的總根長、根表面積、根體積和根尖數均比對照顯著下降，分別降低

了28.1%、22.2%、14.9%和46.6%；而黑籽南瓜僅根表面積顯著低于對照，降幅為17.2%，總根長、根體積和根尖數均與對照無顯著差異。另外，無論有無肉桂酸脅迫，黑籽南瓜胚根各形態指標均高于黃瓜，表明黑籽南瓜具有更發達的根系，可能是其對肉桂酸耐受性較高的原因之一。

2.2 肉桂酸對黃瓜砧穗種子萌發過程中活性氧和丙二醛含量的影響

如圖1 所示，黃瓜和黑籽南瓜種子中活性氧的積累對肉桂酸脅迫呈現不同的響應水平。隨著發芽時間的延長，黃瓜種子的HO含量呈不斷升高趨勢，O產生速率先升高后降低，且在發芽的各個時期肉桂酸處理下的含量均顯著高于對照。而黑籽南瓜種子中HO含量和O-.產生速率均隨發芽時間的推進而呈增加趨勢，但HO含量僅在發芽48 h 和72 h 顯著高于對照，增幅分別為10.4%和36.5%，O產生速率始終與對照無顯著差異。表明在同濃度肉桂酸脅迫下，黑籽南瓜比黃瓜積累較少的活性氧自由基。隨著發芽時間的延長，黃瓜種子中MDA 含量在肉桂酸處理下不斷積累，在發芽48 h 時顯著高于對照，增加了26.2%；而黑籽南瓜種子中的MDA 含量在萌發過程中均與對照無顯著差異，且在發芽72 h 時驟降。

圖1 肉桂酸處理對黃瓜和黑籽南瓜種子萌發過程中H2O2 含量、產生速率和MDA 含量的影響

2.3 肉桂酸對黃瓜砧穗種子萌發過程中抗氧化酶活性的影響

由圖2 可知，隨著發芽時間的推進，黃瓜種子的SOD、CAT、APX 和GR 活性均呈現先升后降的變化趨勢，APX 活性相比發芽初期有升高趨勢，并且肉桂酸處理的酶活性均先高于對照而后低于對照，但不同的酶活性出現的拐點不同。SOD和APX 活性均在發芽8 h 時顯著高于對照，而在發芽24 h 和48 h 時顯著低于對照，其中，48 h 時分別比對照降低了26.0%和65.2%；CAT 活性除發芽8 h 時顯著高于對照外，其余時間點均顯著低于對照，在發芽11、24 h 和48 h 時分別比對照降低了11.5%、34.4%和33.3%；而GR 活性僅在發芽24 h 和48 h 時顯著低于對照，分別降低44.6%和26.7%。黑籽南瓜抗氧化酶活性對肉桂酸脅迫表現出不同的響應水平。SOD、CAT 和GR 活性均在種子萌發過程的前期升高，后期降低，最終與對照無顯著差異，其中SOD 活性分別在發芽32、35 h 和48 h 時顯著高于對照，CAT 活性僅在發芽35 h 時顯著高于對照，GR 活性在發芽35 h 和48 h 時顯著高于對照。APX 活性在發芽的各個時期均受到肉桂酸的顯著影響，分別在發芽32、35、48 h 和72 h 時高于對照15.4%、14.3%、55.9%和118.5%。

圖2 肉桂酸處理對黃瓜和黑籽南瓜種子萌發過程中SOD、CAT、APX 和GR 活性的影響

2.4 肉桂酸對黃瓜砧穗種子萌發過程中抗氧化酶基因表達量的影響

如圖3 所示，除基因外，其他基因表達量在黃瓜種子遭受肉桂酸脅迫后下調，而在黑籽南瓜種子中上調。與對照相比，黃瓜種子萌發過程中的-、-、、和分別下調95%、73%、70%、91%和89%，而黑籽南瓜種子萌發過程中這5 個基因分別上調148%、272%、148%、199%和272%。然而，表現出相反的變化，其在黃瓜種子萌發過程中基因表達量比對照升高了60%，而在黑籽南瓜中降低了93%。

圖3 肉桂酸處理對黃瓜、黑籽南瓜種子萌發過程中抗氧化酶基因表達量的影響

3 討論

種子萌發是植物生命周期中的關鍵環節，對植物生長發育至關重要。蔬菜作物種子能否正常萌發與出苗率高低直接影響后期的作物產量和品質。本試驗結果顯示0.25 mmol · L肉桂酸處理顯著抑制了黃瓜的發芽，而黑籽南瓜的發芽未受到顯著影響，甚至稍有促進?；形镔|抑制植物種子萌發的研究已在多種作物中被報道，如萵苣、蘿卜和生姜 等（Butcko &Jensen，2002；Han et al.，2008；Yuan et al.，2012）。此外，本試驗中初生芽苗的根系發育也受到肉桂酸處理不同程度的抑制，且黃瓜的抑制作用更大。因此，證實了種子萌發階段的黑籽南瓜比黃瓜對自毒脅迫的耐受性更強。

自毒物質會作用于幼胚細胞，破壞細胞結構，進而影響植物種子萌發。其最直接的結果就是導致種子中電解質的外滲，丙二醛含量的積累，破壞細胞膜結構的完整性。Bu 等（2016，2018）研究發現，肉桂酸的衍生物苯丙酸通過破壞黃瓜種子細胞膜的完整性，引起電解液滲透率增加和丙二醛含量升高，從而抑制其正常的萌發。同樣的研究結果在甜瓜植株水浸液對其種子萌發的影響中被證實（Zhang et al.，2020）。本試驗發現隨著種子萌發時間的推進，黃瓜種子中MDA 含量逐漸增加，在發芽48 h時顯著高于對照，而黑籽南瓜始終與對照差異不顯著。表明黑籽南瓜遭受肉桂酸傷害的程度較輕。相似的結果在黃瓜、黑籽南瓜幼苗期對肉桂酸脅迫的響應研究中亦被報道（Ye et al.，2006）?；钚匝踝鳛橹匾男盘柗肿?，在種子萌發以及植物抗逆性方面具有重要的調控作用。如果細胞內積累過多的活性氧則會破壞細胞膜以及細胞內大分子物質，改變調節細胞生物活性所必需的氧化還原內穩態，影響植物種子萌發以及生長發育（Pergo et al.，2011）。已有研究表明，作為非生物脅迫的一種，自毒作用能影響植物種子萌發過程中活性氧的產生與清除，進而調控植物種子萌發（Bu et al.，2018）。正常條件下活性氧的產生與清除處于動態平衡中，但受到自毒脅迫時，這種平衡關系被打破，種子萌發就會受到抑制。本試驗結果表明，肉桂酸處理可顯著促進黃瓜種子HO和O-.的積累，且隨著萌發時間的延長積累量增加。而黑籽南瓜僅在種子萌發后期顯著促進HO的積累。說明黑籽南瓜遭受的氧化損傷程度較黃瓜輕。

植物在長期的進化過程中形成了一套自我防御體系，在遭遇逆境時可清除過量的活性氧分子，以維持正常的生命活動。有關自毒脅迫對植物抗氧化系統的影響出現兩種不同的觀點，有的報道稱SOD、POD、CAT、APX、GR 活性在自毒物質處理下升高（Bai et al.，2009；Li et al.，2011）；另有一些研究結果顯示，自毒脅迫引起這些抗氧化酶活性下降（Bu et al.，2016）。本試驗結果表明，肉桂酸處理下的黃瓜SOD、CAT、APX 和GR 活性隨萌發時間的推進均呈現先升高后下降的趨勢，但發芽后期黃瓜的抗氧化酶活性低于對照，在發芽48 h 分別比對照降低了26.0%、33.3%、65.2%和26.7%；而黑籽南瓜的抗氧化酶活性高于或接近于對照。分析其原因，初期抗氧化酶活性的升高可能是植物遭受逆境脅迫出現的應激反應，隨著脅迫時間的延長，酶系統遭受破壞，導致酶活性下降。黃瓜、黑籽南瓜種子中的抗氧化酶基因的表達結果表明，肉桂酸處理可引起-、-、、和基因在黃瓜中的下調和黑籽南瓜中的上調。類似的結果在Li 等（2014）的研究中也有報道，該研究發現黑籽南瓜嫁接通過上調抗氧化酶基因的表達提高黃瓜對高溫和低溫的適應性。本試驗結果進一步從分子水平論證了黑籽南瓜對肉桂酸耐受性高于黃瓜的原因。

4 結論

肉桂酸處理可顯著抑制黃瓜的種子萌發和胚根生長，而對黑籽南瓜幾乎沒有影響。此外，自毒脅迫引起黃瓜丙二醛和活性氧的過度積累，而對黑籽南瓜影響不大。這可能是由于黑籽南瓜具有較發達的根系，抗氧化酶活性的升高和抗氧化酶基因表達的上調，增強了其對活性氧的清除能力，維持了生物膜的穩定性。