生脈注射液化學物質基礎研究
——大類成分的定量分析

聶黎行，劉 瑞，張 燁，陳 佳*，李 靜，戴 忠，馬雙成

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.山西中醫藥大學，山西 晉中 030619；3.鄂爾多斯市檢驗檢測中心，內蒙古 鄂爾多斯 017010）

中藥注射劑作為我國特有的新劑型，具有起效快、作用強等特點，在心腦血管疾病、感染性疾病、惡性腫瘤、危重疾病、疑難雜癥的治療方面具有獨特優勢[1-3]。生脈注射液由紅參、麥冬、五味子3味藥組成，具有益氣養陰，復脈固脫的功效，臨床上用于氣陰兩虧，脈虛欲脫的心悸、氣短，四肢厥冷、汗出、脈欲絕及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等疾病的治療[4-6]。本次新型冠狀病毒肺炎疫情，中醫藥在緩解癥狀、提高治愈率、降低病亡率，促進機體康復等環節取得明顯成效[7-9]，生脈注射液也被列為《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》（第四～七版）重型患者救治推薦用藥。

中藥的化學成分是其發揮臨床功效的物質基礎，《中藥、天然藥物注射劑基本技術要求》（國食藥監注[2007]743號）規定：“中藥注射劑中所含成分應基本清楚，多成份制成的注射劑，需要分別建立大類成份的測定，所測成份應大于總固體量的80 %”。本文在前期化學成分類別系統預實驗的基礎上[10]，采用多種技術和手段首次對生脈注射液中的大類成分進行全面地定量分析，進一步闡明了本品的化學物質基礎，為其質量評價和控制、藥效及作用機制等研究提供了依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AE240（十萬分之一）電子天平，FD-1冷凍干燥機（北京博醫），DZ-2BC型真空干燥箱（天津泰斯特），KQ-250DE型醫用數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司），8453紫外可見分光光度計（Agilent公司），L15/11馬弗爐（Nabertherm公司），DL53型自動電位滴定儀（Mettler公司）。

1.2 材料

分析純乙醇、乙酸乙酯、鹽酸、硫酸、蒽酮、香草醛（北京化學試劑公司）。氫氧化鈉滴定液（0.01004 mol/L，國家化學試劑質檢中心）。AB-8型大孔樹脂（天津允開樹脂），001*1型陽離子交換樹脂（天津興南允能）。D-果糖（批號：111504-201703）、人參皂苷Re（批號：110754-202129）、五味子醇甲（批號：110857-201815）、蘋果酸（批號：190013-201702）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。7批生脈注射液由A、B、C 3個廠家提供。

2 方法與結果

2.1 總固體的測定

因生脈注射液含糖量高，如采用常規的烘干法測定總固體，糖在高溫下分解產生水，水蒸發后造成總固體量偏低，故采用冷凍-減壓干燥法測定。精密量取本品2.0 ml于干燥置入恒重的西林瓶，-20 ℃冷凍干燥48 h，取出，置于裝有五氧化二磷的真空干燥箱中，室溫放置24 h，取出，迅速精密稱定重量，計算總固體含量，結果見表1。

2.2 大類成分的定量分析

2.2.1 總糖的含量測定 樣品經大孔樹脂純化，采用蒽酮-硫酸比色法測定生脈注射液中總糖含量[11]。取果糖對照品12 mg，精密稱定，加水溶解并定容至10 ml，即得對照品貯備液。精密吸取上述對照品貯備液0.2，0.4，0.8，1.0和1.2 ml，分別加水稀釋并定容至10 ml，搖勻，即得系列對照品溶液。分別吸取各系列對照品溶液1 ml，精密加水1 ml，搖勻，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加80 %硫酸溶液100 ml使溶解，搖勻）6 ml，搖勻。至100 ℃水浴加熱15 min，立即至冰浴中冷卻15 min，取出測定。照紫外-可見分光光度法（《中國藥典》2020年版四部通則0401），以相應試劑為空白，在626 nm波長處測定吸光度。以對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。精密量取生脈注射液1 ml，加于預先處理好的AB-8大孔樹脂柱（柱內徑約8 mm，高約19 cm），用水80 ml沖洗，洗脫液收集于100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取上述溶液2 ml，加水稀釋并定容至10 ml，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液1 ml，照標準曲線制備項下的方法，依法測定吸光度，以隨行標準曲線外標法計算含量，結果見表1。

方法學考察：按標準曲線制備方法，進行線性關系實驗，結果表明，果糖在0.0250～0.1504 mg/ml范圍內線性關系良好，回歸方程為y=5.773x+0.009，r=0.9996。取同一供試品溶液（批號：09122603），分別連續測定6次，平均吸光度為0.5146，RSD為0.1 %，表明方法精密度良好。取同一批次樣品（批號：09122603），平行制備6份供試品溶液，依法測定，總糖含量平均值為43.12 mg/ml，RSD為1.3 %，表明方法重復性良好。取顯色后的同一供試品溶液（批號：09122603），置于冰浴中，分別于15，30，60，90，120，150，180 min取出測定，平均吸光度為0.5185，RSD為0.4 %，表明供試品溶液冰浴放置3 h，基本穩定。精密量取已知含量的本品（批號：09122603）0.5 ml，精密加入果糖對照品約25 mg，混勻，按供試品制備方法制得加樣回收溶液，平行制備6份，依法測定，平均回收率為101.2 %，RSD為2.4 %，表明方法準確。

2.2.2 總皂苷的含量測定 樣品經大孔樹脂純化，采用香草醛-硫酸比色法測定生脈注射液中總皂苷含量[12]。取人參皂苷Re對照品17.5 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至10 ml，即得對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密量取對照品溶液0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 ml，置入具塞試管，揮發溶劑至干，精密加入8 %香草醛乙醇溶液0.5 ml、72 %硫酸5.0 ml，搖勻，60 ℃水浴加熱1 h，置冰浴中冷卻15 min，取出，放至室溫。照紫外-可見分光光度法（《中國藥典》2020年版四部通則0401），以相應試劑為空白，在538 nm波長處測定吸光度。以對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。精密量取生脈注射液1 ml，加于預先處理好的AB-8大孔樹脂柱（柱內徑約8 mm，高約19 cm），分別用水80 ml，20 %乙醇40 ml沖洗，再用75 %乙醇70 ml洗脫，收集75 %乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至25 ml量瓶，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液1 ml，照標準曲線制備項下的方法，依法測定吸光度，以隨行標準曲線外標法計算含量，結果見表1。

方法學考察：按標準曲線制備方法，進行線性關系實驗，結果表明，人參皂苷Re在0.0155～0.1399 mg/ml范圍內線性關系良好，回歸方程為y=7.026x+0.002，r=0.9996。取同一供試品溶液（批號：09122603），分別連續測定6次，平均吸光度為0.4812，RSD為0.2 %，表明方法精密度良好。取同一批次樣品（批號：09122603），平行制備6份供試品溶液，依法測定，人參皂苷Re含量平均值為1.97 mg/ml，RSD為1.8 %，表明方法重復性良好。取顯色并冰浴冷卻后的同一供試品溶液（批號：09122603），置于室溫，分別于15，30，60，90，120，150，180 min測定，平均吸光度為0.5372，RSD為2.0 %，表明供試品溶液冰浴放置3 h，基本穩定。精密量取已知含量的本品（批號：09122603）0.5 ml，精密加入人參皂苷Re對照品約0.9 mg，混勻，按供試品制備方法制得加樣回收溶液，平行制備6份，依法測定，平均回收率為101.8 %，RSD為2.4 %，表明方法準確。

2.2.3 總木脂素的含量測定 樣品經大孔樹脂柱分離和乙酸乙酯萃取，采用比色法測定生脈注射液中總木脂素含量[13]。取五味子醇甲對照品10 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至25 ml，搖勻，即得對照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度。照紫外-可見分光光度法（《中國藥典》2020年版四部通則0401），以相應試劑為空白，在254 nm波長處測定吸光度。以對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。精密量取本品1 ml，加于預先處理好的AB-8型大孔吸附樹脂柱（柱內徑約8 mm，高約19 cm），分別用水200 ml、20 %乙醇200 ml、乙醇100 ml洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加水10 ml使溶解，再加5 mol/L的鹽酸溶液0.5 ml，搖勻，用乙酸乙酯萃取4次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 ml，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液1 ml，照標準曲線制備項下的方法，依法測定吸光度，以隨行標準曲線外標法計算含量，結果見表1。

方法學考察：按標準曲線制備方法，進行線性關系實驗，結果表明，五味子醇甲在0.0045～0.0452 mg/ml范圍內線性關系良好，回歸方程為y=3.349x+0.030，相關系數（r）=0.9996。取同一供試品溶液（批號：09122603），分別連續測定6次，平均吸光度為0.1543，RSD為0.04 %，表明方法精密度良好。取同一批次樣品（批號：09122603），平行制備6份供試品溶液，依法測定，總木脂素含量平均值為0.17 mg/ml，RSD為0，表明方法重復性良好。取同一供試品溶液（批號：09122603），分別于15，30，60，90，120，150，180 min測定，平均吸光度為0.1547，RSD為0.3 %，表明供試品溶液放置3 h，基本穩定。精密量取已知含量的本品（批號：09122603）0.5 ml，精密加入五味子醇甲對照品約0.08 mg，混勻，按供試品制備方法制得加樣回收溶液，平行制備6份，依法測定，平均回收率為95.9 %，RSD為2.7 %，表明方法準確。

2.2.4 總酸的含量測定 采用電位滴定法測定總酸含量[14-15]。取蘋果酸對照品25 mg，精密稱定，加水溶解并定容至50 ml，搖勻，即得對照品溶液。精密量取上述對照品溶液1 ml，加水30 ml，置于自動電位儀上，用氫氧化鈉滴定液滴定（電極DG 111-SC），隨行空白實驗?？鄢瞻缀?，求得每1 ml蘋果酸對照品溶液所消耗的氫氧化鈉滴定液體積為7.54 ml。而蘋果酸含3個羧基，由公式（V堿=3C酸V酸/C堿）計算理論消耗量為7.46 ml，實測值與理論值基本吻合，表明電位滴定法可準確反映供試品溶液中酸的含量。精密量取生脈注射液2 ml，加于預先處理好的001*1型強酸性陽離子交換樹脂柱（樹脂約10 ml），加水90 ml洗脫，收集流出液和洗脫液置入100 ml量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液25 ml置入100 ml滴定杯，加水10 ml，置于自動電位儀上，用氫氧化鈉滴定液滴定（電極DG 111-SC），同法測定空白溶液。以ΔE/ΔV-V繪制一階導數曲線，每1 ml 氫氧化鈉滴定液（0.01004 mol/L）相當于0.6606 mg蘋果酸，生脈注射液中的總有機酸含量以蘋果酸計，結果見表1。

方法學考察：取同一批樣品（批號：09122603）制得的供試品溶液，分別連續測定6次，消耗氫氧化鈉滴定液的平均體積為6.8948 ml，RSD為0.3 %，表明方法精密度良好。取同一批次樣品（批號：09122603），平行制備6份供試品溶液，依法測定，總酸含量平均值為9.1108 mg/ml，RSD為1.6 %，表明方法重復性良好。取同一供試品溶液（批號：09122603），分別于0，2，4，6，12 h測定，消耗氫氧化鈉滴定液的平均體積為6.8954 ml，RSD為2.0 %，表明供試品溶液放置12 h，基本穩定。精密量取已知含量的本品（批號：09122603）1 ml，精密加入蘋果酸對照品溶液（9.0248 mg/ml）1 ml，混勻，按供試品制備方法制得加樣回收溶液，平行制備6份，依法測定，平均回收率為99.9%，RSD為1.4 %，表明方法準確。

2.2.5 總無機成分的含量測定 精密量取生脈注射液2 ml，至熾灼至恒重的坩堝中，緩緩熾灼至完全炭化，放冷至室溫，加硫酸0.5 ml使濕潤，低溫加熱至硫酸蒸氣除盡后，于600 ℃熾灼使完全灰化，移至干燥器內，放冷至室溫，精密稱定后，再于600 ℃熾灼至恒重，即得，結果見表1。

表1 生脈注射液大類成分含量/mg·ml-1（n=2）

3 討論

本研究以冷凍-減壓干燥法測定總固體含量，采用比色法、電位滴定法、熾灼殘渣法等方法測定總糖、總皂苷、總木脂素、總酸、總無機成分等大類成分的含量。結果表明，3個廠家的7批生脈注射液總固體、總糖、總皂苷、總木脂素、總酸、總無機成分含量分別在37.7～78.1，25.87～56.90，1.33～1.97，0.07～0.24，1.71～9.11，1.62～8.62 mg/ml之間；不同批次樣品的總皂苷、總木脂素含量波動范圍較小，總固體、總糖、總酸、總無機成分含量差異較大。7批樣品總糖、總皂苷、總木脂素、總酸、總無機成分占總固體百分比分別在55.2 %～74.1 %，2.2 %～3.8 %，0.2 %～0.5 %，3.7 %～11.7 %，3.1 %～11.0 %之間，占比最高的是總糖，其次為總有機酸和總無機成分，再次為總皂苷，占比最低的為總木脂素，各大類成分含量總和均占總固體含量80 %以上（見圖1），達到了《中藥、天然藥物注射劑基本技術要求》（國食藥監注[2007]743號）的規定，在一定程度上明確了生脈注射液的物質組成和相對比例，在此基礎上進一步開展的單個化學成分的含量測定將另文報道。

圖1 7批生脈注射液中各大類成分占總固體的百分比

本文建立的方法操作簡便、快速、準確，能夠系統、全面地揭示生脈注射液的化學物質基礎，可推廣用于其它中藥注射液的質量評價。研究結果不僅為后續藥效物質基礎的深入研究提供了有價值的參考，同時也為提高生脈注射液的質量標準、保證用藥安全以及品種的二次開發提供了科學依據。