復方鹿茸超微混懸酒工藝優化及對血虛小鼠模型的影響研究

管慶霞，聶澤卉，董 詩，溫美欣，趙夢瑤，林澤榆，王彥偉*

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江瀚泊爾科技發展有限公司，黑龍江 哈爾濱 150040）

血虛（blood deficiency，BD）是女性常見疾病，通常是由勞累過度，缺乏營養，失血過多等原因所致[1]。據統計，女性血虛發病率高達64 %，并呈逐年遞增態勢，對女性身心健康造成極大影響。目前有多種緩解血虛的方法，中藥治療法仍占據主要地位，臨床應用較廣泛的是中藥復方制劑[2]。

復方鹿茸超微混懸酒所用處方是由依據中醫臨床經驗而來，方中11味中藥：鹿茸擅在其益精填髓，精旺以化氣生血；川芎通行血海以調經[3]；當歸營養血脈以榮經[4]；白芍斂陰以益腎肝；黃芪補氣以益衛陽；熟地補血以滋沖任；人參扶元以通血脈；肉桂溫營血以散外邪；柏子仁養血以安神；丹皮涼血熱以散滯[5]；烏梅養肝以補血，共同配伍，共奏補血調經之效。本研究將鹿茸制為超微粉，提取其他藥味的有效成分，以酒為溶媒，將超微粉混懸劑與藥酒兩者的優勢相結合，并對其處方工藝、藥效等進行研究評價，以期實現用藥少、藥效強、方便調配、便于服用、藥效穩定、增強補血作用的效果。

1 儀器與材料

YJ-L10氣流粉碎機（濰坊精華粉體工程設備公司），SIGMA500掃描電子顯微鏡（北京歐波同光學），Waters e2695-2698高效液相色譜儀系統（美國Waters），UV-4802雙束紫外可見分光光度計（尤尼柯儀器），SB-5200D超聲波清洗機（寧波新芝），AB265-S梅特勒電子天平（瑞士梅特勒托利多），XS-500i全自動血液分析儀（希森美康）；鹿茸（市購），中藥飲片（黑龍江匯仁藥材），環磷酰胺（批號：A22A7X13656，上海源葉），乙酰苯肼（批號：SJ0121RA14，上海源葉），芍藥苷對照品、阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院）；昆明種小鼠，雌性，體重20±2 g，清潔級動物（黑龍江中醫藥大學GLP實驗中心）；復方阿膠漿（山東阿膠）。

2 方法與結果

2.1 芍藥苷與阿魏酸分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 芍藥苷色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：230 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；柱溫：30 ℃。阿魏酸色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：321 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；柱溫：35 ℃。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定芍藥苷對照品3.56 mg，置入10 ml棕色量瓶，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，得芍藥苷儲備液。精密稱定阿魏酸對照品2.39 mg，置入25 ml棕色量瓶，加70 %甲醇使其溶解并稀釋至刻度，得到阿魏酸儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 將不含鹿茸的其他藥味按照處方比例粉碎混合，稱取約2 g，加入20倍60 %的乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，過濾，定容至25 ml，減壓濃縮，冷凍干燥，得到固體粉末，取一定量用甲醇或者70 %甲醇復溶，得到供試品溶液[6]。

2.1.4 空白對照溶液的制備 以70 %甲醇作為空白對照溶液。

2.1.5 專屬性考察 分別取芍藥苷與阿魏酸的對照品溶液、供試品溶液、空白溶液適量，按照色譜條件進樣，記錄色譜，見圖1。結果表明：在檢測條件下，溶劑對芍藥苷與阿魏酸的含量測定均無干擾，該方法的專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.6 方法學考察 精密吸取2.1.2項下芍藥苷儲備液，用甲醇逐級稀釋至濃度分別為356.00，178.00，89.00，44.50，22.25 μg/ml，以對照品的濃度（X，μg/ml）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線為Y=14 512X+94 239（R2=0.9988）。結果表明，芍藥苷在22.25～356.00 μg/ml范圍內線性關系良好；精密吸取2.1.2項下阿魏酸儲備液，用70 %甲醇逐級稀釋至濃度分別為15.30，7.65，3.82，1.91，0.96，0.24 μg/ml，以對照品的濃度（X，μg/ml）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線為Y=57 911X+6995.4（R2=0.9997），結果表明，阿魏酸濃度在0.24～15.30 μg/ml范圍內線性關系良好。精密吸取芍藥苷儲備液和阿魏酸儲備液，按照2.1.1項下色譜條件重復進樣6次，測得峰面積RSD小于2 %，表明精密度良好。取2.1.3項下供試品溶液，在24 h內按2.1.1項下色譜條件測定峰面積RSD小于2 %，表明供試品溶液溶液在24 h內穩定。芍藥苷加樣回收率回收率范圍99.35 %～102.35 %，RSD小于2 %，阿魏酸加樣回收率范圍97.47 %～102.38 %，RSD小于2 %，滿足分析要求。

2.2 鹿茸藥液的制備研究

將鹿茸凈化、切片、冷凍干燥后用氣流粉碎機超微粉碎。精密稱量20.0 mg鹿茸超微粉，加入50 ml基酒，震蕩搖勻，配制為鹿茸藥液，為類乳白色混懸液。

2.3 不含鹿茸的藥液制備研究

2.3.1 提取方法考察 以芍藥苷和阿魏酸的總含量與出膏率為指標考察不同提取方法對不含鹿茸的中藥提取效果的影響。取不含鹿茸的其他藥味粉2 g，加10倍量50 %乙醇，分別用超聲法、回流法[7]、煎煮法提取2次，每次30 min，合并提取液過濾，定容至25 ml，按2.1.1項色譜條件進樣，計算含量，結果見表1。提取液經減壓濃縮，冷凍干燥后稱重計算出膏率。綜合考慮，以回流法作為芍藥苷與阿魏酸的提取方法。

表1 提取方法的考察（n=6）

2.3.2 單因素考察

2.3.2.1 乙醇濃度考察 設定乙醇濃度為50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %6個水平進行考察。結果見圖2，70 %乙醇時出膏率最多。

圖2 乙醇濃度對總含量及出膏率的影響

2.3.2.2 液料比考察 設定液料比分別為8，10，12，15，20 g/ml 5個水平進行考察。結果見圖3，液料比大于15倍量后，總量及出膏率均逐漸降低。

圖3 料液比對總含量及出膏率的影響

2.3.2.3 提取時間的考察 設定提取時間分別為0.5，1，1.5，2 h 4個水平進行考察。結果見表4，提取時間在1.5 h前，芍藥苷與阿魏酸總量逐漸增大，1.5 h后成分基本保持不變；出膏率在提取時間1.5 h前同樣逐步增大，1.5 h后有小幅波動。

圖4 提取時間對總含量及出膏率的影響

2.3.2.4 提取次數的考察 設定提取次數分別為1，2，3，4次4個水平進行考察。結果見圖5，出膏率在提取3次前逐步增大，3次后基本不變。

圖5 提取次數對總含量及出膏率的影響

2.3.3 正交試驗 選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）、提取次數（D） 4個因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）表設計正交試驗。綜合評分=（含量/含量最大值）×50+（浸膏得率/浸膏得率最大值）×50。對綜合評分進行直觀分析和方差分析，結果見表2和表3。

表2 正交實驗安排及結果

由表2可見，影響有效成分綜合評分的因素主次順序為B＞D＞A＞C，即液料比＞提取次數＞乙醇濃度＞提取時間。得到提取最佳條件為A2B3C3D3，即乙醇濃度60 %、液料比20倍、回流時間2 h、提取3次。

由表3可見，表明B、D即液料比與提取次數兩個因素對有效成分的含量和出膏率具有顯著性（P＜0.05）影響。C提取時間對其無顯著影響，考慮到節省時間，選擇最佳工藝為A2B3C1D3，即乙醇濃度60 %、液料比20倍量、回流時間1 h、3次。

表3 方差分析表

2.3.4 驗證試驗 按照上述優選的最佳工藝提?。╪=3），測定芍藥苷與阿魏酸總量與出膏率。結果見表4。由表4可見，單因素考察法和正交試驗法優選得到的最佳提取工藝有重復性和穩定性。有效成分含量到較高，且能獲得較多的浸膏，工藝可行。

表4 驗證試驗結果

2.3.5 干燥 按最佳工藝制得提取液，置旋轉蒸發中進行真空減壓濃縮，將濃縮液冷凍干燥，密封保存，即得凍干粉。以凍干時間為橫坐標，凍干溫度為縱坐標，繪制凍干曲線，見圖6。

圖6 凍干曲線

2.3.6 不含鹿茸的藥液配制 稱取0.60 g凍干粉，分散于50 ml基酒中，震蕩均勻，澄清，調味，即得不含鹿茸藥液，本品為深紅棕色藥液，酒氣醇香。

2.4 復方鹿茸超微混懸酒的配制

取鹿茸藥液50 ml，不含鹿茸藥液50 ml，震蕩混合均勻，得100 ml復方鹿茸超微混懸酒，本品為紅棕色混懸液。

2.5 復方鹿茸超微混懸酒的補血作用研究

2.5.1 動物分組及給藥 取清潔級雌性小鼠48只，體重20±2 g，隨機分為6組，每組8只，即正常組、模型組、陽性對照組、低、中、高劑量組。低、中、高劑量組灌胃給藥劑量分別為0.42，0.84和1.68 mg/(kg·d)，陽性對照組灌胃給藥劑量10 ml/(kg·d)，正常組及模型組小鼠給予等體積生理鹽水。調節酒精度15 %，每日灌胃1次，連續30 d。模型組、陽性對照組與給藥組小鼠分別于給藥的第4，10，20天皮下注射乙酰苯肼20，40，20 mg/kg，第10天起，每日腹腔注射環磷酰胺40 mg/kg，連續4天制備血虛模型[8]。正常組小鼠同時注射等量生理鹽水。小鼠造模同時灌胃給予受試藥物。觀察每組小鼠行為體征并稱重。

2.5.2 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，數據均值±標準差（±s），兩組間差異比較用t檢驗，多組間采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2.5.3 對小鼠體重的影響 比較小鼠最開始體重與末次給藥后體重的變化，不同劑量對小鼠體重的影響，見表5。

表5 復方鹿茸超微混懸酒對小鼠體重的影響（±s，n=8）

表5 復方鹿茸超微混懸酒對小鼠體重的影響（±s，n=8）

注：#P＜0.05，##P＜0.01 vs正常組；*P＜0.05，**P＜0.01 vs模型組

組別 給藥后體重增加值/g正常組 10.63±1.92模型組 5.25±0.70##陽性對照組 9.75±0.89**低劑量組 6.38±0.92*中劑量組 7.50±1.41**高劑量組 9.88±1.73**

2.5.4 對小鼠游泳時間的影響 各組小鼠均于末次給藥0.5 h后，置游泳箱中，水深不少于30 cm，水溫25±1.0 ℃，記錄小鼠自游泳開始至力竭的時間（小鼠頭部沉入水中，經10 s仍不能返回水面視為力竭）。結果見表6。

表6 復方鹿茸超微混懸酒對小鼠游泳時間的影響（±s，n=8）

表6 復方鹿茸超微混懸酒對小鼠游泳時間的影響（±s，n=8）

組別 游泳時間/min正常組 118.35±4.26模型組 64.37±2.22##陽性對照組 109.42±1.38**低劑量組 78.05±2.19中劑量組 96.35±3.43*高劑量組 107.13±5.06**

2.5.5 對小鼠外周血常規的影響 小鼠眼底靜脈叢取血，采用XS-500i全自動血液分析儀檢測血常規，主要包括外周血象中紅細胞RBC（1012/L），血紅蛋白HGB（g/L)，紅細胞壓積HCT（L/L），血小板PLT（109/L），白細胞WBC（109/L）單核細胞百分比MONO（%）共6項指標，見圖7。

圖7 復方鹿茸超微混懸酒對小鼠外周血象的影響

2.5.6 對小鼠免疫器官的影響 小鼠脫頸椎處死，剝取胸腺、脾臟和肝臟，剔除旁邊的組織和筋膜后稱濕重。按公式計算胸腺指數（thymus index，TI）、脾臟指數（spleen index，SI）和肝臟指數（liver index，LI），計算公式分別如下：TI=胸腺重（mg）/鼠重（g），SI=脾重（mg）/鼠重（g），LI=肝重（mg）/鼠重（g），不同劑量對小鼠免疫器官的影響見圖8。

圖8 復方鹿茸超微混懸酒對小鼠免疫器官的影響

綜上，高劑量對小鼠的胸腺重量與TI、脾臟重量與SI、肝臟重量與LI均有顯著性改善作用，中劑量對小鼠的胸腺重量、脾臟重量與SI、肝臟重量與LI有顯著性改善作用，而低劑量只對小鼠的脾臟重量與SI、LI有顯著性改善作用。綜合考慮，初步暫定中高劑量對小鼠具有補血作用。

2.5.7 基于多指標綜合指數法的補血效應 依據多指標綜合指數法，首先對外周血常規、臟器和其他等多個指標進行歸一化處理即標化，當模型組相應指標數值（value）與正常組相比升高時，V標化=（V模型-V給藥）/V模型；當模型組相應指標數值與正常組相比降低時，V標化=（V給藥-V模型）/V模型。然后依據前期查閱文獻并綜合專家意見后給出的權重系數對各效應指標進行效應整合，指標WBC、RBC、HGB取權重為2，HCT、PLT、MONO%、TI、SI、LI、體重（M鼠）、游泳時間（T游泳）、胸腺重量（M胸腺）、脾臟重量（M脾臟）、肝臟重量（M肝臟）取權重為1。各指標數據的標化值乘以各自權重系數后的加和值即為該藥物對于小鼠補血作用的總效應值（total effect，TE）。綜合上述多個指標，對復方鹿茸超微混懸酒的總補血效應進行整合，結果見表7。

由表7可見，經過多指標綜合指數法的處理，復方鹿茸超微混懸酒高中低劑量總補血效應順序為：高劑量＞中劑量＞低劑量，高劑量補血效應最好。

表7 復方鹿茸超微混懸酒的總補血效應

3 小結與討論

本實驗采用氣流式粉碎機對鹿茸進行超微粉碎得到鹿茸超微粉，與基酒配制為鹿茸藥液；通過單因素考察法和正交試驗法優化提取工藝配制為不含鹿茸的藥液；二者混合得到復方鹿茸超微混懸酒。在前期預實驗中考察真空減壓干燥法與冷凍干燥法對不含鹿茸的濃縮液干燥效果時發現，真空減壓法干燥時間較長，且干燥效果不好，故本研究選用冷凍干燥法干燥濃縮液?？紤]到方中還有多糖類化合物、貴細藥材人參活性成分等補益功能成分，可作為下一步深入研究內容。

近年，血虛動物模型制備方法有失血法、環磷酰胺化學損傷法、乙酰苯肼溶血法、免疫介導法、60Co輻照法及復合法等[9]。因乙酰苯肼、環磷酰胺操作簡便易于控制，本研究選用聯合此兩種方法。環磷酰胺可損害機體的免疫器官[10]，同時使骨髓造血干祖細胞的集落生成能力降低，導致骨髓造血障礙[11]，因此可制備出血虛模型。乙酰苯肼是一種對RBC有氧化性損傷作用的強氧化劑，這種損傷可使RBC崩解出現溶血性貧血，RBC和HGB數量明顯降低，WBC數量升高，脾臟顯著腫大呈深褐色。乙酰苯肼與環磷酰胺聯合應用可從雙重環節上造成動物血虛，其表現為各類細胞數量整體下降和免疫器官損傷而萎縮；利用此種方法建立血虛模型，動物存活率高，血虛狀態持續時間長[12]。乙酰苯肼可導致溶血性血虛證，使WBC升高，環磷酰胺可引起骨髓抑制性血虛證，使WBC降低[13]，同時，乙酰苯肼引起的溶血性血虛動物表現為胸腺指數降低，肝臟和脾臟指數升高，環磷酰胺引起的骨髓抑制性血虛動物表現為胸腺指數降低，肝臟和脾臟指數降低，在實驗中血虛模型小鼠表現WBC指數增高，肝臟和脾臟指數升高，可知乙酰苯肼所致血虛占主導作用，與外周血中血虛主導作用一致。

本課題應用現代超微粉碎技術，將鹿茸制為超微粉以酒為媒介與復方提取物相結合配制為混懸劑，以期達到用量少、利用度高[14]、副作用小、改善女性血虛體質、減輕痛苦的目的。目前，超微粉碎技術僅局限于單味中藥，中藥復方及其體外制劑的超微粉碎的研究才剛開始，但是超微粉碎后的中藥復方成分之間發生的勻化作用和理化性質的變化機制十分復雜，將可能成為未來中藥復方超微粉碎化重點研究的方向。