不同產品中紅曲霉代謝產物的差異性研究

岳倩倩，王先桂，田 多

（茅臺學院，貴州仁懷 564507）

紅曲霉是一種絲狀腐生真菌，在分類學地位上，其隸屬于真菌門子囊菌亞門不整囊菌綱散囊菌目紅曲菌科[1]。因在生產過程中能產生色素、淀粉酶等代謝產物，現已被廣泛研究。由于紅曲霉的代謝產物紅曲色素具有安全性和穩定性，人們將其應用于肉制品、豆腐乳制品或釀酒行業[2-5]。同時，紅曲霉在生產過程中產生的糖化酶、酯化酶、蛋白酶等酶類，在相互作用下，可生成核苷酸、氨基酸、單糖等呈味物質和酯類、醇類等香氣物質，對發酵食品的風味起著重要作用[6]。在醫藥方面，有研究表明，紅曲霉生長過程中產生的次級代謝產物洛伐他汀具有降低血脂和降膽固醇的作用；γ-氨基丁酸具有降血壓、助睡眠、抗驚厥等作用[7]。

現階段，人們將大米作為紅曲霉的發酵基質，最終以紅曲米的形式在市面上進行銷售。有研究表明，在用大米作為紅曲霉發酵基質時，以粳米為基質發酵更利于產生黃色素和紅色素[8]。但是，現存于市面上的紅曲米產品眾多，人們如何在眾多的產品中挑選合適的產品就顯得尤為困難。因此，本文從網上隨機挑選3款紅曲產品，利用微生物實驗方法和試劑盒法，對3款紅曲產品中紅曲霉所產色素含量、淀粉酶活性進行研究，以期通過上述實驗的開展，選出優質的紅曲產品，為人們在挑選和購買紅曲產品時提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從淘寶網上隨機挑選3款紅曲產品，品牌為某本紅曲米、某杰紅曲米和某田紅曲米，通過分離純化，得到3株紅曲霉菌株，命名為MN-1、MN-2和MN-3。

1.2 試劑及培養基

麥芽糖，山東綠英化工科技有限公司；蛋白胨，青島青藥生物工程有限公司；酵母膏，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖，重慶萬盛川東化工有限公司；無水乙醇，天津市科密歐化學試劑有限公司；淀粉酶試劑盒，索萊寶生物有限公司；沙氏培養基（酵母膏 5 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，麥芽糖 5 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂 20 g·L-1，121 ℃滅菌 25 min）。

1.3 儀器與設備

LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；振蕩培養箱，廣東省醫療器械廠；醫用離心機，曦瑪離心機（揚州）有限公司；752-Pro紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；XS-212-202雙目生物顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；HH-8恒溫水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種活化

將3種紅曲米分別放入研缽進行粉碎處理，然后稱取紅曲粉10 g于250 mL三角瓶中，加入100 mL無菌水，放入恒溫振蕩培養箱中，28 ℃、80 r·min-1的條件下恒溫振蕩培養24 h使紅曲霉菌種活化。

1.4.2 菌種分離

用稀釋涂布法將已活化的紅曲霉菌液接種到滅菌的沙氏培養基上，放置30 ℃的恒溫培養箱中10 d后取出，挑選紅曲霉單菌落菌株，然后轉接到沙氏斜面培養基上進行培養，用于后續實驗。

1.4.3 形態觀察

將保存在斜面培養基上的紅曲霉菌株分別點種在沙氏平板培養基上，然后放置到28 ℃恒溫培養箱中培養10 d后取出,觀察菌落形態、隆起度及變色時間，并用直尺測量菌落直徑。

1.4.4 孢子懸液制備

將已活化的紅曲霉菌株用無菌水洗下后，經4層濾紙過濾到無菌三角瓶中，然后將濾液分裝于10 mL無菌離心管中進行3次離心，條件為4 000 r·min-1，10 min，然后分別接種到30 mL的液體培養基中，每樣本3個平行，孢子液終濃度大約為4×105CFU·mL-1，置于搖床上振蕩培養7 d，培養條件為 30 ℃，230 r·min-1。

1.4.5 色素測定方法

取適量菌液和菌絲，研磨混勻后，取0.25 mL于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至10 mL，顛倒混勻后置于恒溫水浴鍋中浸提30 min。浸提結束后，取出冷卻至室溫。經過濾后，用70%乙醇稀釋濾液至適當倍數，以70%乙醇為對照，在505 nm下測定吸光度值，根據吸光度值計算色價。色價計算公式為色價=吸光度值×稀釋倍數。

1.4.6 淀粉酶活性檢測

根據淀粉酶試劑盒說明書分別處理說明書中的試劑一、試劑二和制備10 mg·mL-1葡萄糖標準液，然后將葡萄糖標準液用蒸餾水稀釋為1.000 00 mg·mL-1、 0.200 00 mg·mL-1、0.100 00 mg·mL-1、0.050 00 mg·mL-1、0.025 00 mg·mL-1、0.012 50 mg·mL-1和0.006 25 mg·mL-1的標準溶液，制作標準曲線。取兩支EP管分別加入250 μL淀粉酶原液和淀粉酶稀釋液，沸水浴5 min，分別作α-淀粉酶和β-淀粉酶對照管，并依次加入MN-1、MN-2、MN-3這3種菌液，于540 nm處測定吸光度值。

α-淀粉酶活性計算公式為

式中：x1為α-淀粉酶濃度，mg·mL-1；x2為總淀粉酶濃度，mg·mL-1；W為樣品重量，g。

2 結果與分析

2.1 不同產品中紅曲霉菌落形態差異性比較

由圖1可知，在3種紅曲霉菌株中，MN-1菌落形態為棉絮狀，氣生菌絲發達，呈放射狀，在培養至第8 d時，平板中產生大量色素，且中間凸起有褶皺，邊緣整齊，菌落直徑可達69 nm；MN-2菌落形態為棉絮狀，氣生菌絲較為發達，呈放射狀，在培養至第8 d時，平板中產生大量色素，中間凸起，邊緣整齊，菌落直徑可達57 mm；MN-3菌落形態為棉絮狀，氣生菌絲較為發達，呈放射狀，在培養至第8 d時，平板中產生色素，中間凸起，邊緣整齊，菌落直徑可達49 mm；因此，在相同的培養時間下，菌株MN-1生長較好。

圖1 不同產品中紅曲霉菌落形態

2.2 不同產品中紅曲霉色素含量的測定

對于紅曲霉色素的產生，現已有研究表明，紅曲霉產生的色素有非水溶性和水溶性兩種。非水溶性色素為胞內累計，存在于菌絲內，需用有機溶劑進行提??；水溶性色素為胞外蓄積，存在于發酵液中。當色素吸收波長在410 nm時定義為黃色素，在470 nm時定義為橘色素，在510 nm時定義為紅色素。根據1.4.5方法，測定3種品牌中紅曲霉產色素含量的差異。由表1可知，在所測胞外色素含量中，MN-2菌株生成的色素含量最高，色價為9.61 U·mL-1；其次為MN-1菌株，生成的色素色價為8.53 U·mL-1；菌株MN-3生成的色素量最低，色價為6.44 U·mL-1。在所測胞內色素含量中，MN-2菌株生成的色素含量最高，色價為8.71 U·mL-1;其次為MN-1菌株，生成的色素色價為8.42 U·mL-1；色素生成量最低的為菌株MN-3，色價為6.12 U·mL-1。經過整體分析可知，色素含量最高的菌株為MN-2，其色價為18.32 U·mL-1。

表1 不同產品中紅曲霉吸光度值和色價的測定

2.3 淀粉酶溶液標準曲線的繪制

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，是目前發酵工業上應用最廣泛的一類酶。通過采用1.4.6方法，制作淀粉酶標準曲線，結果如表2所示。

根據表2結果，以淀粉酶標準溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制溶液標準曲線。結果表明，淀粉酶標準品回歸方程為Y=0.347 7X+0.034 1，相關系數r=0.999 4。因此，淀粉酶標準溶液在0.006 25～1.000 00 mg·mL-1線性關系良好，可用于后續淀粉酶濃度的計算。

表2 淀粉酶標準樣品的吸光度值

2.4 不同產品中紅曲霉淀粉酶活性含量的測定

紅曲霉在生長過程中可代謝產生淀粉酶、糖化酶等酶活力，通過采用1.4.6方法，測定MN-1、MN-2和MN-3中紅曲霉在波長540 nm下的吸光度值，根據1.4.6中的公式計算淀粉酶活性，結果如表3所示。

表3 不同產品中紅曲霉淀粉酶活性

由表3可知，在測定的3種紅曲產品中，α-淀粉酶活性產量最高的菌株為MN-1，其淀粉酶活性為10.8 U·g-1；β-淀粉酶活性產量最高的菌株MN-3，淀粉酶活性為13.5 U·g-1；總淀粉酶活性最高的菌株為MN-1，總淀粉酶活性為22.6 U·g-1，菌株MN-2總淀粉酶活性最低。

3 結論

通過采用分光光度法和淀粉酶試劑盒法，對3種紅曲霉產品進行色素含量和淀粉酶活性的測定。結果表明，在選取的3種產品中，色素含量最高的菌株為MN-2，最低的為菌株MN-3。α-淀粉酶活性最高的菌株為MN-1，β-淀粉酶活性最高的菌株為MN-3，總淀粉酶活性最高的菌株為MN-1。因此，在生活中，如需選擇紅曲霉產品用作食品著色劑時，可選擇菌株MN-2；如需選擇紅曲霉提高白酒釀造過程中的原料出酒率，則可以選擇菌株MN-1。本實驗的開展不僅可以豐富紅曲霉理論研究知識，還可為紅曲霉在食品和工業上的應用提供參考，具有實際意義。