石金錢龜板來源的寡肽與環氧合酶-2相互作用機制

閆佳興，張久亮

華中農業大學食品科學技術學院/環境食品學教育部重點實驗室，武漢430070

環氧合酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）和環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是2 種同工酶，COX-1 在健康組織中表達維持機體的正常運轉，而COX-2 幾乎只在組織受到傷害刺激后才大量表達，參與炎癥和疼痛等過程［1］。特異性抑制COX-2 可有效阻止炎癥和疼痛反應，常用的COX-2 抑制劑包括布洛芬和對乙?；椒拥?，但這些藥物對胃腸道、心血管、腎臟、肝臟等器官可能造成一定程度的損害，尤其是胃腸道損傷最為常見［2］。嚴重的不良反應已經導致了羅非昔布與依托昔布的退市［3］。因此，目前亟需尋找新型的COX-2抑制劑。

石金錢龜是一種淡水龜，主要分布在日本、越南和中國中南部，是一種高價值的功能性食品［4］?！侗静菥V目》和近期研究均表明，一些龜板提取物具有良好的抗氧化、抗炎和消腫止痛等作用［5-6］。其他研究表明有脯氨酸或精氨酸殘基的寡肽除具有良好活性外還具有抗酶解特性［7］，可通過胃腸道吸收入血液循環，進而對相關疾病靶點起作用［8-9］。因此，人們對天然產物中寡肽的研究和開發越來越重視。筆者所在研究團隊前期已證明石金錢龜板來源的肽為2～9 個氨基酸殘基的具有良好抗氧化、抗炎等活性的寡肽［10-11］，尤其其中的合成寡肽單體分子KNGP 含脯氨酸殘基、RG 含有精氨酸殘基，可能具有優良的抗酶解特性和更高的吸收效率。然而，龜板肽對抗炎靶點之一COX-2 的潛在抑制作用及其機制尚不明確。

因此，本研究利用團隊前期以石金錢龜來源的龜板肽［10］和合成寡肽單體分子（KNGP 和RG）進行抑制試驗，并利用熒光光譜和分子對接探究KNGP對COX-2的抑制機理，分析寡肽KNGP對COX-2的抑制作用和構效機制，旨在為探究寡肽分子的抗炎作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1）材料。石金錢龜板肽（yellow pond turtle peptides，YPTP）（肽含量72.16%）由筆者所在研究團隊前期制備［10］，試驗中所使用石金錢龜板的肽段?ys-Asn-Gly-Pro（KNGP）和Arg-Gly（RG）的結構為團隊前期鑒定［10］，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，純度大于98%。

2）試劑。試驗中所使用的試劑均為分析純，所使用水為去離子水。COX-2（美國Sigma-Aldrich 公司），8-苯胺基萘-1-磺酸（美國Sigma-Aldrich 公司），花生四烯酸（AA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），N，N，N，N-四甲基對苯二胺鹽酸鹽（TMPD，上海源葉生物科技股份有限公司），正鐵血紅素（Hematin，豬，美國Sigma-Aldrich 公司），Tris（北京蘭杰柯科技有限公司），氫氧化鉀和二甲基亞砜（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

KNGP 的結構用ChemDraw 7.0 軟件繪制。KNGP 與COX-2 的分子對接選擇Discovery Studio 2018 軟件（華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室）。紫外可見分光光度計（日本島津公司），熒光光譜儀F-4600（日本Jasco公司）。

1.3 IC50值的測定

根據Shang 等［12］和曹艷花等［13］報道的方法進行適當的修改。首先，用0.1 mol/?的Tris-HCl 緩沖液（pH 7.8）將COX-2稀釋制成25 U/m?溶液。設置樣品組、樣品對照組、空白對照組和空白背景組，樣品對照組是以緩沖溶液代替樣品溶液，空白對照組是以緩沖溶液代替酶，空白背景組以緩沖溶液代替樣品和酶。將140 μ?的緩沖溶液、20 μ?的COX-2 溶液、10 μ?Hematin（2.5%）分別與不同濃度的樣品混合均勻，在25 ℃下孵化5 min。隨后，添加10 μ?的21 μmol/?的N，N，N，N-四甲基對苯二胺鹽酸鹽（TMPD）和100 μmol/?花生四烯酸（AA）來啟動反應。在25 ℃下反應20 min 后，使用紫外可見分光光度計在590 nm 處記錄吸光度值。所有試驗重復3次。用式（1）計算抑制率：

式中，Dcontrol是空白對照組的吸光度；Dcontrolblank是空白背景組的吸光度；Dsample是樣品組的吸光度；Dsampleblank是樣品對照組的吸光度。最后，利用SPSS 26.0 對得到的數據進行非線性回歸分析得到半數抑制濃度（IC50）值。

1.4 內源熒光光譜測定

蛋白質中由于氨基酸殘基色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的存在而具有內源熒光［14］，進行熒光猝滅試驗可以獲得KNGP與COX-2之間的結合機制、結合位點、結合力和熱力學參數等相互作用的特征［15-16］。使用Stern-Volmer 方程分析熒光猝滅數據，以研究其猝滅類型［17-18］。

基于KNGP 對COX-2 是靜態猝滅的結果，我們假設KNGP 能與COX-2 的活性位點結合形成配體-蛋白質的基態配合物，根據文獻［17-18］中的公式計算配合物的結合位點數（n）和表觀結合常數（Ka），Ka值越大，配合物的緊密程度和穩定性越強［17-18］。

熒光猝滅分為靜態猝滅和動態猝滅2 種方式［19-20］。當猝滅類型是靜態猝滅時，KNGP 與COX-2 的結合過程依賴于靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用和范德華力等。根據上述3 個溫度下的Ka值，采用Van't Hoff 方程求得焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和自由能變化（ΔG）［21］。

當ΔH＜0、ΔS＜0 時，主要驅動作用是氫鍵；當ΔH＞0、ΔS＞0時，主要驅動作用是疏水相互作用；當ΔH＜0、ΔS＞0 時，主要驅動作用是靜電作用［22-23］。在200 μ?的反應體系中，加入150 μ?溶解于Tris-HCl 緩沖液（pH 7.8）的COX-2（10 U/m?），之后分別逐次加入50 μ?的IC50值最低的肽段（KNGP）溶液，分別控制終濃度為0.00～0.50 mmol/?。然后采用F-4600 熒光光譜儀測定各樣品的內源熒光光譜。其中，設置激發波長280 nm，發射波長350～500 nm，狹縫寬度設定為5 nm，掃描速度設定為1 200 nm/min，電壓設定為700 V。所有測定均重復3次。

1.5 同步熒光光譜測定

當同步熒光的波長間隔（Δλ）設置為15 和60 nm時，可以分析COX-2 中的酪氨酸和色氨酸殘基的光譜變化，從而闡明COX-2 的構象變化［24］。按照本文“1.4”的試驗方法（溶液的量與濃度相同）在298 K 下進行同步熒光光譜的測定。分別設定Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm，狹縫寬度設定為5 nm，掃描速度設定為1 200 nm/min，電壓設定為700 V，進行同步熒光光譜掃描。所有測定均重復3次。

采用文獻［25］中的公式計算KNGP對COX-2的同步熒光猝滅率（ratio of synchronous fluorescence quenching，RSFQ）。

1.6 三維熒光光譜測定

利用三維熒光光譜可以分析KNGP對COX-2構象的影響［24-25］。按照本文“1.4”的方法制備COX-2溶液與KNGP 溶液。在室溫條件下，將樣品稀釋至200 倍后，以200 nm 為起始激發波長，200～500 nm為連續掃描記錄發射波長，狹縫寬度設定為5 nm，掃描速度設定為1 200 nm/min，電壓設定為700 V。所有測定均重復3次。

1.7 表面疏水性的測定

8-苯胺基萘-1-磺酸（8-anilino naphthalene-1-sulfonic acid，ANS）是一種疏水性探針，能在與蛋白質的表面疏水基團相互反應時，增強其熒光光度值，可以常用來反映表面疏水性的變化［26］。表面疏水性的變化通常反映酶的構象變化［27］。將按照本文“1.4”方法制備的COX-2 溶液與KNGP 溶液，混合均勻后靜置10 min，加入10 μ?的0.10 mmol/?的ANS 溶液，在298 K 下避光20 min。設定激發波長390 nm，發射波長420～570 nm，激發狹縫5.0 nm 和發射狹縫2.5 nm。分別以相對應的KNGP-緩沖溶液體系的熒光發射光譜作為空白背景信號。所有測定均重復3次。

1.8 分子對接

分子模擬對接是研究分子之間特別是生物分子復合物（如藥物與受體）之間相互作用的一種有效方法，它能獲得配體和受體結合構象、位點和作用力等信息［28］。本研究分子對接過程和結果分析均采用Discovery Studio 2018 軟件進行。COX-2（PDB ID：3NT1）的晶體結構取自Protein Data Bank 蛋白質數據庫，KNGP肽段的結構由ChemDraw 7.0，軟件繪制好的結構導入Discovery Studio 2018 軟件中，利用Small Molecules 模塊下Prepare ?igands 工具處理。分別利用Discovery Studio 2018 對COX-2 進行去水與加全氫等預處理。分子對接結果的ROC曲線圖可以分析分子對接的打分函數，X軸越接近零，準確率越高；Y軸越大代表準確率越好。曲線越接近左上角（X越小，Y越大），即曲線下面積越大，預測準確率越高［29］?；谂c參考文獻［30］對比結合酶的配體位置獲得對接位點的信息。COX-2 的活性位點由Arg120、Glu524 和Tyr355 三個氨基酸殘基組成，活性位點周圍還包括有一些氨基酸殘基如：?ys83、Tyr115、Ser119、Val89、Pro86、?eu93、?eu123［31］。隨后利用CDOCKER 對接方法對接，其他參數采取默認值，根據結合能大小對結果進行排序和可視化分析。

1.9 數據統計與分析

本試驗每組數據均做平行重復試驗3 次，以“平均值±標準差”表示。利用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著。采用Origin 8.0、Discovery Studio 2019 等軟件繪圖與熒光光譜數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同樣品的IC50值分析

3 種寡肽樣品（石金錢龜板肽YPTP、合成肽段KNGP 和RG 樣品）對于COX-2 的抑制率如圖1 所示，由非線性回歸分析得到3種寡肽樣品和陽性藥布洛芬的IC50值，分別為0.609、0.046、0.056 和0.217 mg/m?。其大小排序為KNGP＜RG ＜陽性藥布洛芬＜石金錢龜板肽YPTP（72.16%）。這些樣品中KNGP 的IC50值最小，表明KNGP 對COX-2 具有極顯著的抑制潛力。因此，選用KNGP 進行后續的熒光光譜試驗，探究肽段KNGP對COX-2的抑制機制。

2.2 內源熒光光譜分析

1）熒光猝滅分析。圖2 所示為KNGP 與COX-2在298 K 下的熒光發射光譜。隨著KNGP 濃度的增加，COX-2的熒光強度減小，表明COX-2發生熒光猝滅現象。從而表明KNGP與COX-2之間發生了相互作用，使得酶的微環境發生了變化。如圖3 所示，在不同溫度（298、304、310 K）下擬合的曲線為線性，表明由KNGP 造成COX-2 的熒光猝滅類型是單一的。如表1 所示，由斜率可計算出Kq值，YPTP 對于COX-2的不同溫度的Kq值分別遠大于最大擴散碰撞猝滅常數［2.0×1010?/（mol·s）］，呈現出靜態猝滅的特征；同時，隨著溫度升高（298、304 和310 K）導致KNGP-COX-2 復合物的猝滅常數（Ksv）降低（分別為2.09×104、1.51×104和1.31×104?/mol），即溫度越高，配合物的穩定性降低，呈現出靜態猝滅的特征，所以YPTP對COX-2的熒光猝滅方式為靜態猝滅。

表1 不同溫度下KNGP對COX-2的猝滅常數Table 1 Quenching constants of KNGP on COX-2 at three temperatures

2）結合常數和結合位點。如圖4 所示，lg［（F0-F）/F］與lg［Q］擬合的298、304 和310 K 溫度下的雙對數回歸曲線是線性的。不同溫度下計算結果見表2。不同溫度下COX-2的n值接近1，這意味著COX-2 上僅存在單一結合位點供KNGP 結合。此外，COX-2 和KNGP 在不同溫度下的Ka值分別為4.3×104、7.5×104和12.5×104?/mol。隨著溫度升高，配合物Ka值變大，這反映出KNGP 和COX-2 相互作用的穩定性升高。

表2 不同溫度KNGP對COX-2的結合常數和結合位點數Table 2 Binding constant and binding number of KNGP on COX-2 at three temperatures

3）熱力學參數特征。表3 列出了KNGP 和COX-2的熱力學參數。KNGP與COX-2相互作用的ΔH和ΔS均為正值，表明結合過程中疏水作用是主要驅動作用。ΔS＞0 和ΔG＜0，表明KNGP 與COX-2之間的相互作用是熵驅動的自發過程。

表3 不同溫度KNGP對COX-2的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters of KNGP on COX-2 at three temperatures

2.3 同步熒光光譜分析

在KNGP 存在下COX-2 的同步熒光光譜如圖5所示。在Δλ=15 nm 時（圖5A），KNGP 濃度的增加導致COX-2 中酪氨酸殘基的熒光強度降低，證實了熒光猝滅現象，且最大發射波長從285.6 nm 藍移到284.4 nm，表明加入KNGP 使得COX-2 的酪氨酸殘基周圍的疏水性增強，極性減弱。如圖5B 所示，色氨酸殘基的熒光強度降低，同樣證實了熒光猝滅現象，其最大發射波長從280.6 nm 藍移到279.2 nm，同樣地表明色氨酸殘基所處微環境的疏水性增強，極性減弱。酪氨酸殘基和色氨酸殘基的微環境變化一致，進一步計算2 種氨基酸殘基的同步熒光猝滅率（RSFQ），比較具體結合位點與2 種殘基的相對位置。

KNGP 對COX-2 的RSFQ 曲線如圖6 所示，在0.09、0.19、0.28、0.38 mmol/?4種濃度的情況下酪氨酸的RSFQ 值大于色氨酸的RSFQ，說明酪氨酸殘基在KNGP 引起COX-2 的熒光猝滅中貢獻較大。因此，在與COX-2的結合過程中，KNGP 結合位置可能更接近酪氨酸。

2.4 三維熒光光譜分析

KNGP-COX-2配合物的三維熒光等高線圖如圖7 所示。峰a 為瑞利散射峰（λem=λex），峰1 為酪氨酸和色氨酸殘基的特征峰，峰2 主要為COX-2 中氨基酸π→π*躍遷引起的特征峰。如圖7A、7B，對于COX-2，加入KNGP 后峰1 熒光強度從335.8 下降到52.52，峰位置發生了約10 nm 的輕微藍移，表明KNGP 與COX-2 結合位點靠近酪氨酸殘基，KNGP與酶相互作用后蛋白質周圍微環境疏水性增強，極性減弱。同時，峰2 的熒光強度也有所降低，熒光強度從186.0 下降到29.41，表明KNGP-COX-2 復合物的形成可能影響蛋白質的二級結構，并導致COX-2構象的松散。

2.5 表面疏水性變化分析

KNGP對COX-2表面疏水性的影響通過COX-2中ANS 熒光強度變化來表示。如圖8 所示，KNGP的加入導致COX-2的表面疏水性降低。KNGP 可能與COX-2 的活性位點的親水基團相互作用，導致酶活性位點內的疏水性基團暴露，從而引起COX-2 表面的親水基團暴露，使得COX-2的構象發生變化，抑制底物與COX-2的結合。

2.6 分子對接結果

1）分子對接ROC 曲線分析?；赗OC 曲線（圖9）比較，可以看到-CDOCKER ENERGY（-ECD）曲線下面積最大，證實負的受體-配體間的總能量-ECD和負的受體-配體相互作用能量-CDOCKER INTERACTION ENERGY（-IECD）能夠較好地區分活性和非活性分子，可以作為此次分子對接的打分函數，且-ECD更能較好地體現分子的活性。其最終計算結果，對應-ECD值越高，說明受體與配體間的總能量越低，對接體系越穩定。

2）分子對接函數打分結果。本研究采用CDOCKER 分子對接模式進行模擬，通過模擬退火得到了KNGP、陽性對照（布洛芬和對乙酰氨基酚）的多個可能的構象，從中選擇其中總能量最低的模擬結果進行分析和比較。如表4所示，在模擬對接的KNGP、布洛芬和對乙酰氨基酚的-ECD 打分分別為250.44、117.25和61.53 kJ/mol，反映出的相互作用強度由大到小排列為KNGP ＞布洛芬＞對乙酰氨基酚?？梢钥闯?，KNGP 對COX-2 的抑制作用好于陽性藥物對照布洛芬和對乙酰氨基酚。表明KNGP 可能有很好的COX-2抑制活性。

表4 KNGP、陽性對照（布洛芬和對乙酰氨基酚）與COX-2的對接打分結果Table 4 Results of molecular docking between KNGP，positive controls（ibuprofen and acetaminophen）and COX-2

3）分子對接可視化分析。分子對接的可視化結果如圖10A 所示，KNGP 寡肽能對接到COX-2 活性位點內，其ECD 值和IECD 值分別為-250.44和-201.59 kJ/mol，表明KNGP 與COX-2 活性位點能更好地結合。同時，2D 圖（圖10B）提供了KNGP與特定氨基酸殘基相互作用的詳細信息。KNGP 與COX-2 的氨基酸殘基Arg216（2.80、2.37 和1.96 ?）、Asp239（2.07、2.50 ?）、Glu140（2.54 ?）、Tyr147（2.12 ?）、?eu238（2.87 ?）和Ser143（1.83 ?）相互作用形成了9 個氫鍵，其吡咯烷結構與Phe220 形成疏水作用。此外，分子與蛋白殘基Glu140 還存在靜電相互作用（鹽橋和電荷吸引），與Ser143、Asn144、Thr237、His133形成范德華力，這些相互作用加強了其結合穩定性，也證明了KNGP-COX-2 配合物結合后的主要作用力是氫鍵。上述研究結果說明KNGP有望成為COX-2 分子的抑制劑?？傊?，KNGP 主要由NH基團、C=O結構、吡咯與酶活性中心的氨基酸殘基相互作用形成氫鍵和疏水作用，并且能與活性中心附近的氨基酸殘基結合形成靜電作用增強結合的穩定性。結合熒光光譜試驗的熱力學參數分析，表明KNGP-COX-2 配合物形成過程的驅動力為疏水作用，而KNGP-COX-2 配合物形成后的主要作用力是氫鍵。

3 討論

根據KNGP 對COX-2 熒光猝滅數據的分析，KNGP 對COX-2 的熒光猝滅機制為靜態猝滅，即KNGP 可能與COX-2 的單一位點結合形成配合物，導致熒光猝滅作用。COX-2 和KNGP 在298 K（4.3×104?/mol）、304 K（7.5×104?/mol）和310 K（12.5×104?/mol）下作用的Ka值大于新型芳基異丙酸類化合物（3.08×104、3.92×104和5.40×104?/mol）［22］，同時，COX-2 和KNGP 的Ka值在104～105，與保泰松（1.95×104、1.25×105、9.82×104?/mol）和布洛芬（1.19×104、2.13×105和8.09×104?/mol）的Ka值相似［32］。Ka值越大，配合物的緊密程度和穩定性越強［18］。由此可見，KNGP-COX-2的配合物有很強的結合力和穩定性，因此，KNGP 對COX-2 活性的抑制作用較強。不僅如此，隨著溫度升高，配合物Ka值變大，這反映出KNGP 和COX-2相互作用的穩定性升高［25］。進一步計算得到熱力學參數特征，其結果ΔH＞0（ΔH=6.85×104kJ/mol）、ΔS＞0（ΔS=2.42 ×102J/（mol·K））、ΔG＜0（ΔG=-3.60×103kJ/mol（298 K）、ΔG=-5.05×103kJ/mol（304 K）、ΔG=-6.50×103kJ/mol（310 K）），表明結合過程中疏水作用是主要驅動作用，且是熵驅動的自發過程［22-23］。與我們的研究結果略有不同，其他研究報道了疏水相互作用力和靜電作用力是形成抗炎藥-酶復合物的主要驅動力，且是自發和焓驅動的過程，如新型芳基異丙酸類化合物［22］、棉酚［15］等。這意味著相互作用的驅動力可能隨抑制劑的結構變化而變化。同步熒光和三維熒光光譜分析表明在與COX-2 的結合過程中，KNGP 結合位置可能更接近酪氨酸，而在保泰松和布洛芬與酶的結合位置可能更接近色氨酸［18，33］，這表明結構不同的抑制劑對活性位點氨基酸殘基的影響會有差別。與侯利杰等［18］在保泰松和孫艷濤等［33］在布洛芬與酶相互作用的報道中一致，KNGP-COX-2 配合物的形成會影響酪氨酸和色氨酸殘基的微環境，使二者周圍的疏水性增強。ANS 熒光探針法結果表明KNGPCOX-2 配合物的形成導致COX-2 的表面疏水性降低，說明KNGP 可能引起COX-2 的結構變化從而導致活性降低。表面疏水性的變化為KNGP 引起COX-2 的結構變化從而導致活性降低的機制提供了更多的證據。綜上所述，本研究揭示了KNGP 對COX-2的作用機制是與COX-2的單一位點通過氫鍵和疏水相互作用結合形成復合物，可為寡肽段KNGP 作為潛在的COX-2 抑制劑提供理論基礎，且本研究中肽段KNGP 由于含有脯氨酸殘基而具有抗酶解吸收的特性，因此，以KNGP 作為研究對象是十分有意義的。