不同基因型小米辣秧苗根際細菌群落特征分析

王燦，屈用函，王紹祥，趙強彪，謝志強，張雪廷

（文山州農業科學院，云南 文山 663000）

隨著植物根際微生物組（rhizosphere microbiome）研究的開展，根際微生物研究新技術新方法、根際促生菌資源篩選與應用、植物/微生物互作信號與調控機制、根際微生物與植物逆境響應機制、根際微生物與耕作土壤修復、根際微生物與植物生長發育等已成為研究的熱點，同時也為綠色農業發展、環境生態保護提供理論指導和技術支撐［1-3］。根際微生物和植物息息相關、密不可分，研究表明植株通過根系向土壤中分泌糖類、氨基酸、酶類、酚酸類、有機酸、生長因子、抗菌物質等來影響根際周圍的土壤微生物環境［3-5］，選擇性“招募”對自己有益的微生物來協助自身生長發育和抵御各種非生物因素干擾及生物脅迫。

文山州地處云南邊界，位于云南省東南部低緯度高原地區。作為云南最大的辣椒種植地，文山州具有豐富多樣的辣椒種質資源［6］。小米辣（Capsicum frutescensL.）是茄科辣椒屬一年或多年生灌木狀辣椒（冷涼地區1年生，熱區多年生），主產于中國西南邊陲，含有豐富的礦質元素和微量元素，具有獨特芳香和辛辣味，深受當地人民喜愛。育種者也培育出了一些耐瘠、耐旱、株型大、豐產的優良小米辣新品種［7］。但目前與辣椒相關的研究主要集中于1年生辣椒（Capsicum annuumL.）如朝天椒等，與小米辣相關的研究卻鮮有報道。為促進小米辣育種與栽培工作，本研究采用16S rDNA對本地小米辣根際土壤細菌群落組成進行擴增子測序，旨在探明不同品種小米辣根系分泌物對其根際細菌群落定植的影響，分析之間群落結構差異，為小米辣生長地下部分與微生物的互作關系、根際細菌指示物種分析、篩選研究奠定基礎。這對于了解不同環境下土壤微生物多樣性與種植環境的相關性，確定小米辣根系分泌物調節微生物群落構建的主要因素等工作具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

灌木辣椒（Capsicum frutescensL.）本地野生品種小米辣‘M218’（X處理）和人工選育品種小米辣‘M240’（Y處理）由文山州農業科學院張雪廷老師提供（圖1）。育苗基質為‘湘正農科’牌商品育苗基質，由湖南農業大學湘暉農業技術研究所研制，主要成分是草炭土。土 壤 基質性質如下：堿解氮（92.30±0.39）mg/kg、速效磷（54.56±0.45）mg/kg、速效鉀（938.72±0.11）mg/kg、碳 氮 比1.47±0.55、pH5.28±0.030、EC值（712.67±0.17）μs/cm。

圖1 辣椒試驗材料果實表型示意圖

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗及樣品采集

試驗地點為文山州農業科學院，時間為2021年9月至2022年5月。試驗共2個處理，每個處理3次重復，每盤為一次生物學重復，分別是小米辣‘M218’（X處理）和小米辣‘M240’（Y處理）。

將發芽整齊一致的辣椒種子播種于苗盤（27孔）中進行盆栽試驗，常規管理育苗。苗齡為70 d時，采用5點取樣法選取植株，將植株整株拔出，抖落附著土壤基質后用單獨無菌刷刷取粘附在根表面的土壤基質，各處理的5棵苗混合為1次重復后放入50 mL無菌離心管中，迅速置于干冰中保存運輸，后放入-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 測定項目

使用Magen核酸提取試劑盒（MagPure Soil DNA KF Kit），Equalbit dsDNA HS Assay Kit檢 測DNA濃 度。以20—30 ng DNA為 模 板，由GENEWIZ,Inc（South Plainfield，NJ）公司完成二代測序文庫構建和測序。16S rDNA上包括V3及V4的2個高度可變區，通過Illumina MiSeq進行雙端測序。引物系列如下：

1.2.3 數據質控與分析

原始數據整理采用Office 2019軟件。測序數據質量優化使用Cutadapt 1.9.1、Vsearch 1.9.6、Qiime 1.9.1。作 圖 采 用GraphPad Prism 9.0、Office 2019。測序數據優化后質量見表1。

表1 測序數據質量

2 結果與分析

2.1 根際細菌群落結構分析

從圖2a可以看出，共有OTU數為379個，其中‘M218’獨有OTU為3個，‘M240’獨有的OTU為1個。門水平下共獲得13個物種種類（圖2b），第一大優勢菌群是變形菌門（Proteobacteria），各樣本中分別占61.29 %和63.76 %，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes），各樣本中分別占13.55 %和12.08 %。放線菌門（Actinobacteriaz）中‘M218’和‘M240’分 別 是6.17 %和5.68 %。屬水平下（圖2c），鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是第一大優勢菌屬，但‘M218’（14.88 %）高于‘M218’（7.11 %）。說明種植不同辣椒品種對其根際微生物群落物種豐度存在一定的影響差異。

圖2 不同樣本細菌群落結構描述

2.2 根際細菌群落多樣性分析

α多樣性 比 較中，Ace和Chao1是 反 映菌群豐富度的指標，數值越小表明豐富度越低。Shannon、Simpson是反映菌群多樣性的指標，其數值越小表明群落多樣性越低。X處理和Y處理均無顯著差異，說明小米辣‘M218’和‘M240’的根際細菌群之間無明顯差異（表2）。

表 2 不同樣品細菌菌多樣性指數

但在基于Unifrac距離PCoA分析（Adonis：R2=0.319，P=0.031）中，兩個處理間差異顯著，圖中樣本點距離的遠近代表了樣本中微生物群落的相似性，距離越近相似度越高。第一主坐標對樣本差異的貢獻率為41.96 %，第二主坐標對樣本差異的貢獻率為25.99%；且第一主坐標將X處理與Y處理分離。表明‘M218’和‘M240’兩者的群落相似度有顯著差異（圖3）。

圖3 基于Unifrac距離PCoA分析

2.3 群落根際微生物功能預測

基于COG數據庫PICRUSt2功能預測結果表明，25個功能基因家族中除去S類（未知功能），E類（氨基酸轉運和代謝）、C類（能量產生和轉換）、M類（細胞壁、細胞膜和膜結構的生物合成）、J類（翻譯、核糖體結構和生物發生）豐度值占比較高（圖4）。在這些功能基因家族中，X處理比Y處理豐度值較高，說明種植小米辣‘M218’相較‘M240’其根際細菌群落具有較高的生命活動，對根際細菌群落的生命活動具有誘導和促進作用。

圖4 細菌菌群COG功能預測

3 討論

根際微生物作為植物根際生態系統的參與者，在能量代謝、生物群落構建、生態系統穩定、協同植物生長發育、環境適應機制、抗病蟲害等方面發揮重要作用［8］。研究表明，不同基因型品種的作物對根系微生物組成有一定的影響。如李增強等［9］通過磷脂脂肪酸（PLFA）聯合13CO2標記技術研究不同玉米品種的根際微生物群落結構發現，相較于陜丹8806玉米品種，鄭丹958玉米品種的根際細菌和真菌的PLFA-C含量顯較高。Marques等［10］發現，相較于高淀粉基因型馬鈴薯，低淀粉基因型馬鈴薯根際環境中鞘脂菌屬（Sphingobium）、Pseudomonas、不動桿菌屬（Acinetobacter）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）的相對豐度顯著增加。

課題組通過對兩個不同基因型小米辣品種根際細菌群落分析發現，從門水平結構組成上看，第一大優勢菌群是變形菌門（Proteobacteria），其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteriaz）。屬水平下，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是第一大優勢菌屬，但‘M218’的豐度（14.88 %）高于‘M240’（7.11 %）。雖然在α多樣性分析中兩者間無顯著差異，但在PCoA分析中，兩個小米辣品質對其根際微生物群落組成和物種豐度存在著一定影響差異。表明‘M218’和‘M240’根系分泌物可能對其根際土壤細菌群落結構多樣性沒有顯著的影響，但在群落豐度上影響顯著?？赡苁瞧贩N間根系分泌物中次生代謝產物（主要包括糖類、氨基酸、有機酸和黃酮類等）的濃度有明顯差異［11］引起的。這與前人結果一致，種植作物本身通過根系分泌物的濃度和種類改變根際土壤微生物群落結構、優勢菌屬及物種豐度［12-13］。

基于COG數據庫預測表明，小米辣‘M218’樣本功能豐度明顯高于‘M240’，其次在新陳代謝方面如氨基酸代謝（amino acid metabolism）和碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）豐度值明顯較高，說明小米辣‘M218’可能對其根際細菌群落的生命活動具有較強誘導和促進作用，這可能是品種間基因差異所致，不同基因型植物在生物合成代謝途徑、運輸和分解中存在差異，這導致其相關分泌物的種類和濃度也存在顯著差異，從而間接對根際微生物活動產生一定的調控影響［14］?，F有研究表明，碳水化合物、氨基酸、黃酮類和酚酸類等物質均可對根際微生物群落組成產生顯著影響，是影響根際微生物群落形成的驅動力［15-16］。Liu等［17］研究發現，花生根系分泌物中的苯甲酸可增加根際土壤中伯克霍氏菌（Burkholderiaspp.）的相對豐度。試驗中小米辣‘M218’為地方原始野生品種，而‘M240’是通過人工選育出的栽培品種。在育種進程中，為了得到某些既定的育種目標，使得一些物種特有的基因被篩選而逐步丟失，導致其多樣性降低，某些代謝調控途徑缺失等［18］。這是否是導致人工選育出的栽培品種根際細菌群落及功能豐度值較低的原因還需要進一步研究。因此下一步可對根系分泌物進行檢測，分析其中種類和濃度差異，并通過合成調控路徑尋找相關的基因，為本地辣椒特有基因挖掘、特有微生物介導作物生長、耕作土壤生態改良等提供研究基礎。

4 結論

綜上，本地小米辣‘M218’與人工選育的品種‘M240’相比，其根際細菌群落豐度和功能基因豐度存在顯著的差異。這可為地方品種選育、挖掘野生小米辣特有基因功能、小米辣生長與微生物協同機制、指示微生物功能研究起到積極作用。