辣木葉總黃酮對小鼠潰瘍性結腸炎防治作用的研究

彭偉龍，HOSAMELDEEN Mohamed Husien,2，伯若楠，劉明江，楊海峰，李金貴

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇省高校動物重要疫病與人畜共患病防控協同中心，揚州 225009；2.布爾塔那大學獸醫學院，Rufaa 999129；3.江蘇農牧科技職業學院，泰州 225300)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種發生在人、犬、貓等物種中的非特異性、復發性結腸炎癥疾病[1]。由于高脂飲食和不規律的生活作息，UC在發達國家人群發病率超過0.3%[2-3]，據統計，近三十年中國UC發病率增加了近3倍[4]。目前UC的病因尚未完全闡明，但普遍認為其發病原因是基因、腸道菌群、宿主免疫和環境等多種因素造成的[5]。王瑞生等[6]研究表明，UC發病機制與腸屏障功能障礙和免疫異常密切相關。當腸黏膜屏障受損，腸道內有害菌及其代謝產物內毒素(LPS)進入血液，加劇機體炎癥反應，上調白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)等促炎因子的表達，此類因子激活后可與相應腸上皮細胞表面特異性受體結合，通過Caspase級聯反應引起腸上皮細胞的異常凋亡，進而導致腸黏膜相關細胞數量變少[7]。同時，閉鎖連接蛋白-1(ZO-1)和閉合蛋白(Occludin)等緊密連接蛋白與腸上皮細胞是腸黏膜屏障的關鍵組成部分，當腸上皮細胞數量減少時，緊密連接蛋白分泌量下降[8]，進而導致腸屏障功能障礙。這提示針對炎性因子和腸黏膜屏障進行干預是防治UC的有效靶點。

辣木(Moringaoleifera)原產于印度，于2012年被中國衛生部批準認定為新資源食品，也是中國藥食兩用的食品資源，與靈芝和西洋參并稱“世界三寶”[9]，近年來大面積種植于中國云南地區。辣木葉在印度傳統醫學中主要用作消炎止痛藥物，辣木葉膏藥在印度被用來治療腮腺炎[10]，其水提取物在角叉菜膠誘導的大鼠足腫脹模型中有顯著的抗炎和鎮痛效果[11]。辣木葉中的主要活性成分是硫苷和黃酮[12]，并且黃酮類成分發揮著顯著的抗炎效果[13]，但辣木葉對腸炎的防治效果卻鮮有報道。本試驗以葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的UC小鼠為模型，提取辣木葉總黃酮(Moringaoleiferaleaf flavonoids，MOLF)作為防治藥物，通過對小鼠一般癥狀觀察、測定血清與組織中炎性因子含量、檢測腸黏膜蛋白表達量和腸上皮細胞凋亡蛋白表達情況來綜合評估MOLF對UC小鼠體內炎癥反應和腸黏膜屏障的改善效果，為MOLF的進一步開發利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 MOLF的制備

辣木葉購自云南寧澤生物科技有限公司，取干燥辣木葉100 g研磨粉碎，石油醚40 ℃回流8 h，過濾后的辣木葉粉60 ℃烘干1 h后加入70%乙醇，料液比20∶1，超聲功率300 W，提取時間25 min，提取液濾過后經旋轉蒸發儀減壓濃縮，回收乙醇至干，除去蛋白質、多糖等水溶性雜質，冷凍干燥48 h得MOLF。經大孔樹脂分離純化后以蘆丁標準法測得MOLF含量為32.7 mg/g，配制成25、50、100 mg/kg MOLF提取液備用。

1.2 試驗動物與處理

1.2.1 試驗動物及飼養管理 體重為(20±2)g清潔級雄性BALB/c小鼠50只，購于揚州大學比較醫學中心，許可證號為SYXK[蘇]2017-0044，試驗過程中小鼠均飼喂專用鼠糧(購自江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司)，自由采食與飲水，環境溫度為(24±2)℃，相對濕度為(60±10)%。試驗程序均符合揚州大學動物福利委員會的標準。

1.2.2 試驗動物分組與處理 試驗小鼠稱重并隨機分成5組，每組10只，分別為對照組(control)、DSS組(模型組)、MOLF-L組(25 mg/kg)、MOLF-M組(50 mg/kg)、MOLF-H組(100 mg/kg)。小鼠連續7 d自由飲用4% DSS(W/V)誘導UC模型，期間藥物處理組每天1次灌服0.2 mL不同濃度的MOLF提取液，對照組和模型組灌服無菌生理鹽水給予相同刺激。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 DSS(MW：36000-50000)購自MP Biomedicals公司；PAS染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠IL-1β、IL-10、TNF-α、HMGB1 ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司；LPS檢測鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技有限公司；抗體ZO-1(40-2200)、Occludin(40-4700)均購自Invitrogen公司；Cleaved-caspase 3(Asp175，9661)、Bcl-2(3498)、Bax(2772)、β-actin(4970)均購自CST公司；FITC標記山羊抗兔二抗和Cy3標記山羊抗兔二抗均購自北京碧云天生物技術有限公司。

1.3.2 主要儀器 石蠟切片機(RM2125RTS)和正置熒光顯微鏡(DM2500)均購自Leica公司；Epoch 酶標儀購自Biotak公司；熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司；ChemiScope化學發光成像系統購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 小鼠體重變化、疾病活動指數(DAI)評分與結腸長度的測定 每天在小鼠進行藥物處理前稱重，計算末次給藥前體重與初始體重的比值，得到小鼠平均體重變化率(%)；每天觀察小鼠的糞便黏稠程度并用聯苯胺冰醋酸法檢測糞便是否隱血或者帶血，進行DAI評分(DAI評分是對動物體重減輕情況、糞便黏稠度和直腸出血情況的綜合評價，通常作為評估結腸炎患者臨床進展的指標[14])，評分標準見表1。試驗結束后用脫頸椎的方式處死小鼠，剪取距盲腸0.5 cm至距肛門1 cm處完整的結腸并測量其長度。

表1 疾病活動指數評分標準Table 1 The criterion for judgement of disease activity index

1.4.2 組織病理學觀察 取小鼠結腸組織，在4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，再經脫水、透明、浸蠟、包埋、修蠟、切片，一部分經HE染色后置于顯微鏡下拍照觀察；另一部分按照PAS染色試劑盒說明書步驟進行操作，中性樹膠封固后置于顯微鏡下觀察。

1.4.3 血清中IL-1β、IL-10、TNF-α、HMGB1和LPS含量 處死小鼠前從眼眶靜脈叢采集血液，在室溫條件下自然凝固10～20 min，4 ℃、3000 r/min離心10 min，收集上清，采用ELISA方法測定小鼠血清中IL-1β、IL-10、TNF-α、HMGB1含量，使用鱟試劑盒(試管定量顯色基質法)檢測小鼠血清中LPS含量。

1.4.4 結腸組織中IL-1β、IL-10、TNF-α和HMGB1 mRNA表達水平 剪取100 mg凍存的結腸組織置于EP管中，采用Trizol試劑提取總RNA,調整濃度至75 μg/μL。隨后用反轉錄試劑盒制備cDNA，以其為模板進行實時熒光定量PCR擴增，引物序列見表2。按照熒光定量試劑盒說明書預混20 μL反應體系進行檢測，反應程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以β-actin為內參基因，采用2-△△Ct法進行相對定量分析。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.4.5 結腸組織中ZO-1和Occludin表達水平測定 利用免疫熒光法檢測小鼠結腸中ZO-1和Occludin表達水平。取固定的小鼠結腸組織樣本制備冰凍切片，脫蠟后使用修復液(枸櫞酸緩沖液，pH 6.0)進行抗原修復，5% BSA 37 ℃封閉1 h，對不同組織切片滴加稀釋后的一抗ZO-1(1∶100)和Occludin(1∶100)，4 ℃孵育過夜，次日加入綠色熒光標記二抗(1∶200)和紅色熒光標記二抗(1∶200)，37 ℃避光孵育2 h；最后DAPI染核5 min，封片后置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.6 腸上皮細胞凋亡相關蛋白相對表達量檢測 將組織剪碎后加入裂解液裂解，充分勻漿后離心收集上清液，以BCA定量法測定上清液蛋白濃度，然后將上清液置于沸水中10 min使蛋白變性，取10 μL液體進行凝膠電泳，電轉至PVDF膜，封閉后分別使用Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax抗體(1∶1 000)4 ℃過夜孵育；加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，PBST洗3遍后使用ECL顯影檢測蛋白表達，以β-actin為內參，利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.5 數據統計分析

采用Graphpad 8.0.2軟件統計分析，采用獨立t檢驗進行組間差異分析，試驗結果用平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 MOLF對UC小鼠體重、疾病活動指數和結腸長度的影響

由表3可知，在試驗結束時，除對照組小鼠體重穩定增加外，DSS組小鼠體重較初始體重明顯降低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；MOLF-M和MOLF-H組小鼠體重接近于初始體重，體重變化率均顯著高于DSS組(P<0.05)。

同時，除對照組小鼠DAI指數始終處于低水平外，其他組小鼠DAI指數均有不同程度增加，尤其是DSS組小鼠DAI評分極顯著高于對照組(P<0.01)；MOLF處理降低了DSS誘導的DAI評分，其中MOLF-H組的DAI評分與DSS組相比差異極顯著(P<0.01)。

剖檢發現，DSS組小鼠的結腸發生明顯萎縮，長度極顯著低于對照組(P<0.01)；相較于DSS組，MOLF處理后小鼠結腸長度得到明顯改善，尤其是MOLF-M和MOLF-H組的結腸長度極顯著增加(P<0.01)。

表3 各組小鼠平均體重變化率、疾病活動指數和結腸長度Table 3 Average weight change rate,DAI and colon length of UC mice in each group

2.2 MOLF對小鼠結腸組織病變和杯狀細胞數量及其形態結構的影響

由圖1A可知，對照組結腸組織未觀察到明顯壞死，其黏膜上皮結構和腸隱窩等結構完整，中性粒細胞呈散在性分布。DSS組小鼠黏膜下層明顯水腫(▲所示位置)，腸隱窩結構被破壞、變形、排序紊亂，黏膜層和黏膜下層有大量炎性細胞浸潤(※所示位置)，少數可達肌層，并伴有上皮細胞壞死和脫落；MOLF-L組肌層出現水腫，有較多炎性細胞浸潤，腸隱窩結構不規則；MOLF-M組腸腺結構正常，腸絨毛形態完整，少量中性粒細胞浸潤；MOLF-H組腺體層次清晰可見，固有層結構正常，肌層也無明顯異常。

由圖1B可知，對照組結腸組織杯狀細胞數量充足，形態結構正常；DSS組杯狀細胞數量極少(→所示位置)，形態發生變化，出現空泡狀結構；與DSS組相比，MOLF-L組杯狀細胞數量較少并呈無規則分布；MOLF-M組杯狀細胞數量較多且形態得到改善；MOLF-H組杯狀細胞形態結構接近對照組，數量較多且分布均勻。

2.3 MOLF對小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1和LPS含量的影響

由表4可知，與對照組相比，DSS組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、HMGB1和LPS含量均極顯著上升(P<0.01)，IL-10含量極顯著降低(P<0.01)；與DSS組相比，MOLF-M組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、HMGB1和LPS含量均顯著下降(P<0.05)，MOLF-H組IL-1β、TNF-α、HMGB1和LPS含量均極顯著降低(P<0.01)，MOLF-M和MOLF-H組IL-10含量均極顯著增加(P<0.01)。

2.4 MOLF對小鼠結腸組織炎性細胞因子mRNA相對表達量的影響

由表5可知，與對照組相比，DSS組小鼠結腸組織中IL-1β、TNF-α、HMGB1 mRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)，IL-10 mRNA的相對表達量顯著降低(P<0.05)；與DSS組相比，MOLF-M組IL-1β、TNF-α、HMGB1 mRNA的表達均顯著降低(P<0.05)，MOLF-H組IL-1β、TNF-α、HMGB1 mRNA表達量均極顯著降低(P<0.01)，IL-10 mRNA的表達極顯著上調(P<0.01)。

A，小鼠結腸HE染色圖；B，小鼠結腸PAS染色圖 A，HE staining of mice colon；B，PAS staining of mice colon圖1 各組小鼠結腸組織病理學觀察Fig.1 Histopathological observation of colon in mice of each group

表4 各組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1和LPS水平Table 4 Serum levels of IL-1β,TNF-α,IL-10,HMGB1 and LPS in mice of each group

表5 各組小鼠結腸組織IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1 mRNA表達量Table 5 The mRNA expression of IL-1β,TNF-α,IL-10 and HMGB1 of colon in mice of each group

2.5 MOLF對小鼠結腸ZO-1和Occludin表達水平的影響

免疫熒光檢測獲得了較為直觀的蛋白表達結果，見圖2。由圖2可知，與對照組相比，DSS組小鼠結腸中ZO-1和Occludin熒光強度降低；經MOLF處理后ZO-1和Occludin熒光強度增加，其中MOLF-H組接近對照組。

圖2 各組小鼠結腸組織免疫熒光染色(100×)Fig.2 Immunofluorescence staining of colon in mice of each group (100×)

2.6 MOLF對小鼠結腸組織中cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

由圖3可知，與對照組相比，DSS組小鼠結腸組織中cleaved-caspase 3的表達極顯著增加(P<0.01)；與DSS組相比，隨著MOLF濃度的增加，小鼠結腸組織中cleaved-caspase 3的表達顯著或極顯著下降(P<0.05；P<0.01)；同時，在DSS的刺激下，小鼠結腸組織中的Bcl-2表達下降，Bax表達增加，與對照組差異極顯著(P<0.01)；相比于DSS組，MOLF-H處理極顯著緩解了Bcl-2表達下降和Bax表達增加(P<0.01)。

3 討 論

辣木葉中的黃酮類化合物已被證實在緩解氧化應激和抗炎方面發揮重要作用[15]，本試驗利用DSS建立UC模型，該模型效果明顯，臨床癥狀與病理學改變與人體潰瘍性結腸炎類似，適用于針對潰瘍性結腸炎藥物作用的研究[16]，并且DSS對腸上皮細胞有直接毒性，會破壞腸黏膜屏障的完整性[17]，適合用于研究藥物對腸黏膜屏障修復的保護機制。本試驗結果顯示，模型組小鼠DAI指數明顯高于對照組，并伴有腹瀉、血便黏連、體重急劇下降、結腸明顯縮短等UC典型的臨床癥狀，證明成功誘導出UC模型，效果明顯。并且MOLF可以顯著緩解UC小鼠體重減輕狀況，改善DAI評分，抑制結腸縮短。對結腸組織進行病理組織學研究發現，MOLF可以改善DSS誘導的腸結構破壞、杯狀細胞減少和炎性細胞浸潤情況，這些結果都表明MOLF對UC臨床癥狀和結腸病理變化具有良好的改善效果。

炎性細胞因子在UC發病過程中扮演著重要角色，當腸道發生炎癥時，腸黏膜的免疫功能受到破壞，使腸道內條件致病菌容易在腸道內定植并產生毒素[18]，有害菌及其代謝產物如LPS等會進入血液[19]，造成單核細胞與常駐肥大細胞的額外募集，刺激促炎和促纖維化介質IL-1β、TNF-α、HMGB1等因子的產生[20-21]，進而通過多種途徑引起機體局部乃至全身炎癥反應。本研究通過對小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1炎癥因子和LPS檢測發現，MOLF會明顯抑制促炎因子的表達，上調抗炎因子，降低血清中LPS水平。同時用實時熒光定量PCR技術對相關細胞因子進行檢測，結果顯示，MOLF處理會顯著降低促炎因子IL-1β、TNF-α和HMGB1 mRNA的表達，增加抗炎因子IL-10 mRNA的表達。

A、B，分別為Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白Western blotting條帶圖；C、D、E，分別為Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表達量 A and B，Western blotting strip charts of cleaved-caspase 3,Bcl-2 and Bax proteins；C，D and E，Protein expression levels of cleaved-caspase 3,Bcl-2 and Bax圖3 各組小鼠結腸組織cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表達量Fig.3 Expression of cleaved-caspase 3,Bcl-2 and Bax proteins in colon of mice in each group

緊密連接作為腸黏膜機械屏障的核心結構，廣泛存在于相鄰的腸上皮細胞之間[22]，其中ZO-1和Occludin等蛋白共同組成緊密連接的主體，完整的緊密連接結構可封閉細胞間隙，防止有害物質侵襲，對維持腸黏膜屏障完整性發揮重要的作用[23]。本研究通過免疫熒光試驗檢測ZO-1和Occludin的變化，結果顯示，與對照組相比，DSS組小鼠結腸組織中ZO-1和Occludin熒光強度明顯降低，提示緊密連接關鍵蛋白低表達可能是UC發生的關鍵因素之一；MOLF處理則減輕了DSS誘導損傷導致的緊密連接關鍵蛋白ZO-1和Occludin的表達降低。此外，緊密連接還有固定上皮細胞維持細胞間極性的作用，正常生理情況下，腸上皮細胞中的Bcl-2和Bax蛋白以適當的比例存在，兩者功能相反，若Bax占優勢，可促進細胞凋亡；若Bcl-2占優勢，則抑制細胞凋亡[24]。當腸道發生炎癥時，Bax表達增多，形成的Bax/Bax同二聚體增加，使線粒體膜通透性增加，導致caspase家族蛋白被激活，特別是caspase 3[25]。本研究結果表明，MOLF處理可以顯著增加UC小鼠結腸中Bcl-2的表達，同時降低cleaved-caspase 3和Bax的表達，高劑量組效果最明顯。這提示MOLF保護UC的機制可能與其維護腸緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達、調控腸上皮細胞凋亡cleaved-caspase 3/Bcl-2/Bax信號通路有關，從而達到防治UC的作用。

4 結 論

本試驗結果表明，在小鼠UC模型中，MOLF可以明顯緩解DSS誘導的結腸長度縮短、血清和組織中促炎因子水平升高、腸黏膜緊密連接蛋白損失，并抑制促凋亡蛋白的表達，從而發揮預防保護作用，其中以100 mg/kg MOLF處理效果最好。本研究可為辣木的開發利用以及MOLF防治UC提供新的思路。