Th17在AS患者外周血中的表達及意義

戶小均，馬 驥，黃 丹

（綿陽市中心醫院，四川 綿陽 621000）

強直性脊柱炎（AS）是一種慢性炎癥性疾病，以髂骶關節、脊柱以及外周關節為主要病變部位，同時伴有不同程度的心血管、肺部病變。調查發現，截至2019 年我國AS 患病率在0.44% 左右，男性的發病風險更高，且好發于青壯年群體，對患者家庭及社會均會造成一定負擔[1]。AS 具有一定的家族聚集性，屬于與遺傳相關的自身免疫性疾病，但患者免疫功能的改變與遺傳發病的機制目前并未闡明。關于AS 與T細胞亞群的研究存在較多爭議，有學者在研究中發現了一種新的T 細胞亞群——輔助性T 細胞17（Th17）。該細胞屬于效應CD4+T 細胞，來源于Th0，具有與Th1、Th2 差異的獨立分化途徑，且已有大量研究證實Th17在自身免疫性疾病、炎癥疾病中具有重要作用[2]。本研究為分析AS 患者外周血中Th17 的表達水平及其在疾病發生機制中的作用，對我院收治的AS 患者及同時期的健康受試者進行對比，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2021 年1 月至12 月收治的AS 患者30例為研究組，選擇同一時期于我院進行體檢的健康受試者30 例為對照組。納入標準：1）研究組患者經我院檢查確診為AS ；2）對照組受試者為本院體檢結果健康人群；3）簽署同意書者。排除標準：1）合并其他自身免疫性疾病者；2）合并惡性腫瘤者；3）出現嚴重感染性疾病或高熱癥狀者。剔除標準：1）不能參與研究全過程者；2）研究過程中出現突發性疾病且對研究結果產生影響者；3）未按照本研究要求進行試驗者。研究組中有男16 例、女14 例，年齡24 ～41 歲，平均（32.52±4.11）歲。對照組中有男17 例、女13 例，年齡23 ～40 歲，平均（32.51±4.09）歲。兩組受試者的性別、年齡對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 檢測儀器 流式細胞儀（賽默飛世爾，Attune）；細胞培養箱。

1.2.2 檢測方法 1）Th17、Th1、Th2 ：抽取兩組受試者的靜脈血3mL，以肝素鈉抗凝，參照固定比例進行全血細胞刺激培養4h，之后用磷酸鹽緩沖劑沖洗。分成5 管，分別在其中加入10μL 抗CD4 抗體進行染色，置于室溫暗處30min。加固定劑50μL，室溫放置15min。加入4mL PBS 清洗劑，以1500r/min 轉速離心10min，去上清液，加通透劑30μL。之后分別在5 管中加入抗白細胞介素-17（IL-17）抗體、IL-4 抗體、γ 干擾素（IFN-γ）抗體、FTTC 以及PE 抗體進行同種型對照，混合均勻后在室溫暗處放置15min。洗滌1 次，去上清液，加PBS500μL 支撐細胞懸液，待檢。2）人類白細胞抗原B27（HLA-B27）：分別在各反應管中加入100μL 肝素鈉行抗凝處理，再加入相應單克隆熒光抗體10μL，混勻，以同型抗體做陰性對照，室溫避光保存30 min，溶血。之后加入PBS4mL，以1500 r/min 轉速離心5min，洗滌2 次，去上清液，加PBS500μL 配置細胞懸液，待檢。陽性標準：分析細胞群百分比、平均熒光強度，HLA-B27*/B7-平均熒光強度＞8 或細胞群百分比＞90%表示呈陽性。3）紅細胞沉降率（ESR）：以魏氏法取受試者靜脈血3 mL 進行檢測。4）C 反應蛋白（CRP）：以速率散射比濁法取受試者靜脈血3 mL 進行檢測。

1.3 觀察指標

1）對比組間Th17 的表達水平。2）對比組間Th1、Th2 的表達水平。3）分析研究組Th17 的表達水平與HLA-B27、CRP、ESR 之間的相關性。

1.4 統計學方法

將本研究數據錄入SSPS12.0 統計軟件進行統計學處理，計量資料采用±s表示，行獨立樣本t檢驗；計數資料采用% 表示，行χ2 檢驗；相關性分析采用Spearman 分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對比組間Th17 的表達水平

研究組Th17 的表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 對比組間Th17 的表達水平（%，± s ）

表1 對比組間Th17 的表達水平（%，± s ）

組別 Th17研究組（n=30） 2.77±0.73對照組（n=30） 1.21±0.44 t 值 10.025 P 值 ＜0.001

2.2 對比組間Th1、Th2 的表達水平

研究組Th1 的表達水平明顯低于對照組，Th2的表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 對比組間Th1、Th2 的表達水平（%，± s ）

表2 對比組間Th1、Th2 的表達水平（%，± s ）

組別 Th1 Th2研究組（n=30） 3.77±0.91 4.22±1.01對照組（n=30） 4.88±1.01 3.04±0.77 t 值 4.472 5.089 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 研究組Th17 的表達水平與HLA-B27、CRP、ESR 之間的相關性

研究組HLA-B27 的檢測結果為陽性，ESR為（32.54±2.24）mm/h，CRP 為（31±9）mg/L。經Spearman 分析發現：研究組Th17 的表達水平與HLA-B27 百分比、HLA-B27 平均熒光強度及ESR、CRP 無 明 顯 相 關 性（r=0.415、r=0.151、r=0.086、r=0.289，P均＞0.05），但Th17 的表達水平會隨著HLA-B27 百分比及HLA-B27 平均熒光強度的增加而升高。

3 討論

AS 起病緩慢且早期癥狀不明顯。此病患者的臨床表現主要為腰骶部鈍痛、晨僵或翻身困難，稍活動后減輕，隨著病情進展，疼痛會逐漸從腰椎進展至胸椎、頸椎等，嚴重時可發生脊柱畸形。研究顯示，AS具有家族聚集性，此病患者的一級親屬患有AS 的概率高達30%。免疫因素在AS 的發病過程中發揮著重要作用，目前共發現100 多種細胞因子、趨化因子參與AS 的炎性反應，AS 患者體內的免疫炎癥因子水平要高于正常人群[3]。大量研究證實，與類風濕性關節炎（RA）相比，AS 患者體內腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IFN-γ 的分泌量均明顯減少。但也有研究指出，TNF-α 在AS 中呈現升高趨勢，認為該因子在多種脊柱關節病的發病機制中起著重要作用[4]。近年來有研究證實，參照細胞發育、功能及分泌細胞因子作用的差異，CD4+T 淋巴細胞應細化為Th1、Th2、調節性T 細胞及Th17 四大亞群[5]。Th17 亞群分化、功能均受Th1 和Th2 因子的影響，而IL-17 能夠在免疫、防御中起到重要作用，生成調控粒細胞，阻斷細胞外病原體入侵。

近年來臨床上關于Th17 亞群的產生、分化機制及在RA 中表達水平的研究較多，但關于其在AS 中的表達情況及在本病發生、發展中作用機制的研究較少。本研究借助流式細胞術分析AS 患者體內Th17 表達水平與健康受試者的差異，以及Th17 在AS 進展過程中的作用機制[6]。本研究顯示，研究組Th17 的表達水平明顯高于對照組，差異統計學意義（P＜0.05）；研究組Th1 的表達水平明顯低于對照組，Th2 的表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。原因在于，Th1、Th2 及Th17 型細胞因子之間關系復雜，且IL-17 主要是通過促進細胞、核因子受體活化而發揮作用。同時發現，轉化生長因子（TGF）-β、IL-6等具有促進Th17 分化的能力，而IFN-γ 則具有強烈抑制Th17 產生的作用。在加入抗IFN-γ 抗體的Th17培養中，發現IL-17 的水平升高。動物實驗顯示，與野生型小鼠相比，IFN-γ 基因敲除的小鼠體內IL-17的分泌量相對較高[7-8]。本研究顯示，研究組HLA-B27的檢測結果為陽性，ESR 為（32.54±2.24）mm/h，CRP 為（31±9）mg/L；經Spearman 分析發現：研究組Th17 的表達水平與HLA-B27 百分比、HLA-B27平均熒光強度及ESR、CRP 無明顯相關性（r=0.415、r=0.151、r=0.086、r=0.289，P均＞0.05），但Th17的表達水平會隨著HLA-B27 百分比及HLA-B27 平均熒光強度的增加而升高。原因在于，AS 患者體內存在Th1 嚴重缺損或Th17 過度表達的情況，抑制了Th1 的分化，導致IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-6 等炎癥細胞因子的表達水平增高，促使AS 的發生、發展。

綜上所述，AS 患者外周血中Th17、Th2 數目增多，Th1 數目減少，其體內Th 細胞存在失衡情況，提示Th17 參與了AS 整個免疫異常變化的過程且在其中發揮著重要作用。