CALCR 基因和自噬相關基因在非小細胞肺癌中的相關性研究#

何弢 譚志巍 王喬羽 謝雨芹 龔劉萍 張燕琴 劉沙,△

（1.成都醫學院第二附屬醫院·核工業四一六醫院，四川 成都 610057；2.成都醫學院藥學院，四川 成都 610500；3.空軍第986 醫院藥劑科，陜西 西安 710054）

肺癌是全球高發病癥，并且致死率很高，我國肺癌患病人數在2015 年就達到了73.33 萬[1]。肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（Nonsmall-cell lung cancer，NSCLC），其 中 以NSCLC 最為常見，占所有肺癌種類的 85%-90%[2]。非小細胞肺癌早期癥狀不明顯，確診時多為晚期，外科手術已經不適宜作為治療手段，因為經過手術切除治療的非小細胞肺癌患者的復發和轉移率較高，術后病人的總體生存率也較低[1]。而NSCLC 的分子靶向治療取得了明顯的進展，例如厄洛替尼對NSCLC 有很強的抑制作用[3]，索拉菲尼在NSCLC 的I 和II 期臨床實驗中取得了較滿意效果[4]。因此更好的挖掘NSCLC 發生發展的作用機理對于開發抗NSCLC 藥物具有較強臨床價值。

研究表明 G 蛋白偶聯受體（G-proteincoupled receptor,GPCRs）屬于七次跨膜受體，參與了多種細胞信號傳導過程，與許多人類疾病的發生、發展以及預后有密切的聯系，是一種重要的細胞表面受體，CALCR 屬于GPCRs 其中之一[5]。CALCR（也稱為CTR），位于染色體7q21.3上，既是降鈣素激素受體，也是細胞外鈣傳感器，是一種具有雙重功能的跨膜肽[6,7]。但是CALCR在非小細胞肺癌中的相關文獻資料極少，故本實驗對CALCR 在NSCLC 組織中的表達情況進行評價。

細胞自噬是一個重要的細胞代謝過程之一，可作為NSCLC 的治療靶點。細胞自噬是一種細胞內降解途徑，其功能主要是維持機體內環境穩定，此過程通過清除損壞的蛋白或細胞器來完成[8]。研究表明細胞自噬在NSCLC 的發生發展過程中起雙重調控作用。一方面通過維持基因組穩定性、抑制氧化應激等方式在正常細胞中發揮抗腫瘤作用并抑制腫瘤轉移；另一方面，自噬能為癌細胞提供能量、能促進癌細胞對缺氧以及氧化應激等的適應、能促進腫瘤的轉移與侵襲等[9]。目前對于自噬與NSCLC 之間聯系已經有了較多的研究進展，但是針對NSCLC組織中CALCR的表達情況與細胞自噬相關性的研究依舊很少，故本實驗基于此做了進一步的探索，以對NSCLC與CALCR 的研究提供更多的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

酶標儀（成都錦世昌祥科技有限公司，中國），電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，中國），電泳儀和凝膠成像儀（BIO RAD，美國），臺式高速離心機（賽默飛世爾科技有限公司，美國），超純水裝置（四川優普超純科技有限公司，中國），高通量快速勻漿器（MP Biomedicals，美國）。

1.2 試劑

BCA 蛋白試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，中國），蛋白電泳上樣緩沖液5×（康為世紀生物科技有限公司，中國），彩色預染蛋白（安徽欣伯玉生物科技有限公司，中國），GAPDH 一抗、Beclin-1 一抗、ATG5 一抗及ATG13 一抗（Proteintech，美國），CNR2 一抗及CNR1 一抗（Affinit，美國），P53 一抗（上海泊灣生物科技有限公司，中國），鼠抗兔IgG 二抗，羊抗鼠IgG 二抗（上海泊灣生物科技有限公司，中國）。

1.3 方法

1.3.1 研究對象

2021 年9 月到2022 年1 月共收集成都醫學院第二附屬醫院核工業四一六醫院20 對原發性非小細胞肺癌肺組織樣本。

所有患者均未進行手術治療并對患者的臨床病歷資料（年齡、性別、病理結果、分期、家族史、吸煙情況、腫瘤部位及腫瘤直徑等）進行收集（見表1），其中男性6 例，女性14 例，年齡39-85 歲，TNM 分期為I-II 期。所有患者均知情同意并簽署知情同意書，并獲得了核工業四一六醫院倫理委員會的倫理批準。

表1 患者的臨床資料

1.3.2 Western blot

將保存于-80℃冰箱的組織加入RIPA 裂解液通過勻漿儀研磨，研磨后的組織勻漿利用離心機以12 g 離心20 min 取上清液。提取的上清液利用BCA 試劑盒測定蛋白濃度并對樣品濃度進行適度調整，確定需要添加的SDS-PAGE Loading Buffer（Reducing，5×）（康為世紀公司）體積以及上樣體積。最后將樣品標記好編號并金屬浴10 min，置于-20℃保存。制膠完成后，每孔加入等量蛋白，通過12% 濃度的聚丙烯酰胺凝膠開展電泳，待電泳完成后，開始利用PVDF 轉膜。轉膜后利用5% BSA 室溫下封閉1 h 后，與相應的一抗進行孵育，包括抗P53抗體（1:1000），抗Beclin-1 抗體（1:1000），抗ATG5 抗體（1:1000），抗 ATG13 抗體（1:1000），抗 CALCR 抗體（1:1000），抗GAPDH 抗體（1:2000）。一抗孵育完成后，利用TBST 在常溫搖床上清洗5 次，每次5 min。并利用辣根過氧化物酶標記的二抗（1:5000）室溫孵育2 h。最后將條帶均勻覆蓋發光液后通過凝膠成像儀曝光查看結果。利用Image-J計算條帶灰度值，并以GAPDH為內參對照，計算目的蛋白與GAPDH 灰度比值。

1.4 統計學分析

采用SPSS 軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用t檢驗。采用Spearman 等級相關分析對CALCR 與ATG5、ATG13、Beclin-1 及P53 蛋白之間進行相關性分析。運用Graphad 軟件描繪柱狀圖。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 組中CALCR 蛋白表達情況

如圖1 所示，與正常組（癌旁組織）比較，NSCLC 組中的CALCR 蛋白表達水平明顯上調（P＜0.001）。

圖1 Western blot 測定NSCLC 癌組織及癌旁組織中CALCR 蛋白的表達情況

2.2 NSCLC 組CALCR 水平與臨床特征參數之間的關系

如圖2 所示，在NSCLC 組織中，CALCR 蛋白水平在性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小等臨床特征參數上未見組間顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 分析CALCR 蛋白在不同病理特征的表達情況

2.3 NSCLC 組中自噬相關蛋白表達水平

如圖3 所示，與正常組（癌旁組織）比較，NSCLC 組中ATG5，ATG13，p53 及Beclin-1 蛋白表達明顯下調（P＜0.05）。

圖3 Western blot 測定NSCLC 癌組織及癌旁組織中ATG5、ATG13、Beclin-1 及p53 蛋白的表達情況

3 討論

CALCR 為降鈣素基因，是體內最強的一種舒血管神經肽，廣泛分布于中樞，心血管及肺組織，并通過自分泌和旁分泌的方式作用于腫瘤細胞表面的肽類受體，在腫瘤的不同調控機制方面展現了較好的作用[10-12]。研究表明，CALCR 通過IL-2 增強細胞存活率，也可抑制NK 細胞的殺傷活性導致腫瘤細胞生長，總體刺激癌細胞分裂增殖[13,14]。同時，肺癌患者的血漿中CALCR 較正常人顯著升高，并隨肺癌浸潤范圍和病情加重[15]。因此，CALCR 是腫瘤生長的重要調節因子。本研究發現CALCR 蛋白表達水平在NSCLC 組織中高表達，可能通過激活腺苷酸環化酶，通過升高cGMP 從而松弛平滑肌，導致血管擴張，且血流加快，促進細胞增殖[16]。同時，本研究的臨床病理因素分析顯示，CALCR 蛋白與患者年齡，性別，腫瘤直徑大小及腫瘤部位無相關性。且TNM 分期中未觀察到表達上差異性，可能是由于臨床樣本數量有限導致差異性不明顯。

自噬在腫瘤進程中頻繁發生。在腫瘤初期，基礎水平的自噬通過降解細胞中受損成分或蛋白質從而抑制腫瘤的發生。而在腫瘤晚期，自噬通過維持腫瘤細胞的基本代謝功能促進腫瘤生長，存活及惡性腫瘤的發生[17]。比如增強腫瘤的應激耐受性和提供營養來滿足細胞的代謝需求，從而促使腫瘤細胞即使在不良的環境下也能維持細胞存活。因此，自噬對于腫瘤的發生發展過程中起到正負雙向調控功能。本研究中，下調的自噬蛋白提示在NSCLC 中已不能維持基本水平的自噬，促進腫瘤的發生。本研究使用TNM分期為I-II期的患者標本，主要傾向于腫瘤早期，這與使用的臨床樣品相吻合。由于腫瘤抑制基因p53 在自噬調節中發揮雙重調節作用：一方面，細胞核內的p53 通過發揮其轉錄因子潛能從而促進自噬發生；另一方面，胞漿內的p53通過抑制AMPK 活性從而抑制自噬[18]。本研究中，發現P53 蛋白和自噬相關蛋白均下調，表明P53 可能發揮轉錄因子潛能從而誘導自噬。自噬體的形成與ATG 系列基因有關，如ATG5 是一種自噬相關基因，通過與ATG12形成ATG5-ATG復合體，參與自噬體膜的形成與延伸[19]。ATG13 是腫瘤抑制器和細胞能量狀態的傳感器，可影響能量消耗刺激自噬[20]。Beclin-1 是酵母ATG6 的同系物，其是哺乳動物參與自噬的特異性基因，主要與III 型PI3K 形成復合物來促進其它的ATG蛋白如ATG5和ATG13在自噬前體結構中定位，從而調節自噬活性[21]。研究表明Beclin-1 的低表達促進肺癌，結腸癌，卵巢癌等進程，此過程可能與促進凋亡有關。Beclin-1 過表達抑制肺癌細胞的生長，血管生成，促進凋亡等[22]。因此，Beclin1、ATG5 和ATG13在自噬體的定位，自噬囊泡的形成和擴展中起著重要作用。

本研究發現NSCLC 中Beclin-1、ATG5 及ATG13 蛋白下調，表明以上蛋白在NSCLC 中發揮抑癌作用，提示自噬活性在NSCLC 中降低，自噬體形成減少，自噬發生強度減弱。同時在相關性分析中發現CALCR 蛋白表達水平與ATG5蛋白表達水平無相關性，而CALCR 蛋白表達水平與ATG13、P53、Beclin-1 蛋白表達水平呈顯著正相關，推測促癌基因CALCR 與抑癌基因p53 協同抑癌，導致細胞自噬能力降低，內環境穩定性下降。CALCR 與ATG13 及Beclin-1 蛋白表達水平呈正相關，與ATG5 蛋白表達水平無相關性，提示CALCR 抑制可促進自噬囊泡的形成及定位，但對自噬囊泡的延伸無影響。此過程可能是由于 CALCR 作為降鈣素基因，可激活PI3K/Akt/mTOR 通路，從而抑制 ATG13 及Beclin-1 的表達[23,24]。

綜上所述，本研究結果表明，CALCR 和自噬相關蛋白參與了NSCLC 的病理進程，兩者指標可協同作為診斷NSCLC 的有效標志物，可稱為疾病治療的靶標。