24 小時尿18-羥皮質醇含量對于不同性別腎上腺醛固酮腺瘤患者的診斷價值

胡志成，卞瑾，婁瑩，周憲梁，張慧敏，蔡軍，馬文君，趙蓓蓓，饒夢華，佘旭輝

《中國心血管健康與疾病報告》指出目前我國高血壓患者約2.5億，這其中原發性醛固酮增多癥（原醛癥）是最為常見的繼發性高血壓原因之一[1]。難治性高血壓患者中原醛癥患病率高達17%～23%[2]。原醛癥共分6 種亞型，其中最常見的2 種亞型分別為特發性醛固酮增多癥（IAH）和腎上腺醛固酮腺瘤（APA），其他4 種亞型甚為罕見[3]。與IAH 的首選藥物治療不同，APA 的一線治療方案為單側腎上腺切除術。因此，從原醛癥患者中甄別出APA 尤為重要[4]。目前APA 診斷方法主要為雙側腎上腺靜脈采血（AVS）和腎上腺CT 掃描。作為金標準的AVS 為有創操作，價格昂貴，醫療可及性差，患者接受度低。而腎上腺CT 掃描診斷APA 的效能不佳[5]。作為鹽皮質激素的一種，18-羥皮質醇（18-OHF）在不同亞型的原醛癥患者中表達不同，國際及國內指南中也指出該指標有望用于原醛癥的分型鑒別[6-8]。既往研究結果顯示，女性APA 患者KNCJ5突變比例高于男性，進而導致18-OHF 合成較男性患者更多[9]。因此，18-OHF 對于不同性別APA 患者的診斷效能可能存在差異。在檢測樣本方面，24 h 尿統計了人體全天通過尿液排泄的18-OHF 總量，有效避免了外周血18-OHF 濃度瞬時波動的缺陷，是優秀的檢測樣本[10]。鑒于此，本研究在原醛癥患者中開展24 h 尿18-OHF 含量檢測、評估該指標在不同性別APA 患者中的表達情況，以期探索該指標對于APA 的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

連續入選2019年7月至2020年6月于中國醫學科學院阜外醫院高血壓病房住院的經AVS 明確亞型的73 例原醛癥患者，其中女性30 例。排除標準：（1）拒絕AVS；（2）AVS 未成功；（3）庫欣綜合征或亞臨床庫欣綜合征；（4）其他原因引起的繼發性高血壓：腎實質性高血壓、腎血管性高血壓、嗜鉻細胞瘤/副神經節瘤、甲狀腺及甲狀旁腺疾病、主動脈疾病等。

1.2 研究方法

收集患者的一般臨床資料，高血壓患者行立位醛固酮與腎素濃度比值（ARR）篩查，立位ARR ≥2.4 (ng/dl)/(mU/L) 且醛固酮濃度≥8 ng/dl（1 ng/dl=27.7 pmol/L）作為初篩陽性，進一步開展卡托普利試驗或生理鹽水抑制試驗進行確診。原醛癥以及原醛癥亞型的診斷標準參照2016年美國內分泌學會原醛癥指南[8]。其中，卡托普利試驗或生理鹽水抑制試驗后2 h 血醛固酮濃度＞11.1 ng/dl 均診斷原醛癥。AVS 采取雙側非同步無促腎上腺皮質激素刺激的采血法，術中行皮質醇測定。選擇性指數≥1.5 提示插管成功，優勢分泌指數≥2 提示存在單側優勢分泌，診斷APA。所有入組原醛癥患者收集24 h 尿液檢測24 h 尿18-OHF 含量。本研究通過中國醫學科學院阜外醫院倫理委員會批準（倫理號：2017-867），入組患者均簽署知情同意書。

1.3 尿18-OHF 的檢測

樣本前處理過程：取50 μl 患者24 h 尿液樣本于離心管中（校正曲線和質控樣本同步處理），加入100 μl 18-OHF-d4 內標工作液、渦旋混勻 5 min，離心5 min（25℃，10 000 rpm，德國Eppendorf 5427R高速冷凍離心機）；加入350 μl 去離子水，渦旋混勻5 min；再次離心5 min（25℃，10 000 rpm）；取上清液待測。

液相色譜串聯質譜法分析：本實驗使用島津LC-20AD XR 高效液相色譜儀和AB SCIEX TRIPLE QUAD 4500 三重四極桿質譜儀對樣本進行檢測。采用 Sigma Asentis Express C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）色譜柱進行色譜分離，流動相為水和甲醇均含有0.2%甲酸，流速為0.4 ml/min，梯度洗脫。采用電噴霧電離（ESI）源，選擇正離子模式下多離子反應監測（MRM）掃描模式。18-OHF 及內標離子對分別為379.2/267.2 和383.3/271.2。

方法驗證結果：參照《化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則》對自建LC-MS/MS 方法進行基本分析性能驗證。18-OHF 檢測方法在17.13～8 772.00 nmol/L 范圍內峰面積與質量濃度線性關系良好（r2=0.9995），定量限為4.285 nmol/L；批內精密度1.5%～1.7%，批間精密度1.3%～2.2%，加標回收率在97.8%～109.2%。方法選擇性良好，空白基質在待測物和內標保留時間處沒有干擾，不存在基質效應。

1.4 統計學方法

采用R 語言進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，不符合正態分布的計量資料采用中位數（P25，P75）表示，兩組間比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。計數資料采用例數或百分率（%）表示，組間比較采用 χ2檢驗。單因素Logistic 回歸分析探索疾病診斷的預測因素。診斷試驗的評價采用ROC 曲線分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 73 例患者的一般臨床資料（表1）

表1 73 例原發性醛固酮增多癥患者的一般臨床資料（）

表1 73 例原發性醛固酮增多癥患者的一般臨床資料（）

注：IAH：特發性醛固酮增多癥；APA：腎上腺醛固酮腺瘤；AST：天門冬氨酸氨基轉移酶；ALT：丙氨酸氨基轉移酶；；18-OHF：18-羥皮質醇。*: 用中位數（P25，P75）表示。1 mmHg=0.133 kPa

73 例（100%）患者行卡托普利試驗，59 例（80.8%）患者行生理鹽水輸注試驗。在女性患者中，14 例確診為IAH，16 例確診為APA。在男性原醛癥患者中，11 例確診為IAH，32 例確診為APA。在女性、男性中IAH 患者與APA 患者年齡、體重指數（BMI）、血壓、肝功能、腎功能等指標的差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

2.2 全部患者及不同性別患者的24 h 尿18-OHF 含量分析

在全部患者中，APA 患者中24 h 尿18-OHF含量有高于IAH 患者的趨勢，但差異無統計學意義[385（242，582）nmol/d vs.225（150，288）nmol/d，P＞0.05]。女性APA患者24h尿18-OHF含量高于IAH患者[450（260，779）nmol/d vs.220（123，276）nmol/d，P＜0.05]，但男性患者中，APA 患者與IAH 患者24 h 尿18-OHF 含量的差異無統計學意義[376（242，537）nmol/d vs.251（168，384）nmol/d，P＞0.05]。

2.3 24 h 尿18-OHF 含量與APA 的相關性分析（表2）

單因素Logistic 回歸分析顯示，在全部患者中，24 h 尿18-OHF 含量＞293 nmol/d 是診斷APA 的預測因素（P＜0.01）。在女性患者中，24 h 尿18-OHF含量＞ 298 nmol/d是診斷APA的預測因素（P=0.01），在男性患者中，24 h 尿18-OHF 含量＞ 205 nmol/d是診斷APA 的預測因素（P=0.03）。

2.4 ROC 曲線分析24 h 尿18-OHF 含量對女性患者APA 的診斷價值（圖1）

圖1 ROC 曲線分析全部患者及不同性別患者中24 h 尿18-OHF 含量對APA 的診斷價值

在全部患者中，當取24 h 尿18-OHF 含量＞ 293 nmol/d 為診斷APA 臨界值時，ROC 曲線分析的AUC為0.71（95%CI: 0.58～0.84，P＜0.01），靈敏度和特異度分別為66.7%和76.0%，約登指數有最大值，為0.43。在女性患者中，以24 h 尿18-OHF 含量＞ 298 nmol/d為診斷APA 的臨界值，則ROC 曲線分析的AUC 為0.74（95%CI: 0.55～0.93，P＜0.05），靈敏度和特異度分別為68.8%和85.7%，約登指數有最大值，為0.55。在男性患者中，以24 h 尿18-OHF 含量＞ 205 nmol/d 為診斷APA 的臨界值，則ROC 曲線分析的AUC 為0.67（95%CI: 0.48～0.87，P＞0.05），靈敏度和特異度分別為87.5%和45.5%，約登指數有最大值，為0.33。

3 討論

本研究結果提示：女性APA 患者24 h 尿18-OHF 含量高于IAH 患者。男性APA 患者與IAH 患者24 h 尿18-OHF 含量差異無統計學意義。通過24 h尿18-OHF 含量預測女性APA 診斷的特異度較高。

APA 相對于IAH 發病機制更為復雜，臨床表現更為嚴重[11-12]，及時明確診斷并盡快給予患者手術治療意義重大。目前，APA 的診斷金標準為AVS，然而我國能常規開展該檢查的醫院匱乏且均集中于大型醫療中心，可及性差，此外該方法為有創操作、且費用相對昂貴，患者接受度低。因此，能否通過檢驗學指標對APA 進行簡單、快捷、有效的診斷一直是臨床上亟待解決的問題。

早在上世紀八十年初，Chu 等[13]就從原醛癥患者尿液中首次檢測出18-OHF。后續研究發現該物質僅在以APA 為代表的部分原醛癥亞型中合成增多[11,14]。上世紀九十年代初，有學者發現APA 患者尿中18-OHF 含量明顯高于IAH 患者[15]。隨后，意大利學者在81 例原醛癥患者中分別測量了血清和24 h 尿液中三種類固醇的濃度和含量得出了APA 患者24 h 尿和血18-OHF 含量均明顯高于IAH 患者、且24 h 尿18-OHF 含量對于APA 診斷價值更高的結論[7]。Satoh 等[16]分析了 234 例經 AVS 分型診斷明確的 PA 患者外周血類固醇水平，血清18-OHF濃度在 APA 患者中明顯升高，ROC 曲線分析顯示18-OHF 濃度能夠有效地識別出APA（靈敏度62%，特異度96%）。隨后Eisenhofer 等[17]在外周和腎上腺靜脈血中測量了15 種類固醇，并發現以18-OHF為代表的類固醇可以對APA 和IAH 進行有效的鑒別診斷。綜上，各項研究均得出了血清18-OHF 對APA 具有診斷價值的一致結論。鑒于此，探討通過測量18-OHF 對APA 進行診斷成為了近年來原醛癥研究的熱點問題之一。

選擇合適的樣本來開展18-OHF 檢測也是需要考慮的問題。腎上腺靜脈血需要行AVS，與尋找簡便有效診斷指標的初衷相悖。而既往研究表明，外周血18-OHF 濃度具有類似于皮質醇的晝夜變化[18]。此外，體位變化也導致外周血18-OHF 濃度在短時間內大幅波動[10]?？紤]到外周血18-OHF 濃度僅能體現采血即刻水平，因此其對于APA 診斷價值存疑。而24 h 尿18-OHF 含量這一指標通過收集全天尿液排泄的18-OHF，避免了外周血18-OHF 濃度短時間內大幅波動的缺點，是較為優秀的檢測載體。

18-OHF 在APA 患者中合成增多相關于KCNJ5基因突變[19-20]。KCNJ5基因突變導致11-脫氧皮質醇的利用率增加，最終導致18-OHF 合成增多[21-22]。既往多項研究結果均顯示，女性患者KCNJ5基因突變的比例高于男性患者[23]，而這種情況在東亞人群中更為顯著[24-26]。通常情況下合并KCNJ5的女性APA 患者通常情況下更年輕，腎上腺腫瘤更大，原醛癥的癥狀也更為典型[27]。因此18-OHF 對于不同性別的APA 患者可能存在診斷價值的差異。遺憾的是，大多數既往研究未評估18-OHF 對于不同性別APA 患者的診斷價值。本研究發現，女性APA 患者 24 h 尿18-OHF 含量高于女性IAH 患者，男性患者之間的差異未見統計學意義。但無論在女性或男性原醛癥患者中，Logistic 回歸分析均提示高24 h尿18-OHF 含量與APA 診斷相關。

本研究在中國原醛癥患者中開展24 h 尿18-OHF檢測，力圖為無創、便捷、高效的APA 診斷方案提供線索并評價了24 h 尿18-OHF 含量對于不同性別患者APA 的診斷價值。研究結果發現，24 h 尿18-OHF 對于女性APA 具有一定診斷價值，診斷特異度高，為臨床APA 的診斷優化提供了新的思路。但本文也存在局限性：樣本量較小、且該指標未在另一個患者群中進行驗證。未來可以繼續探索以24 h尿18-OHF 含量為基礎的APA 診斷模式，進一步擴大樣本量進行多中心研究，努力提高該指標對于APA 診斷的準確性和便利性。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突