唑來膦酸通過抑制Wnt5a介導的軟骨下異常骨吸收減輕大鼠膝骨關節炎

丁 一，馬貴英，王麗梅，丁 冬，劉國強

骨性關節炎(OA)是一種慢性、進行性和退行性疾病，嚴重影響患者的生活質量，近幾年發病率呈上升趨勢[1]。在OA早期，破骨細胞介導的骨吸收增強，軟骨下骨小梁丟失，這種形態結構的改變導致關節軟骨響應載負荷的生物力學功能改變，導致軟骨退變[2]。Wnt5a在某些疾病中具有雙向調節作用，它的表達與甲狀腺癌、結直腸癌的發生呈負相關性，與黑色素瘤、胃癌的發生呈正相關性[3]。另有研究表明，Wnt5a對Wnt3a既有促進作用[4]，也有抑制作用[5]。因此，Wnt5a信號的功能是復雜的，在不同的微環境中結合不同的受體后，Wnt5a信號所發揮的生物學作用也不同。破骨細胞的分化受NF-κB受體配體(RANKL)/RANK/骨保護素(OPG)軸調控[6]，這一調節作用是否與Wnt5a共同參與早期OA的軟骨下異常骨吸收仍然不清楚。唑來膦酸(ZOL)具有抑制破骨細胞形成和骨吸收的功能。本文通過內側半月板失穩法(DMM)建立大鼠膝OA模型，確認OA早期的骨吸收時間窗，應用ZOL干預DMM所致的SD大鼠OA模型作為陽性對照，檢測ZOL對軟骨下骨重塑、關節軟骨的退變及破骨細胞的活性等作用。為了進一步明確其機制，本文檢測了Wnt5a信號以及RANKL等與破骨細胞形成相關的分子在早期OA中的表達情況。

1 資料與方法

1.1 實驗材料:健康8周齡雄性SD大鼠90只，質量(287±12)g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，scxk(寧)2020-0012。ZOL(諾華制藥，瑞士),光學顯微鏡(奧林巴斯，日本)，恒冷式冰凍切片機(LEICA CM1850，德國)，Elisa試劑盒(聯碩，上海)。兔抗大鼠一抗：Wnt5a、RANKL(Proteintech，中國)，HRP標記的羊抗兔二抗(博士德，武漢)，番紅O-固綠染色試劑盒與抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(賽維爾，武漢)，逆轉錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒(全式金，北京)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理:將90只大鼠中的72只隨機分為Sham+PBS組、DMM+PBS組和DMM+ZOL組。分別于OA誘導后2、4、8、12周處死大鼠(n=6)，觀察ZOL對OA大鼠膝軟骨和軟骨下骨的影響。在此基礎上，將另外18只大鼠隨機分為與上述相同的3組(每組6只)，術后4周取材檢測，評價破骨細胞在OA早期的活化情況，并探討其相關的分子機制。大鼠適應性飼養1周后，用1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，應用DMM方法建立大鼠OA模型[7]。切斷右膝的內側半月板脛側副韌帶，將內側半月板翻轉至股骨近端，然后逐層縫合創面。Sham+PBS組，大鼠僅暴露內側半月板脛側副韌帶后縫合創面。為了觀察ZOL對軟骨下骨中破骨細胞的活性的影響，DMM+ZOL組于造模后次日予以ZOL腹腔注射 (100 μg/kg溶于1 mL PBS緩沖液)，每周2次，連續4周。Sham+PBS組和DMM+PBS組，均給予等量PBS緩沖液。

1.2.2 Micro-CT(μCT)檢測:將膝關節置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，采用SKYSCAN1076掃描儀(掃描參數：像素10 μm，峰值管電壓40 kV，電流250 μA，旋轉角度0.6°)進行三維CT成像。脛骨內側平臺負重區域(前后范圍3.5 mm)被確定為感興趣區(ROI)，計算各組骨體積分數(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁數目(Tb.N)和連接密度(CD)。

1.2.3 組織形態學染色:獲取μCT圖像后，膝關節標本在10% EDTANa2中脫鈣4周，石蠟包埋，沿冠狀面以5 μm厚切片，按照試劑盒說明進行番紅O-固綠染色和TRAP染色。切片在二甲苯中脫蠟2次，20 min/次；用無水乙醇浸泡2次，5 min/次。固綠染色5 min，洗滌，脫水，番紅O染色2 min，光鏡下拍片后按照OARSI評分方法評估關節軟骨的退變程度[8]。切片在TRAP工作液中孵育2 h，蒸餾水沖洗3次，蘇木精染色3 min，光鏡下隨機選擇切片的5個區域，應用ImageJ 1.48v軟件計算代表軟骨下骨的骨吸收活性與破骨細胞表面占比(Oc.S/BS)。

1.2.4 免疫組織化學染色:各組冠狀切片在4 ℃下與兔抗大鼠Wnt5a、RANKL(稀釋比例1∶200)孵育過夜。PBS緩沖液洗滌3次，5 min/次，HRP標記的羊抗兔IgG二抗在37 ℃孵育1 h，PBS緩沖液洗滌后加入DAB顯色后，蘇木素復染3 min。光鏡下隨機選取切片的5個視野拍照，并用ImageJ 1.48v軟件計算陽性細胞比例。

1.2.5 RT-qPCR檢測:術后4周,每組取6只大鼠用過量戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉后處死，去除關節軟骨，保留脛骨近端的軟骨下骨，按照試劑盒說明提取總RNA。應用Transscript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Kits合成第一鏈cDNA，應用Perfect StartTM Green qPCR SuperMix進行RT-qPCR，具體引物序列如表1。反應條件如下：94 ℃維持30 s，54 ℃反應30 s，72 ℃反應34 s，持續45個循環。采用2-ΔΔCt法對相對基因表達水平進行定量，內參選擇β-actin。

表1 引物序列

2 結果

2.1 ZOL抑制DMM導致的OA大鼠膝關節軟骨下異常骨重塑:膝關節μCT結果顯示，與Sham+PBS組比較，DMM+PBS組在術后4周時軟骨下骨吸收加快，BV/TV、Tb.Th、Tb.N和CD降低，Tb.Sp增加(P<0.05)；8周時骨形成加快，BV/TV、Tb.Th增加，Tb.N和CD降低(P<0.05)。與DMM+PBS組比較，DMM+ZOL組在術后4周時骨吸收減輕，BV/TV、Tb.Th、Tb.N和CD增加，Tb.Sp降低(P<0.05)；8周時骨形成延緩，BV/TV、Tb.Th降低(P<0.05)，見表2至表3。脛骨干骺端發生骨硬化，可能是由于ZOL抑制生長板中破骨細胞的活性而導致骨吸收減弱所致(圖1,封三)。

表2 2組大鼠術后4周時ZOL致DMM誘導的OA膝關節軟骨下骨變化的μCT檢測結果比較

表3 3組大鼠術后8周時ZOL致DMM誘導的OA膝關節軟骨下骨變化的μCT檢測結果比較

2.2 ZOL抑制DMM誘導的OA大鼠膝關節軟骨的退變:軟骨退變發生在術后2～12周，并呈時間的依賴性。番紅O-固綠染色顯示，術后2周與Sham+PBS組相比，DMM+PBS組的軟骨基質和細胞的降解主要發生在軟骨淺層。隨著OA進展，這些變化進一步延伸到深層，并在4周時產生不規則的裂縫；8周時累及關節全層，潮線復制，這些變化在12周時變得更加明顯(圖2，封三)；DMM+ZOL組軟骨退變程度減輕，進程延緩。術后各時間點OARSI評分顯示，與Sham+PBS組相比，DMM+PBS組與DMM+ZOL組均增加(P<0.05)；與DMM+PBS組相比，DMM+ZOL組均減低(P<0.05)，見表4。

表4 3組大鼠OARSI評分比較(分，

2.3 ZOL抑制DMM誘導的OA大鼠膝關節軟骨下骨中早期破骨細胞的形成:TRAP染色顯示，與Sham+PBS組相比，DMM+PBS組在術后4周軟骨下骨中有更多的TRAP+的破骨細胞，而ZOL顯著抑制破骨細胞的形成(圖3，封三)。這一結果與μCT一致，支持ZOL抑制DMM誘導的OA早期破骨細胞活化造成的骨量減少，見表5。

表5 TRAP染色檢測ZOL抑制DMM誘導的OA大鼠膝關節軟骨下骨中破骨細胞形成情況比較

2.4 ZOL抑制膝關節軟骨下骨中Wnt5a和破骨細胞生成相關基因的表達:為了從分子水平進一步闡明OA早期破骨細胞異?；罨臋C制，用免疫組化檢測Wnt5a、RANKL的表達，用RT-qPCR檢測軟骨下骨中Wnt5a、RANKL、CXCL12、活化T細胞核因子1(NFATc1)、OPG、TRAP和組織蛋白酶K(CTSK)的表達。免疫組織化學染色顯示，與Sham+PBS組比較，DMM+PBS組中Wnt5a和RANKL的陽性細胞明顯增多(P<0.05)；與DMM+PBS組比較，DMM+ZOL組中Wnt5a和RANKL的陽性細胞明顯減少(P<0.05)。軟骨下骨的RT-qPCR結果顯示，ZOL抑制了DMM誘導的Wnt5a和破骨細胞生成基因的表達(P<0.05)，見表6。

表6 免疫組化染色檢測ZOL降低DMM誘導的OA大鼠膝關節軟骨下骨中Wnt5a、RANKL陽性率比較

3 討論

本研究旨在探索ZOL對OA進展的影響及可能的分子機制，結果證實DMM可誘導SD大鼠形成OA，使膝關節OARSI評分增高。在OA早期，軟骨下骨異常與骨重塑表現為破骨細胞介導的骨吸收增強，骨量減少，Micro-CT和TRAP染色的結果均證實了這一點。ZOL可通過抑制OA早期破骨細胞的活性，減弱骨吸收，從而延緩OA的病程，減輕軟骨的退變。本研究結果顯示，破骨細胞的異?；罨赡芘cWnt5a信號通路相關。

OA是一種慢性、進行性、退變性疾病，病理表現以軟骨下異常骨重塑和關節軟骨退變為特點。OA的分期和嚴重程度可以用OARSI評分來量化，這是OA軟骨組織病理學評估的一種標準方法[8]。與其他評分方法相比，OARSI評分可以揭示OA的早期病理改變，為基礎研究以及臨床診斷和治療提供指導。既往的研究顯示，在前交叉韌帶離斷術(ACLT)所致 的OA模型中，術后1～2周即可發現骨小梁的丟失和軟骨的退變[9]。本研究結果顯示，在OA誘導后4周只有輕微的軟骨退化，這種差異性可能是因為我們使用DMM法誘導了SD大鼠的OA模型所致。相較于ACLT，DMM是一種微創的方法，可以避免嚴重創傷、急性炎癥或免疫應激對OA造成的干擾，更好地模擬退變性OA的慢性、進行性的特點[10]。

OA是一種全關節疾病，關節軟骨和軟骨下骨形成一個結構和功能單位，共同參與OA的病理進程[11]。動物實驗和臨床研究均證實，在OA早期軟骨下骨中存在骨囊腫，這是針對異常骨重塑的適應性改變，這種改變與破骨細胞的活化相關[12]。本研究結果也發現，通過DMM誘導OA 4周后，軟骨下骨中破骨細胞數量增加，骨吸收增強，骨量減少。ZOL對骨質疏松癥的療效已在臨床得到證實，因此我們將ZOL在DMM誘導的SD大鼠OA早期予以干預，發現骨吸收被ZOL抑制，而且μCT、OARSI評分和TRAP染色均證實ZOL可減輕OA早期軟骨下骨中的異常骨吸收，減輕并延緩關節軟骨的退變，這或許是改善OA的一種治療策略。

最新的研究證實Wnt/β-catenin信號通路參與了OA晚期的異常骨形成[13]。MAEDA等研究發現Wnt5a缺陷的小鼠表現為骨吸收功能障礙[5]。與此相反的研究發現，Wnt5a通過上調Lrp5/6的表達，啟動Wnt/β-catenin信號通路從而促進成骨分化而抑制成脂分化[4]。Wnt5a在一些腫瘤疾病中也表現出雙重調節作用[3]。因此，我們推測在不同的微環境中，來源于不同細胞的Wnt5a結合差異性受體后形成不同復合物，從而激活下游的轉錄因子發揮相應的調節作用，調節破骨細胞的形成和骨吸收功能。破骨細胞來源于造血干細胞中的單核-巨噬細胞系，通過分泌酸性蛋白酶類分解骨基質，實現骨吸收。破骨細胞的形成和活化與微環境中的細胞因子有關，包括RANKL、OPG、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)和破骨細胞分化因子[14]。RANKL/RANK/OPG軸在破骨細胞形成過程中起著重要的調控作用。來自成骨細胞和骨髓間充質干細胞(BMSCs)的RANKL與破骨前體細胞表面的RANK結合，隨后激活一系列轉錄因子，包括NF-κB、激活蛋白1(AP1)、NFATc1和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)相關的生物分子。這些下游因子的激活啟動了與破骨細胞分化和骨吸收功能相關的基因轉錄，包括TRAP、CTSK、降鈣素受體(CTR)和MMP-9，最終形成成熟的多核破骨細胞[15]。OPG可以作為誘餌受體取代RANK并與RANKL結合，從而抑制成熟破骨細胞的形成和骨吸收。C-X-C趨化因子配體12(CXCL12)主要來源于BMSCs，可與破骨細胞前體表面的C-X-C趨化因子受體4(CXCR4)結合，促進細胞向骨吸收位點遷移[16]。這些與各自信號通路相關的生物分子，可能是調控破骨細胞形成和功能的潛在靶點。本研究結果顯示，DMM可上調OA早期Wnt5a的表達，協同增加RANKL的蛋白水平和破骨細胞形成相關的基因表達水平，包括TRAP和CTSK，而ZOL可以抑制這種效應。這可能是由于ZOL抑制破骨細胞誘導的骨吸收，改變了軟骨下骨中的酸性微環境，間接抑制了RANKL的表達和Wnt5a介導的破骨細胞形成基因。

本研究中仍存在一些局限性。首先，本研究設置了四個時間點觀察OA早期軟骨下骨量的丟失和晚期OA的進展，盡管如此，仍可能錯過OA進展相關的關鍵事件。其次，由于技術限制沒有追蹤同一個樣本的發展變化，如對活體樣本進行μCT檢測，這也可以節約研究的樣本量。第三，缺少針對軟骨下骨中與骨吸收相關的特定效應細胞的深入研究，包括細胞水平和Wnt5a信號分子水平，還需要今后進一步完善此項工作。