蜚蠊提取液改善陰道微生態及治療宮頸持續性高危型人乳頭瘤病毒感染的研究

林 艷， 王福菊， 胡佳貞， 許 嵐， 張 鑫， 張忻佩， 趙蘊芝， 樊伯珍

(1. 上海中醫藥大學附屬普陀醫院婦產科，上海 200062； 2. 海軍軍醫大學第二附屬醫院生殖醫學中心，上海 200003)

高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillo-mavirus， HR-HPV)是一組古老的微小無包膜病毒，HR-HPV的持續感染是導致組織癌變的必要因素[1]。宮頸位于陰道微生態環境中，陰道作為抵御病原體入侵及防止下生殖道感染的重要防線，其微生態的平衡狀態是防止HR-HPV感染乃至宮頸發生病變的重要條件[2]。對于宮頸持續性HR-HPV感染，西醫以祛除受染病灶及輔助免疫治療為主。干擾素雖為臨床常用藥物，但其轉陰率并不能讓人滿意。中醫將HR-HPV感染導致的宮頸相關癥狀歸屬于“帶下病”，局部多表現為濕熱阻滯之象。蜚蠊為血肉有情之品，在清熱利濕、調暢局部氣血方面效果尤為突出，且相關藥理學研究表明，蜚蠊尚有抗病毒、調節菌群及免疫應答，甚至抗癌之功。本研究在干擾素陰道納入用藥的基礎上加以蜚蠊提取液陰道沖洗對宮頸持續性HR-HPV感染患者進行治療，觀察分析兩組患者用藥的治療效果、用藥前后陰道微生態指標及宮頸局部細胞免疫功能的變化情況，試圖探討蜚蠊提取液的療效及作用的可能途徑，為臨床中西醫結合治療宮頸持續性HR-HPV感染提供用藥依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2021年5月—2022年2月在上海中醫藥大學附屬普陀醫院宮頸?？崎T診就診的宮頸持續性HR-HPV感染患者80例，按1∶1的比例隨機分配為研究組和對照組，其中研究組1例復診時因拒絕復查HR-HPV并只要求繼續用藥而剔除，對照組1例因離滬失訪，最終共78例完成臨床治療及治療后隨訪。兩組患者在年齡、絕經情況、順產次數及宮頸病變程度方面差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 研究組和對照組一般資料比較

1.2 納入及排除標準

1.3 治療方法

對照組： 患者在月經凈后第3天起開始用藥，睡前將重組人干擾素α-2b陰道泡騰膠囊(辛復寧： 800 000 IU/粒，上海華新生物高技術有限公司，S20050075)放置在陰道后穹隆，每晚1次，每次1粒，連續使用10 d為1個療程，下一個月經周期同法使用，對于絕經患者于每個月固定同一時間用藥，共3個療程。研究組： 受試者干擾素使用方法同對照組，于第11天開始單獨使用蜚蠊提取液(100 mL/瓶，四川好醫生攀西藥業有限責任公司，Z51021834)，每次25 mL，加入75 mL生理鹽水混勻后進行陰道沖洗，每晚1次，連續使用10 d，兩藥序貫使用20 d為1個療程(序貫療法： 按順序連續治療。此處特指辛復寧先使用10 d后，立即進行蜚蠊提取液10 d治療。)，下一周期同法使用，共3個療程。研究獲上海市普陀區中心醫院倫理委員會同意(倫理審查批件號為PTEC-A-2021-53-1)。

1.4 觀察指標及獲取數據方法

分別在治療前后對觀察指標宮頸感染HR-HPV陽性數、陰道微生態各評價指標、宮頸局部細胞免疫水平進行統計及測定，治療前標本收集： 在月經凈后3～7 d間或絕經患者就診時取樣，治療后標本收集： 在3療程結束后第一次行經凈后3～7 d間或絕經患者用藥后1周取樣，取樣前3 d內應避免性生活、陰道灌洗和(或)陰道用藥。

1.4.1 樣本HR-HPV DNA載量測定采用美國FDA批準的第二代基因雜交捕獲法(HCⅡ)檢測，載量≥1.0 pg/mL視為HR-HPV陽性。

1.4.3 宮頸局部細胞免疫功能測定 患者取截石位，采集者將窺陰器輕柔置于陰道，擴張以充分暴露宮頸。先取1支棉拭子清除宮頸口分泌物后，再用一次性采樣拭子輕柔插入宮頸口，朝同一方向旋轉5圈后停留片刻，而后將其緩慢取出。將采樣拭子加入4 mL無菌生理鹽水中混勻后4 ℃下離心(離心半徑10 cm，1 000 r/min，5 min)，分離上清液，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)對CD4+T、CD8+T、TNF-α、IL-4及IL-6載量進行檢測，試劑盒由上海研聆生物科技有限公司提供，操作參照說明書進行。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 治療后宮頸HR-HPV轉陰率

研究組宮頸感染HR-HPV轉陰率為61.54%(轉陰24例)，對照組轉陰率為33.33%(轉陰13例)，研究組轉陰率高于對照組，差異具有統計學意義(χ2=6.221，P=0.013)。

2.2 陰道微生態評價指標

分別對治療前后兩組顯微鏡下及干化學指標進行評價，內容主要包括陰道微生態失衡、LBG異常、加德納菌/擬桿菌、形似動彎桿菌、革蘭陰性短桿菌、革蘭陽性球菌、pH值異常、H2O2陽性、LE陽性、SNA陽性、BV、AV檢出情況。

2.2.1 顯微鏡下比較 兩組治療前比較，陰道微生態失衡、LBG異常、加德納菌/擬桿菌、形似動彎桿菌、革蘭陰性短桿菌、革蘭陽性球菌、BV、AV檢出情況差異無統計學意義(P>0.05)；研究組治療前后比較，陰道微生態失衡(χ2=6.642，P=0.010)、LBG異常(χ2=6.271，P=0.012)、革蘭陰性短桿菌(χ2=7.508，P=0.006)、革蘭陽性球菌(χ2=8.419，P=0.004)及AV檢出(χ2=4.255，P=0.039)等方面治療后明顯改善，與治療前存在顯著性差異；對照組治療前后比較以上指標差異均無統計學意義(P>0.05)。研究組與對照組治療后比較，研究組微生態失衡情況的改善明顯優于對照組(χ2=4.446，P=0.035)，見表2。

表2 研究組和對照組陰道微生態顯微鏡下比較

2.2.2 干化學比較 兩組治療前比較，在pH值異常、H2O2陽性、LE陽性、SNA陽性方面差異均無統計學意義(P>0.05)。兩組治療后，以上指標差異仍無統計學意義(P>0.05)。研究組治療前后比較，pH值異常(χ2=4.198，P=0.040)、H2O2陽性(χ2=5.769，P=0.016)治療后明顯改善(P<0.05)；對照組治療前后比較僅pH值異常有改善(χ2=7.429，P=0.006)，見表3。

表3 研究組和對照組陰道微生態干化學比較

2.3 宮頸局部細胞免疫

兩組治療前比較，在CD4+T、CD8+T、CD4/CD8、TNF-α、IL-4及IL-6方面差異均無統計學意義(P>0.05)；兩組治療后，研究組比對照組在CD4(t=-4.741，P<0.001)、CD8(t=-4.725，P<0.001)、CD4/CD8比值(Z=-5.022，P<0.001)、TNF-α(t=-4.912，P<0.001)、IL-4(t=-2.162，P=0.034)方面差異均有統計學意義(P<0.05)；研究組治療前后比較，CD4(t=-8.874，P<0.001)、CD8(t=7.246，P<0.001)、CD4/CD8比值(Z=-5.261，P<0.001)、TNF-α(t=11.213，P<0.001)、IL-4(t=4.945，P<0.001)及IL-6(t=2.533，P=0.016)方面差異均有統計學意義(P<0.05)；對照組治療前后比較，CD4(t=-4.11，P<0.001)、CD4/CD8比值(Z=2.679，P=0.007)、TNF-α(t=-4.885，P<0.001)方面差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 研究組和對照組宮頸局部細胞免疫功能比較

3 討 論

宮頸在中醫中被稱作“子門”，是連接陰道和子宮的通道，對于通暢上下氣血、阻礙病邪入侵具有重要意義。根據臨床研究統計[4]，宮頸HR-HPV持續感染者的體質以濕熱質最甚，并極大比例表現為濕熱內蘊證候。HR-HPV對宮頸的持續感染實際上為濕熱瘀阻子門的一種特殊狀態。宮頸HR-HPV的持續感染目前已被證實與宮頸癌的發生有直接聯系[5]。因此，預防及治療宮頸HR-HPV的持續感染對防止宮頸癌的發生意義重大。目前對HR-HPV感染的預防臨床已有疫苗可以使用，但仍不能覆蓋所有高危型HPV，且普及尚有時日。而西醫治療包括免疫、藥物及局部手術，免疫治療雖是目前抗病毒的重點[6]，但無論是治療性疫苗還是免疫佐劑，其研發應用仍有待漫長的時日，現有的抗病毒藥物的治療作用有限，局部消融及手術僅能做到對受染組織的部分祛除，而對于散在分布的游離病毒卻束手無策。干擾素作為人體內重要的細胞因子，可通過調節機體免疫功能以發揮抗病毒及抑制細胞異常增殖的作用，是目前用于宮頸HR-HPV持續感染的局部治療的主要藥物，但治療后HR-HPV的轉陰率較低，故干擾素在臨床常作為基礎用藥使用，并輔以其他藥物或物理治療以提高對病毒的清除效果[7]。本研究在對宮頸HR-HPV持續感染患者采用干擾素納陰的基礎上加以蜚蠊提取液陰道沖洗，經3個療程治療后，較單用干擾素的對照組病毒轉陰率明顯提高(61.54%vs33.33%)，提示兩者的協同或蜚蠊提取液增強了干擾素對持續性HR-HPV感染的治療作用。蜚蠊提取液以蟲類中藥蜚蠊為主要成分，是清利濕熱，活血解毒之品?！渡褶r本草經》載蜚蠊：“主血瘀，癥堅，寒熱。破積聚，喉咽閉，內寒無子?！币蚱錇檠?，故尤適用于女性。在宮頸HR-HPV持續感染早期，患者多以帶下黃稠等局部濕熱證候為主，而尚未見明顯的全身證候。蜚蠊性味咸寒，有清利、活血之功，又因其生于陰濕之地，故可主帶下病之寒熱，恰適用于宮頸HR-HPV的早期感染。目前，蜚蠊提取液因其良好的創面修復作用[8]而廣泛應用于臨床，這種對黏膜的修復作用可預防HR-HPV經受損陰道黏膜入侵基底層上皮細胞，從而阻斷感染的發生。此外，蜚蠊提取液尚被報道具有抗菌、抗病毒、免疫調節甚至抗癌之效能[9]。過去已有將蜚蠊提取液用于抗宮頸HR-HPV感染的隨機對照研究[10-11]，并顯示出較好的HR-HPV轉陰效果，但其觀察指標多集中于療效及全身免疫功能的觀察，卻較少對陰道微生態改善情況及宮頸局部細胞免疫功能做出相關分析。

在本研究中，研究組的病毒轉陰率與陰道微生態平衡的恢復同步提升，提示蜚蠊提取液可能通過其清利濕熱，活血解毒之功效，促進陰道微生態的功能修復，同時提示陰道微生態失衡與HR-HPV持續感染的高度相關性。陰道微生態由陰道菌群、局部免疫、內分泌及解剖結構四部分組成，其中又以菌群結構及免疫功能表現出較大的可變性。乳桿菌作為正常陰道中的主要優勢菌種，其數量與HR-HPV載量[12]及宮頸上皮內病變進展[13]呈負相關。Antonio等[14]通過比較不同乳桿菌的H2O2分泌能力發現，分泌H2O2能力強的加氏乳桿菌所主導的菌群結構具有更快的病毒清除率，提示了HPV感染風險的增加與H2O2分泌不足存在關聯。本組資料中，干擾素加用蜚蠊提取液治療后，隨著HR-HPV的被清除，陰道內H2O2陽性數明顯低于治療前，也佐證了這一觀點。另一方面，在正常的內分泌環境下，乳桿菌分解細胞內糖原產生乳酸，通過降低局部pH值以維持正常陰道酸性環境。若乳桿菌的質量下降，或是優勢菌的地位受到動搖，則將導致陰道菌群紊亂并由此引發一系列炎癥反應。根據現有研究報道，HR-HPV感染者以BV及AV為最常見的菌群失調狀態，同時也是乳桿菌質量下降的另一種表現形式[15]。近期有研究顯示，AV的發生或許較BV在宮頸上皮內瘤變及宮頸癌的進展中更為重要[16]。本研究中，HR-HPV感染者擁有很高的陰道微生態失衡率(76.92%，84.61%)，其中LBG為Ⅱb或Ⅲ級者達半數以上(58.97%，56.41%)，pH異常占61.54%及66.67%，提示了極其糟糕的陰道乳桿菌結構及功能。且在治療前患者陰道中革蘭陰性短桿菌擁有很高的檢出率(71.79%，66.67%)，AV感染接近半數(53.85%，48.72%)，表現出明顯的需氧菌傾向，提示了其可能為宮頸HR-HPV持續感染的有利條件，也為臨床精準治療提供了依據。王璐等[17]使用陰道乳桿菌制劑聯合干擾素治療宮頸HR-HPV感染，結果不僅出現陰道微生態失衡狀態的好轉，且其病毒轉陰率也遠高于單用干擾素組，提示通過恢復以乳桿菌為優勢菌的陰道微生態環境對HR-HPV清除的可行性。一項針對HR-HPV感染的薈萃分析顯示，局部應用乳桿菌制劑或將是一種可行的促進HPV清除的介入性方法[18]。研究組在使用蜚蠊提取液與干擾素治療后，這類指標較單用干擾素治療得到明顯改善，不排除蜚蠊提取液清利濕熱，活血解毒的藥物特性，通過改善陰道內正常優勢乳桿菌的菌群結構及功能而發揮作用的可能性，但由于研究樣本數及觀察時間的不足，對其確切發揮作用的途徑尚難明確。

宮頸與陰道本為一體，因處于同一微生態環境中，故宮頸局部免疫雖與陰道免疫相區別但又存在極大的相似性，皆與陰道菌群存在相互關聯。以T淋巴細胞為主導的細胞免疫是宮頸局部免疫的重要組成部分，主要分為CD4+T細胞及CD8+T細胞兩大類。CD4/CD8平衡的保持對抑制宮頸腫瘤發生具有重要意義，研究顯示[19]，CD4+T細胞減少及CD4/CD8比值的下降常預示著宮頸病變進展甚至癌變等不良結局。CD8+T細胞主要介導細胞毒性作用；而CD4+T細胞通過分化為輔助T(Th)細胞1、Th2及調節性T(Treg)細胞進一步調節免疫應答。Th1/Th2作為衡量免疫功能的又一對重要指標[20]，二者的分子程序具有相互對立性，其平衡的偏移意味著機體免疫功能的紊亂。其中Th1細胞可通過分泌IL-2、IFN-γ等多種細胞因子以增強細胞免疫功能。IL-4作為Th2分泌的重要免疫因子，對正常的免疫應答具有阻斷作用；TNF-α可介導嗜酸性細胞釋放炎癥介質，IL-6則進一步趨化中性粒細胞，使得局部炎癥損傷程度進一步加重。也有研究顯示陰道菌群可與宮頸局部免疫功能相互作用，保護宿主免受病毒感染，從而減少宮頸癌的發生[21]。本研究結果顯示，研究組CD4+T細胞、CD4/CD8較前明顯上升，CD8+T細胞、TNF-α、IL-4、IL-6則明顯下降，而對照組僅在CD4+T細胞、CD4/CD8及TNF-α方面較治療前有所改善。兩組比較，研究組免疫調節作用顯著優于對照組，且陰道微生態環境得到明顯改善，提示了蜚蠊提取液對宮頸細胞免疫功能的改善作用，這種宮頸免疫應答的修復有助于對持續性HR-HPV感染的清除，這或許是蜚蠊提取液其發揮抗病毒作用的重要機制。

綜上所述，宮頸持續性HR-HPV感染者多伴隨明顯的陰道微生態失衡，主要表現為乳桿菌質與量的下降及由此引發的陰道微生態指標異常及宮頸細胞免疫功能紊亂。蜚蠊提取液以其清利濕熱，活血解毒功效，與干擾素聯用可顯著提高對宮頸持續性HR-HPV感染的清除效果，同時較好地改善了陰道菌群紊亂狀態及宮頸局部細胞免疫功能，促進了宮頸陰道微生態的恢復。但由于臨床觀察時間較短，藥物的遠期療效還需要進一步隨訪，以及實驗室條件限制，沒對HR-HPV做詳細分型治療效果分析。也由于受到倫理的限制，本研究未能單獨使用蜚蠊提取液對宮頸持續性HR-HPV感染治療做出相應指標的觀察，有待后續進一步研究。