地塞米松對膠原誘導性關節炎大鼠模型軟骨退化的改善作用

許冰馨,范凱健,2,王婷玉,陳慧瑾

(1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院藥劑科,上海 200011;2.上海市崇明區精神衛生中心藥劑科,上海 202150)

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）的致病因素尚不明確，可能與遺傳、免疫、環境有關［1］。RA的主要特征是滑膜炎和軟骨破壞。軟骨組織由基質、纖維、軟骨細胞構成，兼具硬度和彈性，在承重和防止骨骼磨損中發揮著重要作用。由于軟骨中不含血管和神經，一旦受損，后期修復能力較差［2］?，F階段，臨床上用于軟骨保護的藥物有生物制劑、抗風濕藥物、軟骨營養補充劑等［3-4］。這些營養補充劑含有如氨基葡萄糖、硫酸軟骨素等物質，可以對關節軟骨起到營養、潤滑作用。中醫的熱敷、針灸等理療方式也可以促進血液循環，從而改善軟骨修復。由于目前骨保護藥物和中醫理療對軟骨的作用仍存在局限性，因此抑制軟骨損傷機制的研究及相關藥物的開發對控制疾病發展具有重要意義。

地塞米松（dexamethasone，DEX）是一類長效且強效的糖皮質激素，具有抗炎和解熱鎮痛作用。臨床上常結合抗風濕藥、生物制劑等用于治療RA。Yu等［5］研究發現，局部注射DEX可以顯著緩解關節腫痛。Formica等［6］研究發現，將DEX與Ⅱ型膠原親和性復合物或殼聚糖結合，可提高DEX在軟骨中的滲透性，延長其保留時間，從而抑制炎癥標志物表達，并提高糖胺聚糖水平。臨床上小劑量DEX注射關節腔用于治療RA是安全有效的。有研究發現，關節內注射糖皮質激素可以減少藥物引起的全身性不良反應［7］。雖然中低劑量的激素常被作為RA的維持治療藥物，但大劑量長期使用激素也會造成嚴重不良反應。因此，選擇給予適當劑量的DEX治療可以起到保護軟骨和延緩疾病進展的作用。本課題組前期通過腹腔注射1 mg/kg DEX制劑，研究DEX對膠原誘導性關節炎（collageninduced arthritis，CIA）疼痛和炎癥的作用機制［8-9］。在此基礎上，本研究繼續驗證腹腔注射1 mg/kg DEX對軟骨的影響，并探討其保護軟骨的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠30只，6周齡，體質量為（160±20）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司［SCXK（滬）2018-0016］。飼養于上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物中心［SYXK（滬）2020-0025］，環境溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%，光照為12 h晝夜各半。實驗經本院實驗動物倫理委員會審核批準（HKDL［2015］16）。

1.2 試劑

牛Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑（美國Chondrex公司）、DEX（加拿大Stemcell公司）、TRIzol（美國Ambion公司）、PCR引物（上海生工生物科技有限公司）、SYBR Green qPCR預混液（日本TaKaRa公司）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADMATS）的一抗（美國Cell Signaling Technology公司）、4%多聚甲醛溶液、乙二胺四乙酸（EDTA）、阿爾新藍染色液（武漢谷歌生物科技有限公司）、戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）。

1.3 儀器

熒光定量PCR儀（美國Thermo Scientific公司），ProFlex PCR熱循環儀（美國Thermo Fisher公司）；Microfuge 20R離心機（德國Beckman公司）、顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 實驗分組及CIA造模方法

30只大鼠適應性喂養1周后，隨機均分成正常組、模型組和DEX組，每組10只。4℃冰浴條件下，將牛Ⅱ型膠原與弗氏不完全佐劑1:1充分混勻形成白色乳劑。將實驗當天即第一次免疫造模時間定義為第0天，將0.1 mL白色乳劑注射于模型組和給藥組大鼠尾根部皮內，正常組大鼠尾根部皮內僅注射0.1 mL生理鹽水（即0.9%NaCl溶液）。在第一次免疫后的第7天，再次制備相同乳劑，采用相同方法對模型組和DEX組進行加強免疫，正常組大鼠尾根部皮內僅注射0.1 mL生理鹽水，此時即完成造模［10-11］。

1.5 給藥方式與劑量

給藥組大鼠在加強造模免疫后第1天（即第一次免疫造模后第8天）開始給予DEX腹腔注射，劑量為1 mg/kg［12］。給藥頻次為隔日給藥，連續4周。其余動物給予等體積的生理鹽水腹腔注射。

1.6 取材

給藥完成后，采用戊巴比妥鈉（45 mg/kg）對大鼠進行腹腔注射麻醉，待徹底麻醉后經腹主動脈取血，處死大鼠。然后沿股骨頭分離大鼠后肢，用顯微剪刀輕輕將股骨頭上半透明狀的軟骨剝離，保存于-80℃，用于實時定量PCR檢測。剝離大鼠后肢上多余的肌肉組織并暴露出膝關節，將膝關節浸沒在多聚甲醛溶液中固定過夜，用于后期制備石蠟切片，以及分別進行阿爾新藍染色和免疫組織化學實驗。

1.7 膝關節脫鈣并制作石蠟切片

將大鼠膝關節浸沒在EDTA脫鈣液中，隔日更換一次脫鈣液。4℃搖床上脫鈣30 d以上。采用針刺法檢測脫鈣程度，即注射器針頭可無障礙穿透骨頭才表示脫鈣成功。脫鈣后的樣本，經脫水、軟石蠟34 h、硬石蠟0.5 h的浸蠟后，置于熔融態的石蠟包埋框中完成石蠟包埋，冷卻凝固后制作成4 μm厚的膝關節矢狀面石蠟切片。

1.8 阿爾新藍染色

大鼠膝關節病理切片經過脫蠟后，進行阿爾新藍染色、漂洗、脫水、中性樹膠封固。顯微鏡下觀察膝關節軟骨破壞情況，運用Image J 1.8.0軟件計算各組大鼠膝關節的軟骨面積、厚度、軟骨細胞數，并分析膝關節損壞嚴重程度。

1.9 實時定量PCR檢測軟骨中蛋白酶轉錄水平

實驗前取出保存于-80℃的軟骨，置于研缽中，倒入液氮并將其研碎。TRIzol法提取總RNA，在PCR儀上轉成cDNA。實時定量PCR法檢測各組軟骨組織中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表達水平。實時定量PCR程序如下：95℃變性、退火至60℃，經過40個循環后，65℃延伸5 s。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.10 免疫組織化學

將用于免疫組織化學檢測的大鼠膝關節切片經脫蠟水化后，首先進行抗原修復，過氧化氫阻斷過氧化物酶，血清封閉，然后進行一抗孵育、二抗孵育，DAB顯色。蘇木精對比染色細胞核、沖洗、干燥、封固后，顯微鏡下觀察。

1.11 統計學分析

采用統計學分析軟件SPSS 22.0進行結果分析，數據采用平均數±標準誤（-x±s-x）表示。組間數據差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DEX對大鼠膝關節軟骨病理的影響

阿爾新藍染色結果如圖1所示。與正常組相比，CIA大鼠膝關節中軟骨厚度和面積減少（P＜0.001），軟骨細胞數量（P＜0.001）和表面光滑度下降，軟骨侵蝕嚴重。

圖1 地塞米松對膠原誘導性關節炎大鼠膝關節軟骨退化的抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of dexamethasone on degeneration of knee articular cartilage in collagen-induced arthritis rats

經過DEX治療后，軟骨面積、厚度和細胞數量下降程度得到明顯抑制，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；而且軟骨表面較光滑，軟骨侵蝕程度也得到明顯改善。結果說明DEX治療可以一定程度上抑制CIA大鼠膝關節軟骨破壞。

2.2 DEX對軟骨中基質蛋白酶mRNA表達的影響

實時定量PCR結果（圖2）顯示，CIA大鼠軟骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5mRNA的表達水平明顯較正常組升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；而DEX治療后，這些基質蛋白酶的表達量均較模型組出現不同程度的下降，差異有統計學意義（P＜0.001）。結果表明DEX治療可以減少CIA軟骨組織中這些基質蛋白酶的mRNA表達。

圖2 實時定量PCR檢測地塞米松對膠原誘導性關節炎大鼠膝關節軟骨組織中基質蛋白酶mRNA轉錄的抑制作用Figure 2 Inhibitory effect of dexamethasone on matrix metalloproteinases transcription in the knee cartilage tissue of collagen-induced arthritis rats detected by real-time quantitative PCR

2.3 DEX對軟骨中相關酶ADAMTS-5、MMP-9、MMP-13蛋白表達的影響

前期研究顯示，相較于正常組大鼠，CIA大鼠軟骨中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5的含量明顯升高［13］。因此，本研究側重檢測這3種蛋白在模型組和DEX組的表達變化。免疫組織化學檢測結果（圖3）顯示，模型組大鼠膝關節軟骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5表達較明顯；給藥后DEX組中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5水平較CIA模型大鼠明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 免疫組織化學法檢測地塞米松對膠原誘導性關節炎大鼠膝關節軟骨中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5蛋白表達的抑制作用Figure 3 Inhibitory effect of dexamethasone on MMP-9,MMP-13 and ADAMTS-5 expression in the knee cartilage of collagen-induced arthritis rats detected by immunohistochemistry

3 討論

軟骨和骨破壞的現象常見于類風濕關節炎，但軟骨破壞的進程是不可逆的，所以防止軟骨損傷對于RA患者關節功能的保護具有重要意義。關節軟骨屬于纖維軟骨，質地較堅韌，具有吸收運動產生的震動、減少摩擦和維持關節穩定性的作用。它由軟骨細胞、細胞間質組成。而細胞間質則是由骨膠原纖維、蛋白多糖和水組成。細胞間質的降解造成了軟骨損傷?，F有研究證明，MMPs和ADAMTS在RA患者血液和滑膜中大量存在，有助于軟骨的分解代謝，在軟骨損傷修復中具有重要作用［14］。

MMPs是蛋白水解酶的主要成員，其活性位點需要鋅離子才能發揮作用。MMPs對于維持組織結構的穩定性至關重要。它在pH中性環境下具有活性，可以催化細胞外基質（extracellular matrix，ECM）大分子（如間質和基底膜膠原蛋白）、蛋白聚糖（如聚集蛋白聚糖和纖維調節蛋白）以及輔助ECM蛋白（如纖連蛋白）降解。大多數MMPs都是以無活性的酶原形式存在，但其在病理狀態下會被激活，與之對應的金屬蛋白酶組 織 抑 制 劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP）可調節其活性［15］。MMPs水平在RA患者的軟骨中顯著升高，且內源性TIMP的減少可促進軟骨基質合成代謝紊亂，破壞ECM蛋白，并直接促進軟骨細胞凋亡和血管再生。多項研究發現，MMP-9和MMP-13可以導致軟骨基質損傷［16］。MMP-9在RA中表達量增加，并能降解關節的非膠原基質成分。而MMP-13除膠原蛋白外，還降解蛋白聚糖分子和聚集蛋白聚糖，在基質破壞中具有雙重作用［17］。Zhang等［18］研究發現，MMPs的下調有利于小鼠半月板損傷的改善，并提升關節軟骨的修復能力。

ADAMTS也可以水解軟骨基質中的蛋白多糖，破壞軟骨細胞，并阻止軟骨內骨形成，而抑制其活性對于緩解軟骨退行性病變和促進軟骨修復是有利的［16］。ADAMTS-4和ADAMTS-5已被證明在骨關節炎中起重要作用。它們可通過降解聚集蛋白聚糖和軟骨寡聚基質蛋白來減少軟骨細胞和細胞外基質，從而誘發關節炎［19］。目前，ADAMTS已被廣泛作為緩解骨性關節炎藥物研發的靶標，ADAMTS抑制劑和其單克隆抗體也正在積極開發中［20］。

關節中MMPs和ADAMTS的正常表達有助于維持骨穩態。然而，在RA中，促炎細胞因子的刺激會導致MMPs和ADAMTS的表達顯著增加。CIA與RA類似，同樣存在滑膜侵害和軟骨損傷［21］。DEX作為糖皮質激素，抗炎、抗風濕作用強大。本課題組之前的研究已發現，DEX對CIA大鼠滑膜炎癥和疼痛有明顯的抑制作用，且治療效果明顯［8，22］。DEX可以通過減少滑膜中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17等炎癥因子和血清中促炎因子IL-17a，并增加抗炎因子TGF-β1，進而減輕滑膜炎癥。DEX通過抑制大鼠背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）中疼痛相關因子NPY、NGF、BDNF和TRPV1以及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17的表達，抑制大鼠足部關節疼痛。DEX通過抑制CIA大鼠脾臟T淋巴細胞中促炎因子的形成，同時調節大鼠外周血中Th1/Th2和Th17/Treg比值，對CIA大鼠具有整體免疫調節作用。上述實驗結果提示，DEX治療CIA的機制是減輕滑膜炎癥、抑制疼痛相關致痛因子和炎癥因子表達，并調節了整體免疫失衡［8-9］。

本實驗主要研究DEX對CIA大鼠軟骨退化的抑制作用并探討其機制。阿爾新藍染色實驗中發現，CIA大鼠會產生軟骨損傷，模型組大鼠的軟骨厚度、面積、表面光滑度以及軟骨細胞數都較正常組大鼠出現明顯降低，而經過DEX注射治療后軟骨損傷明顯減輕。有研究證明，MMPs和ADAMTS在軟骨損傷修復中具有重要作用［14］。本研究中，腹腔注射DEX（1 mg/kg）治療后CIA大鼠軟骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表達水平均降低，軟骨厚度、面積和細胞數均較模型組大鼠增加。免疫組織化學實驗也進一步發現，給藥組大鼠軟骨中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5表達量均較模型組明顯減少，這與mRNA表達檢測結果相一致。因此，推測DEX可能是通過抑制CIA大鼠軟骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5表達，阻遏軟骨細胞和軟骨面積減少，進而減輕軟骨的損傷。

綜上所述，DEX（1 mg/kg，每周3次，連續4周）腹腔注射治療可以通過抑制CIA大鼠軟骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達起到直接抑制關節軟骨損傷的作用。本實驗尚存在不足之處，例如DEX是經典的糖皮質激素，臨床上常與藥物聯合使用來治療各類免疫紊亂的疾病，而多次的腹腔注射在臨床上容易降低患者依從性。因此，本課題組正在研究DEX的溫敏凝膠緩釋制劑經膝關節局部注射的用藥效果，探索該新型緩釋制劑在膝關節內釋放給藥的療效，而本實驗結果可以提供對照和用藥劑量的參考依據。

[醫學倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有動物實驗均已通過上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物倫理委員會批準（編號為HKDL[2015]16）。所有實驗過程均遵照中國實驗動物相關法律法規條例要求進行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Ethics Committee of Shanghai Ninth People’s Hospital(IACUC No.HKDL[2015]16).All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations in China related to experimental animals,includingAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892-2018),and so on.

[作者貢獻Author Contribution]

許冰馨負責實驗操作和文章寫作；范凱健參與文章修改及實驗指導；王婷玉負責課題制定和實驗設計；陳慧瑾參與實驗設計和文章修改。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。