魚鱗多肽對酪氨酸酶活性的抑制作用

鞠馨瑤，劉攀，吳迪，程述震，徐獻兵，杜明

（大連工業大學食品學院國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

羅非魚原產自非洲，屬于熱帶魚類，其養殖地遍布140余個國家和地區，是全球第二大養殖魚品種。中國羅非魚養殖年產量為162.5萬t，約占世界總年產量的1/4，其中，羅非魚魚鱗年產量約30萬t，魚鱗中的膠原蛋白常作為包裝保鮮劑，用于延長食品保質期[1]。雖然魚鱗中的膠原蛋白能被有效利用，但魚鱗中的其余組分尤其是魚鱗多肽的利用率不高，魚鱗總體利用率僅達20%，造成了極大的資源浪費[2]。

酪氨酸酶是控制黑色素細胞活性的關鍵，它決定了黑色素合成的速率，篩選酪氨酸酶抑制劑可以開發美白、祛斑等產品。對于酪氨酸酶的多肽類抑制劑，目前已知的篩選方法較少，應用較為普遍的是采用超濾-液質聯用技術對具有靶酶親和性的物質進行篩選，或先采用Autodock等軟件將已知結構的物質與酪氨酸酶的活性中心進行分子對接，從中篩選出能夠與酪氨酸酶活性中心有效結合的物質，進行化學合成。對酪氨酸酶的多肽類抑制劑多采用超濾膜進行分離純化，采用反相高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC） 法進行鑒定[3-5]。這些已知方法所制備得到的多肽類組分較復雜，且組分分離不夠徹底。同時這些方法操作均十分復雜繁瑣，不適合產品的大批量制備生產。

本研究選取來源于羅非魚魚磷的多肽粉，對其中能夠成功螯合金屬銅離子的多肽組分進行洗脫分離，得到具有酪氨酸酶抑制活性的多肽組合物。羅非魚魚鱗多肽來源天然，從中篩選到酪氨酸酶抑制劑將會是酶抑制劑領域的重要突破。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚鱗多肽粉：青島益和興食品有限公司（中國青島）；無水硫酸銅、1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚[1-（2-pyridinylazo）-2-naohthalenol，PAN]：上海麥克林生化科技有限公司；胰蛋白酶（酶活≥2 500 U/mg）、熊果苷、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇：天津市大茂化學試劑廠；硫化銨：上海振興試劑廠；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、酪氨酸酶活性檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；C18柱填料：蘇州納微科技股份有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

R502B旋轉蒸發儀：鞏義市予華儀器有限責任公司；SCIENTZ超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；C184463C具砂板閃式層析柱：重慶欣維爾玻璃有限公司；EASY-nanoLC 1200 Q ExactiveTM質譜儀：賽默飛世爾科技公司；Infinite M200多功能酶標儀：帝肯上海貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽溶液的制備

將脫除鹽分的魚鱗多肽粉與水按質量比1∶30混合，并攪拌制成勻漿。隨后，加入胰蛋白酶，在pH7、55℃的條件下酶解4 h[6]，冷卻至室溫后進行抽濾得到濾液。將所得濾液通過0.22 μm有機膜過濾，冷凍干燥得到酶解后的多肽粉末，將其與水按1∶25（g/mL）的料液比配制，得到多肽溶液[7]。

1.3.2 超聲預處理單因素試驗

超聲波的空化現象產生的極大壓力可以使多肽結構發生改變，氮溶系數增大，從而提高多肽與金屬離子的螯合能力[8]。因此，本研究在將魚鱗多肽與金屬銅離子進行螯合前，預先對魚鱗多肽進行超聲處理。

以螯合率為指標，采用單因素試驗比較不同的超聲功率（300、350、400、450、500、550、600、650 W）、超聲溫度（30、35、40、45、50、55、60、65 ℃）和多肽濃度（0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 g/mL）對金屬銅離子螯合率的影響。

1.3.3 多肽與金屬銅離子的螯合

多肽與金屬銅離子的螯合方法參考鄭金熊[9]對多肽鋅螯合物的制備方法，并做相關改進。按多肽粉末與無水硫酸銅質量比6∶1，向超聲預處理后的多肽溶液中加入無水硫酸銅，用3 mol/L的鹽酸和4 mol/L的氫氧化鈉調節溶液pH值至6.5，隨后在50℃水浴鍋中振蕩反應1 h，得到多肽-金屬銅離子螯合溶液。

1.3.4 金屬銅離子螯合率的測定

采用PAN指示劑滴定法測定金屬銅離子螯合率[10]。將多肽-金屬銅離子螯合溶液冷卻至室溫，以轉速5 000 r/min離心5 min，取上清液，加入5倍體積的無水乙醇。再以轉速5 000 r/min離心20 min，收集殘渣，對其進行干燥，干燥后產物即為多肽與金屬銅離子的螯合物。將該螯合物用蒸餾水溶解，定容至100 mL，取25 mL加入2滴～3滴PAN指示劑，采用EDTA進行滴定，待溶液由紫紅色變成淡黃色即為滴定終點，記錄此時滴定所消耗EDTA的體積，記為V1（mL）。采用上述方法對螯合溶液（含螯合物及未螯合的肽、金屬銅離子）直接滴定，此時滴定所消耗EDTA的體積記為V0（mL）。金屬銅離子的螯合率計算公式如下。

1.3.5 柱層析分離純化

稱取50 g經過預處理的C18柱填料，采用濕法裝柱（3 cm×20 cm）。將采用優化工藝制備得到的多肽-金屬銅離子螯合溶液以1.5 mL/min的流速上樣（體積175 mL、濃度5 mg/mL）。上樣完成后，先以3倍柱體積的水洗脫，棄去洗脫液，后采用80%甲醇溶液以1.5 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液[11]。隨后，將上述洗脫后的樣品用EDTA進行洗脫，除去樣品中的金屬銅離子。隨后，將上述經EDTA洗脫后的樣品溶液進行濃縮、凍干，得到具有金屬銅離子螯合能力的多肽粉。

1.3.6 硫化物沉淀法鑒定金屬銅離子

采用硫化銨沉淀法對具有金屬銅離子螯合能力的多肽進行定性分析，判斷金屬銅離子是否被脫除干凈[12]。分別向經柱層析分離純化前后的多肽-金屬銅離子螯合溶液滴加2滴～3滴飽和硫化銨溶液，觀察各溶液顏色變化以及溶液中是否有沉淀生成。

1.3.7 酶活性測定

采用酪氨酸酶活性檢測試劑盒，通過微量法測定不同樣品的酪氨酸酶活性。檢測原理是基于左旋多巴產生的多巴色素在475 nm處有一個特征吸收峰[13]。試驗共分為4組：空白組（只含酪氨酸酶和底物酪氨酸）、陽性對照組（5 mg/mL熊果苷溶液）、未處理多肽組（5 mg/mL未經螯合和純化處理的多肽溶液）和純化處理多肽組（5 mg/mL柱層析分離純化后的多肽溶液）。將各組樣品與試劑盒中的試劑按體積比1∶9混合后，立即測定10 s時475 nm處的吸光度，記為A1。然后迅速放入37℃水浴中反應3 min，迅速取出，測定190 s時的吸光度，記為 A2，計算 ΔA（ΔA=A2－A1）。酪氨酸酶活性計算方法參照酪氨酸酶活性檢測試劑盒說明書，計算公式如下。

式中：V反總為反應總體積，mL；ε為多巴色素的摩爾消光系數，37 000 mol/（L·cm）；d為比色皿光徑，cm；V樣為加入的樣品體積，mL；T為反應時間，min。

根據酪氨酸酶活性進一步計算各組樣品對酪氨酸酶活性的抑制率，計算公式如下。

1.3.8 納噴離子源高效液相色譜-串聯質譜（nanohigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，nano-HPLC-MS/MS）法分析

將具有金屬銅離子螯合能力的多肽樣品進行前處理。首先，將固相萃取柱插入連有真空泵的萃取裝置上，使用1 mL甲醇連續沖洗3次，隨后用3 mL含0.1%甲酸的超純水進行固相萃取柱的活化及平衡。將樣品用0.1%甲酰胺水溶液溶解，使樣品中蛋白質濃度在2 mg/mL～5 mg/mL，將配制好的樣品加入到活化平衡好的SPE柱中，并用1 mL 0.1%FA-H2O沖洗3次脫除鹽分，最后采用含80%甲醇洗脫并收集多肽溶液，氮吹干燥后即得最終樣品。樣品上樣前需用0.22 μm濾頭過濾，由配備在線納噴離子源進行分析[14]。共上樣3 μL樣品（分析柱為Acclaim PepMap C18，75 μm×25 cm），以60 min的梯度分離樣品，柱流量控制在300 nL/min，柱溫40℃，電噴霧電壓2 kV，梯度從2%的B相起始，平衡3 min，在47 min以非線性梯度升高到35%，1 min內升高到100%，維持12 min。質譜參數設置如下。

質譜條件：掃描范圍（m/z）200～1 500；分辨率70 000；最大注入時間60 ms。

高分辨高能量碰撞解離質譜條件：分辨率17 500；最大注入時間50 ms；動態排除時間20 s；肽段卡值為-10lgP≥20[15]。獲得的原始數據采用Data Analysis 4.0（Bruker Daltonic GmbH，Bremen，Germany）進行特征峰識別，并在PEAKS數據庫中搜庫匹配，以鑒定具有金屬銅離子螯合能力的多肽序列。

1.3.9 分子對接研究

利用PDB數據庫對酪氨酸酶的晶體結構進行下載。采用分子對接軟件Discovery Studio 3.1，依據由nano-HPLC-MS/MS分析鑒定結果獲得的序列繪制出各多肽的結構，并進行分析，選擇Docking中的Dock Ligands（CDCOCKER）進行分子對接計算，分析比較酪氨酸酶自身的配體及各個多肽序列與酪氨酸酶活性中心的金屬銅離子對接的-CDOCKER_ENERGY和-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY值，數值越高說明其與金屬銅離子的結合能力越強[16]。

1.4 數據分析

每個試驗重復3次。采用Origin 2017軟件進行制圖。使用SPSS軟件在置信區間內（p＜0.05）進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 超聲預處理單因素試驗

2.1.1 超聲功率對金屬銅離子螯合率的影響

不同超聲功率對金屬銅離子螯合率的影響結果如圖1所示。

從圖1中可以看出，超聲功率對螯合率有較大影響。隨著超聲功率的增加，魚鱗多肽與金屬銅離子的螯合率先下降后上升再下降。在超聲功率為600 W時，金屬銅離子螯合率達到最大值，為36.5%。由此推測600 W是較適宜的超聲功率，此時多肽結構能夠有效舒展，螯合反應結合位點隨之暴露，使得金屬銅離子螯合率升高[17-18]。因此，本研究選擇600 W的超聲功率處理魚鱗多肽。

2.1.2 超聲溫度對金屬銅離子螯合率的影響

不同超聲溫度對金屬銅離子螯合率的影響結果如圖2所示。

由圖2可知，超聲溫度為30℃～55℃時，隨著超聲溫度的升高，魚鱗多肽與金屬銅離子的螯合率先降低后升高。在超聲溫度為55℃時，螯合率達到最大值，為31.7%。繼續升溫，金屬銅離子螯合率反而呈快速下降的趨勢。推測這是由于適當提升溫度可以促進螯合反應[19]。因此，本研究選擇超聲溫度為55℃處理魚鱗多肽。

2.1.3 多肽濃度對金屬銅離子螯合率的影響

不同多肽濃度對金屬銅離子螯合率的影響見圖3。

圖3表明，隨著多肽濃度的增加，金屬銅離子的螯合率先升高后降低。當多肽濃度為0.14 g/mL時，螯合率達到最大值，為34.3%。此后，隨著多肽濃度繼續增加，螯合率呈現下降趨勢。推測這是由于適當提高多肽濃度能夠增大其與金屬銅離子接觸的概率，但濃度過高，多肽分子會發生聚集，暴露出的螯合位點隨之減少，從而使銅離子螯合率下降[20]。因此，選擇0.14 g/mL作為超聲預處理的多肽濃度。

綜上，對羅非魚魚鱗多肽進行超聲預處理的工藝條件選取為多肽濃度0.14 g/mL、超聲功率600 W、超聲溫度55℃。

2.2 硫化物沉淀法鑒定結果

通過觀察試驗現象，純化前（未經EDTA洗脫）的多肽-金屬銅離子螯合溶液呈藍綠色，在滴加飽和硫酸銨溶液后，溶液中有黑褐色沉淀生成。純化后（經過EDTA洗脫）的多肽溶液呈黃色，且在滴加飽和硫酸銨溶液后，溶液中沒有黑褐色沉淀生成。由此證明，經過EDTA洗脫后的多肽中不再含有金屬銅離子，即EDTA可以成功將螯合物中的金屬銅離子脫除，使得最終通過C18柱層析法制備獲得的樣品為具有金屬銅離子螯合能力的純凈魚鱗多肽組分。

2.3 不同樣品對酪氨酸酶活性的影響

不同樣品對酪氨酸酶活性的影響結果如圖4所示。

圖4表明，未處理多肽對酪氨酸酶活性不具有抑制作用，相反，會激發酪氨酸酶的活性。因此，事先對多肽進行柱層析分離純化處理是十分必要的。酪氨酸酶活性測定結果表明，純化處理多肽可以有效抑制酪氨酸酶的活性。當純化后的多肽溶液濃度為5 mg/mL時，其對酪氨酸酶活性的抑制率為60.0%，與相同濃度的熊果苷溶液相比具有顯著性差異，多肽樣品對酪氨酸酶活性的抑制效果更優。

2.4 nano-HPLC-MS/MS鑒定分析

通過nano-HPLC-MS/MS分析，鑒定出魚鱗多肽組分中特征峰在數據庫中能夠得到匹配的多肽序列，結果如表1所示。

表1 特征峰與數據庫匹配的多肽序列Table 1 Characteristic peaks match the polypeptide sequences in database

2.5 分子對接驗證

將表1中鑒定得到的各多肽序列與酪氨酸酶活性中心的金屬銅離子進行對接，篩選出能夠成功與酶活性中心金屬銅離子結合的多肽序列，結果如表2所示。

表2 多肽序列分子對接篩選結果Table 2 Molecular docking screening results of peptide sequences

酪氨酸酶自身配體-CDOCKER_ENERGY值和-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY值分別為10.232和17.379。由表2可知，具有金屬銅離子螯合能力的多肽組分，其-CDOCKER_ENERGY值和-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY值均遠高于酪氨酸酶自身配體。利用Discovery Studio 3.1軟件模擬對接，推測其對酪氨酸酶活性的抑制作用機理是與酶自身配體競爭酶活性中心的金屬銅離子，使得酶活性中心結構被破壞，從而對酶活性產生抑制作用。

3 結論

本研究通過單因素試驗得到多肽的超聲預處理工藝條件，通過柱層析法從魚鱗多肽中分離制備出具有金屬銅離子螯合能力的多肽組分。通過酶活性測定以及分子對接驗證該組分對酪氨酸酶活性的抑制作用，結果表明，當純化后的多肽溶液濃度為5 mg/mL時，對酪氨酸酶活性的抑制率達到60.0%，與相同濃度的陽性對照組熊果苷溶液相比，具有離子螯合能力的多肽組分對酪氨酸酶活性的抑制作用更強?？芍哂薪饘巽~離子螯合能力的魚鱗多肽組分是一種安全有效的酪氨酸酶抑制劑，有望在食品工業中合理使用。